PAF-AH在過敏性紫癜和紫癜性腎炎中的變化及意義

張琦，童文娟，孫建新，康國貴

PAF-AH在過敏性紫癜和紫癜性腎炎中的變化及意義

張琦，童文娟，孫建新，康國貴

目的探討血小板活化因子乙酰水解酶（PAF-AH）血漿活性、基因突變在過敏性紫癜（HSP）和紫癜性腎炎（HSPN）中的變化及意義。方法101例過敏性紫癜患兒分為紫癜性腎炎組（HSPN組）和非紫癜性腎炎組（N-HSPN組），80例健康兒童作為對(duì)照組。應(yīng)用酶水解底物法檢測患兒血漿PAF-AH活性；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）法檢測患兒血漿型PAF-AH基因第9號(hào)外顯子-994位點(diǎn)的基因型，并用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算基因突變頻率和等位基因頻率，根據(jù)PAF-AH基因位點(diǎn)突變與否，將HSP患兒分為突變組和未突變組。結(jié)果HSP患兒血漿PAF-AH活性明顯低于健康對(duì)照兒童（＜0.05），HSPN組患兒血漿PAF-AH活性明顯低于N-HSPN組（＜0.05）；過敏性紫癜組與健康對(duì)照組PAF-AH基因-994位點(diǎn)的突變率分別為4.95%、1.25%，T等位基因頻率分別為2.48%、0.62%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），而HSPN組與N-HSPN組患兒基因突變率分別為12.50%、0，T等位基因頻率分別為6.25%、0，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＜0.05）；基因突變組患兒鏡下血尿、蛋白尿的發(fā)生率高于未突變的患兒（均＜0.05），基因突變組患兒mAlb、TRF異常率高于未突變患兒（均＜0.05），而 1-MG、IgG的異常率兩組無顯著差異（均＞0.05）。結(jié)論HSP患兒血漿PAF-AH活性降低可能參與了HSP、HSPN的發(fā)病過程；其第9外顯子-994位點(diǎn)的基因突變可能參與了過敏性紫癜腎損害的發(fā)生。

紫癜，過敏性；腎炎，紫癜性；血小板活化因子乙酰水解酶；活性；基因突變

過敏性紫癜（HSP）是兒童常見的系統(tǒng)性小血管炎，常累及腎臟，導(dǎo)致紫癜性腎炎（HSPN），直接影響HSP的預(yù)后。HSPN的發(fā)病由多因素導(dǎo)致，而腎內(nèi)外的炎性細(xì)胞因子可能在腎組織的免疫性損傷中發(fā)揮重要作用［1-2］。研究證實(shí)，血小板活化因子乙酰水解酶（PAF-AH）參與了過敏性紫癜的發(fā)病過程，并且PAFAH的血漿濃度與腎臟損害程度密切相關(guān)［3］，但作為一種水解酶，其活性變化能否影響疾病的表現(xiàn)，目前還不明確。本研究對(duì)過敏性紫癜患兒PAF-AH第9號(hào)外顯子-994位點(diǎn)基因型進(jìn)行檢測，探討其血漿活性以及基因突變在疾病中的變化及意義。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象收集2011年3月至

2012年3月在寧波市婦女兒童醫(yī)院住院的HSP患兒101例，治療并隨訪6個(gè)月。其中40例患兒存在腎臟損害（HSPN組），61例無腎臟損害（N-HSPN組）。HSPN組男22例，女18例；平均年齡（7.8±2.1）歲。N-HSPN組男33例，女28例；平均年齡（7.2±2.3）歲。所有患兒均為初發(fā)病例，符合HSP及HSPN診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。同期本院體檢的健康兒童80例作為健康對(duì)照組，其中男49例，女31例；平均年齡（7.6±2.0）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除原發(fā)性腎小球疾病、血小板減少性紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乙型肝炎及川崎病等。所有研究病例，均未使用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集和處理健康對(duì)照組及HSP患兒入院時(shí)，以EDTA-K2抗凝管抽取外周靜脈血2 ml，以1500 r/min，離心5 min，分離出上清液置于離心管中，—20℃冰箱中保存，待測血漿PAF-AH活性。在沉積于抗凝管底部的細(xì)胞沉淀物中加入PBS緩沖液，至2 ml，蓋好后上下顛倒混勻。準(zhǔn)備10 ml小試管，加入2.5 ml淋巴細(xì)胞分離液，再用吸管將細(xì)胞沉淀的混合液小心加入淋巴細(xì)胞分離液，使細(xì)胞沉淀處于上層。再1700 r/ min離心10 min，可見分層現(xiàn)象，用吸管小心吸取外周血單個(gè)核細(xì)胞至清潔塑料小試管中，再加PBS液至5ml，用吸管混勻。再次置于離心機(jī)中，1700 r/min離心5 min后，迅速倒掉上清液，最終得到用于提取DNA的細(xì)胞沉淀，—20℃保存。

1.2.2血漿PAF-AH活性測定采用美國Cayman公司提供的血漿PAF-AH活性檢測試劑盒，設(shè)定空白孔2孔，加10 l DTNB和15l化驗(yàn)用緩沖液。陽性對(duì)照孔2孔，加入10l DTNB，10l人血漿PAF-AH標(biāo)準(zhǔn)品和5l化驗(yàn)用緩沖液。樣品孔每樣本3孔，加10 l DTNB，10 l血漿樣品和5 l化驗(yàn)緩沖液。（加到孔里的PAF-AH的量應(yīng)導(dǎo)致這樣的結(jié)果，即每分鐘增加的吸光度值在0.01～0.1，必要時(shí)將樣品進(jìn)行稀釋或濃縮。）每孔加入200 l底物溶液（2-thioPAF），開始反應(yīng)，記錄開始反應(yīng)的準(zhǔn)確時(shí)間，盡可能快得加完底物溶液。均勻震搖反應(yīng)板30 s，使其混勻。在酶標(biāo)儀上以405 nm波長為測量波長，每隔1分鐘讀取吸光度值，至少讀取5個(gè)時(shí)間點(diǎn)。至少在1.2個(gè)吸光度單位內(nèi)，反應(yīng)是線性的。測定各樣本吸光度變化率，根據(jù)說明書中公式計(jì)算PAF-AH活性。

1.2.3PAF-AH基因型的測定

1.2.3.1利用血液基因組DNA提取試劑盒，從每個(gè)樣本的細(xì)胞沉淀中提取DNA100 l，置于離心管中，—20℃保存。

1.2.3.2引物合成參照文獻(xiàn)［5］方法，由上海Invitrogen公司合成：上游引物A：5’-CTATAAATTTATATCATGCTT-3’，下游引物B：5’-TTTACTATTCTCTTGCTTTAC-3’；C：5’-TCACTAAGAGTCTGA ATAAC-3’，D：5’-TCACTAAGAGTCTGAATAAA-3’。引物A和B參與擴(kuò)增PAF-AH第9號(hào)外顯子，引物A和C擴(kuò)增正常等位基因，引物A和D擴(kuò)增突變等位基因。

1.2.3.3聚合酶鏈反應(yīng)將每個(gè)樣本DNA分別用3對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，25 l P CR反應(yīng)體系包括：PCR試劑盒中Premix Taq（含TaqDNA聚合酶1.25 U/25 l。d NTP Mixture 2×conc；各0.4 mmol/L。PCR Buffer 2×conc，3 mmol/L Mg2+）12.5 l，10mol/L引物2條（A+B，A+C，A+ D）各 0.5l，樣本基因組 DNA 2.5 l，RNase-FreeH2O9 l。在DNA擴(kuò)增儀上，設(shè)定以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：預(yù)變性94℃1 min；變性94℃1 min，退火56℃l min，延伸72℃1min，共5個(gè)循環(huán)；變性94℃30s，退火52℃30 s，延伸72℃30 s，共25個(gè)循環(huán)；最后再延伸72℃5 min。

1.2.3.4DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳將滅菌蒸餾水12.3 ml、40%丙烯酰胺/雙丙烯酰胺溶液 7.5 ml、5× Tris硼酸5 ml、10%過硫酸銨183l、TEMED16.6 l依次加入燒杯，混合均勻后迅速加入制膠槽中，插入梳齒，等待4 h左右，12%聚丙烯酰胺凝膠形成。將制膠槽放入電泳槽，加入內(nèi)槽液（1×tris硼酸）200 ml，拔出梳齒，在形成的小孔中進(jìn)行加樣：第1孔中加5 lDNAMarker，第2、3、4孔中依次加入第1號(hào)樣本的3份擴(kuò)增產(chǎn)物（PCR中參與的引物分別為A+B、A+C、A+D）5 l+1 l上樣緩沖液，第5、6、7孔中加入第2號(hào)樣本的3份擴(kuò)增產(chǎn)物和上樣緩沖液。再加入外槽液約50 ml，連接電泳儀，設(shè)置電壓200 V，電泳50min左右，待電泳條帶到達(dá)距離凝膠底部1 cm左右，關(guān)閉電泳儀。

1.2.3.5DNA核酸銀染將凝膠取下，采用超快核酸銀染試劑盒進(jìn)行染色、漂洗、顯色、再漂洗，置于凝膠成像儀中，觀察凝膠上的條帶并拍照，分析結(jié)果。引物A和B參與擴(kuò)增的160bp片斷，是整個(gè)PAF-AH基因第9號(hào)外顯子；引物A和C參與擴(kuò)增的108 bp片斷，是PAFAH基因第9號(hào)外顯子正常序列（-994位點(diǎn)處為G）；引物A和D參與擴(kuò)增的108 bp片斷，是PAF-AH基因第9號(hào)外顯子的突變序列（-994位點(diǎn)處為T）。

1.3尿常規(guī)及尿微量蛋白的檢測

1.3.1尿常規(guī)檢測包括鏡下血尿、蛋白尿等。

1.3.2尿微量蛋白檢測采用免疫濁度分析儀IMMAGE800，根據(jù)速率散射比濁法原理測定，檢測尿 1-微球蛋白（ 1-MG）、免疫球蛋白G（IgG）、微量白蛋白（mAlb）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（TRF），正常范圍分別是＜12.5mg/L、＜8.5mg/L、＜19.0mg/L和＜2.0mg/L，高于正常范圍視為異常。

1.4統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用Fisher確切概率法。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不同組別血漿 PAF-AH活性比較HSP組血漿 PAF-AH活性明顯低于健康對(duì)照組（=2.12，＜0.05），HSPN組血漿PAF-AH活性明顯低于N-HSPN組（=3.10，＜0.05），見表1。

2.2基因擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果分析及基因型判斷PAF-AH基因-994位點(diǎn)第9號(hào)外顯子的完整擴(kuò)增片段為160 bp，正常等位基因和突變等位基因擴(kuò)增片段均為108bp。每個(gè)樣本均以第9號(hào)外顯子的完整擴(kuò)增片段為陽性對(duì)照（A+B），如圖1中的第2、5泳道；若只擴(kuò)增出正常等位基因（A+C），即為正?；蛐停℅G型）；若同時(shí)有正常等位基因（A+C）和突變等位基因（A+D），即為突變雜合子型（GT型）；若僅擴(kuò)增出突變等位基因（A+D），即為突變純合子型（TT型），但本研究中未發(fā)現(xiàn)。GT、TT型均為突變型。

2.3不同組別基因突變率及等位基因頻率的比較101例HSP患兒中，血漿型 PAF-AH基因第9外顯子-994位點(diǎn)為GG型者96例，GT型者5例（均為HSPN患兒），TT型0例。健康對(duì)照組80例中，GG型79例，GT型1例，TT型0例，兩組基因突變率分別為 4.95%、1.25%。計(jì)算出T等位基因頻率［T=（2× TT+GT）/（2×n）］，HSP患兒為2.48%，健康對(duì)照組為0.62%，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.23），見表2；但HSPN組與NHSPN組基因突變率分別為12.50%、0，T等位基因頻率分別為6.25%、0，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.008、0.01），見表3。

2.4不同基因型組之間臨床表現(xiàn)、尿常規(guī)及尿微量蛋白的比較根據(jù)是否存在基因突變，將101例HSP患兒分為突變組（ =5）和未突變組（=96）。101例患兒均有皮膚紫癜表現(xiàn)，突變組與未突變組發(fā)生率均為100%。基因突變組患兒鏡下血尿、蛋白尿的發(fā)生率高于未突變的患兒（=0.02、0.00），見表4?；蛲蛔兘M患兒尿mAlb、TRF的異常率高于未突變患兒（=0.00、0.02），而尿 1-MG、IgG的異常率兩組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＞0.05），見表5。

3　討論

在生物體內(nèi)，PAF以動(dòng)態(tài)形式存在。Archer等［6］對(duì)健康志愿者用不同濃度的PAF皮下注射后，進(jìn)行連續(xù)的皮膚組織病理檢查，發(fā)現(xiàn)低濃度的PAF可誘導(dǎo)血管內(nèi)中性粒細(xì)胞聚集，血管周圍多種炎性細(xì)胞浸潤；而較高濃度的PAF可直接損傷血管，出現(xiàn)嚴(yán)重的內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，血管周圍單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤，有時(shí)可見白細(xì)胞碎裂。根據(jù)PAF-AH在人體的存在形式，分為血漿型和細(xì)胞型。細(xì)胞型的PAF-AH編碼尚未被克隆，血漿型的PAF-AH基因位于6p12-21，有12個(gè)外顯子。近年發(fā)現(xiàn)，血漿型PAF-AH具有基因多態(tài)性，存在著多個(gè)點(diǎn)突變類型，在東亞人已報(bào)道第9外顯子994（G→T）和1001（A→G）突變［7-8］，可使PAF-AH活性降低或缺乏。1型糖尿病患者血漿PAF-AH活性明顯低于健康對(duì)照組［9］，支氣管哮喘患者也是明顯降低的［10］。新生兒嚴(yán)重感染時(shí)血漿PAF水平增高，PAF-AH活性降低，且兩者變化趨勢與預(yù)后相關(guān)［11］。本研究檢測出HSP患兒血漿PAF-AH活性明顯低于健康對(duì)照兒童，筆者認(rèn)為該酶活性降低可能參與了HSP的發(fā)病過程；紫癜性腎炎患兒血漿PAFAH活性明顯低于非紫癜性腎炎患兒，提示該酶活性降低也參與了HSPN的發(fā)病。陸彪等［3］發(fā)現(xiàn)，HSPN組患兒PAFAH mRNA及蛋白表達(dá)水平均較 NHSPN組及健康對(duì)照組增高。筆者考慮可能正是由于血漿型PAF-AH活性下降，不足以水解PAF以抑制其導(dǎo)致的病理損傷作用，機(jī)體的自身調(diào)節(jié)使得PAFAH反應(yīng)性地表達(dá)增加，以發(fā)揮其可能存在的保護(hù)作用。

表1　不同組別血漿PAF-AH活性比較

圖1　血漿型PAF-AH基因第9外顯子-994位點(diǎn)基因型檢測電泳圖

表2　HSP組與健康對(duì)照組血漿型PAF-AH基因第9外顯子-994位點(diǎn)基因突變頻率及等位基因頻率的比較　例（%）

表3　HSPN組與N-HSPN組血漿型PAF-AH基因第9外顯子-994位點(diǎn)基因突變率的比較　例（%）

表4　不同基因型組之間主要臨床表現(xiàn)發(fā)生情況的比較　例

表5　不同基因型組之間尿微量蛋白異常發(fā)生情況的比較　例（%）

關(guān)于PAF-AH基因突變與HSP、HSPN之間的關(guān)系，張慧玉等［12］研究發(fā)現(xiàn)PAF-AH基因突變與HSP的發(fā)病無關(guān)，但HSPN患兒PAF-AH基因突變發(fā)生率達(dá)52.9%，與普通人群比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示 PAF-AH基因突變與HSPN的發(fā)病有關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)，HSP患兒的基因突變率與健康對(duì)照組患兒相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而HSPN患兒的該基因突變率明顯高于N-HSPN組，與以上研究結(jié)果基本一致。

關(guān)于PAF-AH與HSP臨床表現(xiàn)的相關(guān)性目前研究不多。本研究結(jié)果顯示，基因突變的HSP患兒出現(xiàn)腎臟受累的概率更大，尤以鏡下血尿和蛋白尿?yàn)橹释茰yPAF-AH基因第9外顯子-994位點(diǎn)發(fā)生突變可能與HSP的腎臟損害有關(guān)。但由于樣本例數(shù)偏少，可能存在統(tǒng)計(jì)誤差，需要收集大樣本資料進(jìn)行反復(fù)驗(yàn)證。尿微量蛋白在一定程度上也能夠早期反映腎臟濾過、重吸收功能的變化，筆者研究發(fā)現(xiàn)，基因突變的患兒尿微量白蛋白、尿轉(zhuǎn)鐵蛋白的異常率明顯高于未發(fā)生基因突變的患兒，兩組 1-MG、IgG的異常率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這兩個(gè)發(fā)現(xiàn)表明該基因突變可能與HSPN的發(fā)病密切相關(guān)，這與HSPN的腎臟病理改變主要在腎小球這一特點(diǎn)是相符合的。

綜上所述，HSP患兒血漿PAF-AH活性降低可能參與了HSP、HSPN的發(fā)病過程，其第9外顯子-994位點(diǎn)的基因突變可能參與了HSP腎損害的發(fā)生。本研究的不足之處在于，所有病例中未發(fā)現(xiàn)純合子突變基因型（TT），可能與樣本例數(shù)不足有關(guān)。PAF-AH基因第9外顯子-994位點(diǎn)（G→T）突變率的大小，目前報(bào)道尚不一致，還需要多中心、大規(guī)模樣本進(jìn)行研究檢測。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.07.046

R725.4

A

1671-0800（2016）07-0931-04

315010寧波，寧波市婦女兒童醫(yī)院（張琦、孫建新、康國貴）；安徽省兒童醫(yī)院（童文娟）

康國貴，kanggui2006@aliyun.com

2016-05-09（本文編輯：姜曉慶）