菜青蟲(chóng)感染金龜子綠僵菌后體內(nèi)幾種保護(hù)酶活性的變化

李世廣,　竇婷婷,　付小伶,　劉祝琴,　何　超

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 合肥　230036)

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菜青蟲(chóng)感染金龜子綠僵菌后體內(nèi)幾種保護(hù)酶活性的變化

李世廣*,竇婷婷,付小伶,劉祝琴,何超

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 合肥230036)

為了明確菜青蟲(chóng)感染金龜子綠僵菌后體內(nèi)的防御機(jī)制,采用分光光度法測(cè)定了菜青蟲(chóng)被金龜子綠僵菌感染后體內(nèi)保護(hù)酶活性的變化。結(jié)果表明,用金龜子綠僵菌處理后菜青蟲(chóng)體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì),反映出菜青蟲(chóng)在金龜子綠僵菌侵染初期防御能力增強(qiáng),后期降低。其中,SOD、POD和CAT活力分別在接種后36、24和48h達(dá)到高峰,說(shuō)明菜青蟲(chóng)在抵抗金龜子綠僵菌侵染過(guò)程中,首先發(fā)生作用的保護(hù)酶是POD,隨后為SOD,而CAT是最后發(fā)生作用的保護(hù)酶。

菜青蟲(chóng);金龜子綠僵菌;超氧化物歧化酶;過(guò)氧化物酶;過(guò)氧化氫酶

LiShiguang,DouTingting,FuXiaoling,LiuZhuqin,HeChao

菜青蟲(chóng)為鱗翅目粉蝶科菜粉蝶(Pieris rapae)的幼蟲(chóng),是十字花科植物的重要害蟲(chóng),除啃食葉肉為害之外,還可引起軟腐病的流行,危害十分嚴(yán)重[1]。

目前,我國(guó)對(duì)于農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的防治還集中于化學(xué)防治上,但大量化學(xué)農(nóng)藥的使用已經(jīng)使得環(huán)境不堪重負(fù),在害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性的同時(shí),大量的農(nóng)藥殘留也對(duì)人類自身的健康產(chǎn)生極大的威脅。因此,尋找能夠有效防治農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的生物方法顯得尤為重要。綠僵菌[Metarhizium (Metsch.)Sorokin]是一類廣譜性蟲(chóng)生真菌,能侵染200多種農(nóng)林害蟲(chóng),對(duì)人、畜、作物安全[23]。國(guó)內(nèi)外運(yùn)用綠僵菌防治農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的研究已有不少報(bào)道[4],有關(guān)昆蟲(chóng)保護(hù)酶的研究報(bào)道也有很多,但大多數(shù)還集中在昆蟲(chóng)保護(hù)酶與昆蟲(chóng)抗藥性關(guān)系之間的研究[57]。關(guān)于昆蟲(chóng)病原真菌與昆蟲(chóng)保護(hù)酶關(guān)系的研究也略有報(bào)道[810]。而被綠僵菌侵染后菜青蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶活性變化尚未見(jiàn)報(bào)道。

以往的研究表明,菜青蟲(chóng)體內(nèi)存在著超氧化物歧化酶(superoxide,SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)和過(guò)氧化物酶(peroxidase,POD)等保護(hù)酶。當(dāng)昆蟲(chóng)病原真菌附著在菜青蟲(chóng)體壁,菌絲進(jìn)入血腔后,菜青蟲(chóng)會(huì)啟動(dòng)機(jī)體內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)進(jìn)行防御,即菜青蟲(chóng)體內(nèi)的SOD、CAT和POD三者協(xié)同作用, 使自由基維持在一個(gè)較低的水平,從而維持其正常的生理活動(dòng)[11]。作者利用篩選出的對(duì)菜青蟲(chóng)致病力較高(校正死亡率為96.4%,僵蟲(chóng)率達(dá)84.1%,LT50為2d,尚未發(fā)表)的金龜子綠僵菌Ma60菌株,研究了被該菌株侵染后菜青蟲(chóng)體內(nèi)幾種保護(hù)酶活力的變化,旨在為菜青蟲(chóng)的生物防治工作提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試菌株

金龜子綠僵菌Ma60菌株,由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院生物防治研究室提供。

1.2供試蟲(chóng)源

菜青蟲(chóng)采自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)翠園,將其放在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院大棚溫室內(nèi)的白菜上飼養(yǎng),待成蟲(chóng)產(chǎn)卵孵化后轉(zhuǎn)為室內(nèi)盆栽白菜飼養(yǎng),選取健康活潑的4齡幼蟲(chóng)供試。

1.3真菌分生孢子懸浮液配制

將Ma60菌株接種于PDA培養(yǎng)基平板上,在 (25±1)℃ 條件下培養(yǎng) 10d,待真菌充分產(chǎn)生孢子后,將分生孢子粉刮到盛有 10mL0.1%Tween-80濕潤(rùn)劑的試管中,在渦旋混勻器上充分振蕩 30min,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),配制成孢子含量1.0×108個(gè)/mL的分生孢子懸浮液。

1.4金龜子綠僵菌對(duì)菜青蟲(chóng)的侵染試驗(yàn)

將20頭4齡菜青蟲(chóng)放入培養(yǎng)皿中,用簡(jiǎn)易噴霧器將含0.1%Tween-80的1.0×108個(gè)/mL的金龜子綠僵菌孢子懸浮液均勻地噴在試蟲(chóng)體表,待蟲(chóng)體晾干后,放入裝有白菜葉片的培養(yǎng)皿中,以無(wú)菌的0.1%吐溫-80溶液為對(duì)照，每處理重復(fù)3次,置于溫度22℃、相對(duì)濕度90%左右、光周期L∥D=14h∥10h的恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)。分別于接菌后12、24、36、48、60、72h取樣，備用。

1.5酶液的制備

試蟲(chóng)先用生理鹽水漂洗2～3次,并用濾紙去除體表水分。準(zhǔn)確稱量試蟲(chóng)重量,按1∶9(W/V)加入經(jīng)過(guò)遇冷處理的生理鹽水,在冰浴中進(jìn)行研磨,制成10%組織勻漿液,在4℃下2 500r/min離心10min,取上清液作為待測(cè)酶液,放入-20℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)藏備用。

1.6酶活性的測(cè)定

酶液蛋白含量、SOD、POD和CAT活性測(cè)定均按照南京建成生物工程研究所的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每處理均重復(fù)3次,求平均值。

1.7數(shù)據(jù)處理

采用MicrosoftExcel2003進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表繪制。采用DPS7.05進(jìn)行方差分析,Duncan新復(fù)極差法比較差異顯著性。圖中數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2　結(jié)果與分析

2.1菜青蟲(chóng)體內(nèi)SOD活性的變化

經(jīng)金龜子綠僵菌處理后菜青蟲(chóng)體內(nèi)SOD活性變化如圖1所示,測(cè)定期間對(duì)照組菜青蟲(chóng)體內(nèi)不同時(shí)間的SOD比活力差異不顯著。但處理組不同時(shí)間的SOD比活力差異極顯著(P<0.01),在接菌后12h時(shí)略低于對(duì)照,隨后逐漸升高,到36h達(dá)到最高峰,顯著高于對(duì)照組,酶的比活力為同期對(duì)照組的1.6倍。感染36h之后體內(nèi)SOD活力急劇下降,60h及72h顯著低于對(duì)照組,分別為對(duì)照組的0.83和0.60倍。表明菜青蟲(chóng)被金龜子綠僵菌侵染后12h,孢子還未萌發(fā),菌絲未侵入體內(nèi),所以表現(xiàn)為12h時(shí)處理組與對(duì)照組之間差異不顯著。而在接菌后24～36h,O2濃度增加,導(dǎo)致蟲(chóng)體內(nèi)的HO-濃度大量增加,表現(xiàn)為SOD活力明顯上升,以減輕過(guò)氧離子對(duì)蟲(chóng)體的毒害。在感染后期,可能是受金龜子綠僵菌在蟲(chóng)體內(nèi)大量繁殖的影響,使得SOD的合成受到抑制,自身防衛(wèi)能力下降,表現(xiàn)為SOD活力急劇下降并低于正常蟲(chóng)體。

圖1　感染金龜子綠僵菌后4齡菜青蟲(chóng)體內(nèi)SOD活性的變化Fig.1　Changes of SOD activities in the 4th instar of Pieris rapae larvae infected by Metarhizium anisopliae

2.2菜青蟲(chóng)體內(nèi)POD活性的變化

經(jīng)金龜子綠僵菌處理后菜青蟲(chóng)體內(nèi)POD活性的變化如圖2所示,在接菌后72h內(nèi),對(duì)照組菜青蟲(chóng)體內(nèi)的POD活性無(wú)顯著變化。而處理組的POD活性呈先升高后下降趨勢(shì)。其中,菜青蟲(chóng)在染菌后12h,其體內(nèi)POD比活力與對(duì)照組無(wú)顯著差異;POD活性在接菌后24h時(shí)達(dá)到最大,顯著高于對(duì)照組,為對(duì)照組的1.34倍;隨后緩慢下降,在接菌后36～48h,處理組比活力仍顯著高于對(duì)照組,隨后急劇下降,染菌72h后達(dá)到最低,顯著低于對(duì)照組酶活力。說(shuō)明菜青蟲(chóng)被金龜子綠僵菌侵染后,其體內(nèi)可能產(chǎn)生具有毒性的氧化物質(zhì),從而啟動(dòng)免疫系統(tǒng)合成POD,以維持其正常的生理功能;但在接菌第24h后,由于金龜子綠僵菌菌絲在菜青蟲(chóng)體內(nèi)開(kāi)始萌發(fā),使POD合成受到影響,從而表現(xiàn)為POD活性逐漸下降。

圖2　感染金龜子綠僵菌后4齡菜青蟲(chóng)體內(nèi)POD活性的變化Fig.2　Changes of POD activities in the 4th instar of Pieris rapae larvae infected by Metarhizium anisopliae

2.3菜青蟲(chóng)體內(nèi)CAT活性的變化

經(jīng)金龜子綠僵菌處理后菜青蟲(chóng)體內(nèi)CAT活性的變化如圖3所示,對(duì)照組菜青蟲(chóng)隨著蟲(chóng)體的生長(zhǎng)發(fā)育CAT活性無(wú)顯著變化。而處理組的CAT活性在接菌后變化較大。接菌后12～24h,菜青蟲(chóng)CAT活性與對(duì)照相比,無(wú)顯著差異。從接菌后24h開(kāi)始,CAT活力顯著上升,由20.374U/mg上升至26.798U/mg,隨后緩慢上升至30.687U/mg(48h),達(dá)到最高峰,為對(duì)照組的1.55倍。但在接菌48h后緩慢下降,直至72h時(shí)略低于對(duì)照,且差異不顯著。表明在金龜子綠僵菌侵染初期,菜青蟲(chóng)體內(nèi)組織暫時(shí)未受到侵染,因而CAT的活力沒(méi)有發(fā)生明顯的變化;而在侵染后期,蟲(chóng)體組織遭受嚴(yán)重侵染,因此菜青蟲(chóng)體內(nèi)的CAT活性提高以抵御病原菌對(duì)蟲(chóng)體產(chǎn)生的毒害;但由于金龜子綠僵菌在蟲(chóng)體內(nèi)的生長(zhǎng)繁殖速度很快,最終超出其抵御能力，導(dǎo)致菜青蟲(chóng)的CAT活力逐漸下降。

圖3　感染金龜子綠僵菌后4齡菜青蟲(chóng)體內(nèi)CAT活性的變化Fig.3　Changes of CAT activities in the 4th instar of Pieris rapae larvae infected by Metarhizium anisopliae

3　討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明,菜青蟲(chóng)被金龜子綠僵菌侵染后體內(nèi)的SOD、POD和CAT酶活性均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)。這與李會(huì)平等[9]、姬國(guó)紅等[15]的報(bào)道一致。表明金龜子綠僵菌能有效地干擾菜青蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶的活性,出現(xiàn)這種結(jié)果,可能是由于菜青蟲(chóng)被金龜子綠僵菌侵染后,其體內(nèi)產(chǎn)生有毒的氧化物質(zhì),從而刺激蟲(chóng)體免疫系統(tǒng)合成相應(yīng)的保護(hù)酶,以抵御有毒物質(zhì)對(duì)蟲(chóng)體的毒害,進(jìn)而維持昆蟲(chóng)體內(nèi)正常的生理活動(dòng);而隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng),金龜子綠僵菌在蟲(chóng)體內(nèi)大量繁殖,破壞了蟲(chóng)體組織,菜青蟲(chóng)保護(hù)酶的合成機(jī)制受到限制,清除自由基的能力降低,或者是由于感病蟲(chóng)體內(nèi)自由基過(guò)多,自由基產(chǎn)生與清除之間失去平衡,從而引起昆蟲(chóng)發(fā)病甚至死亡。從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,SOD、POD和CAT活力分別在感染后36、24和48h達(dá)到最高峰,說(shuō)明菜青蟲(chóng)體內(nèi)的保護(hù)酶在對(duì)金龜子綠僵菌的免疫過(guò)程中,首先發(fā)生作用的保護(hù)酶是POD,隨后為SOD,而CAT是最后發(fā)生作用的保護(hù)酶。

綜上所述,用金龜子綠僵菌侵染菜青蟲(chóng),能誘導(dǎo)其體內(nèi)保護(hù)酶的活性發(fā)生變化,對(duì)菜青蟲(chóng)的生物防治具有一定的意義。本文為探明被金龜子綠僵菌感染后菜青蟲(chóng)體內(nèi)的防御機(jī)制提供了一定的理論依據(jù),但是為了更好地研究金龜子綠僵菌對(duì)菜青蟲(chóng)的作用機(jī)制及菜青蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶的作用方式,還需從分子角度對(duì)其進(jìn)行深入探究。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

ChangesofprotectiveenzymeactivitiesinPieris rapaeinfectedbyMetarhizium anisopliae

(SchoolofPlantProtection,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei230036,China)

AbstractTounderstandthedefensemechanismsofPieris rapaeagainstMetarhizium anisopliae,thisstudyusedspectrophotometrytoassaytheactivitiesofprotectiveenzymesofP.rapaeinfectedbyM. anisopliae.Theresultsindicatedthat,theactivitiesofSOD,PODandCATintheinfectedP.rapaewereincreasedatinitialinfectionstage,butdroppedatthelaterinfectionstage,suggestingthatthedefensesystemofP.rapaewasenhancedduringinitialperiod,butdroppedduringthelaterperiod.ThehighestactivitiesofSOD,PODandCATwereobservedat36hours, 24hoursand48hoursafterinoculation,respectively,whichindicatedthatPODplayedanimportantroleindefendingagainsttheinvasionofM. anisopliae,andthenSODfunctionedafterinvasion,whilethelasteffectiveprotectiveenzymewasCAT.

Pieris rapae;Metarhizium anisopliae;superoxide;peroxidase;catalase

20150604

20150624

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題(2011BAD12B04-02)；安徽省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2015A099)；安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)科骨干培育項(xiàng)目(2014XKPY-08)

E-mail:lsg815@163.com

S476.12

ADOI：10.3969/j.issn.05291542.2016.03.022