酶底物法和多管發(fā)酵法檢測(cè)水中的總大腸菌群的比較研究

蔣玲，李雪大英縣疾病預(yù)防控制中心，四川大英　629300

酶底物法和多管發(fā)酵法檢測(cè)水中的總大腸菌群的比較研究

蔣玲，李雪
大英縣疾病預(yù)防控制中心，四川大英629300

目的 比較酶底物法和多管發(fā)酵法對(duì)飲用水中的總大腸菌群檢測(cè)結(jié)果的一致性。方法 使用酶底物法和多管發(fā)酵法對(duì)指定水樣進(jìn)行檢測(cè)，觀察結(jié)果。結(jié)果 兩種方法的檢測(cè)結(jié)果有一致性，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論酶底物法可替代多管發(fā)酵法用于評(píng)價(jià)水質(zhì)微生物。

大腸菌群；酶底物法；多管發(fā)酵法

［Abstract］Objective To compare the consistency of test results of enzyme substrate technique and multi-tube zymolytic method for total coliform group in water.Methods The appointed water sample was detected by the enzyme substrate technique and multi-tube zymolytic method，and the results were observed.Results The test results of the two methods were consistent，and the difference between the two groups had no obvious significance，P＞0.05.Conclusion The enzyme substrate technique can replace the multi-tube zymolytic method to evaluate the water quality and microorganism.

［Key words］Coli group；Enzyme substrate technique；Multi-tube zymolytic method

有資料表明：酶底物法試劑盒彌補(bǔ)了多管發(fā)酵法的不足，是現(xiàn)代微生物快速檢測(cè)的發(fā)展方向，超過(guò)90%以上的美國(guó)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室都使用此方法［1］。目前，國(guó)內(nèi)越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室采用酶底物法用于水質(zhì)大腸菌群的檢測(cè)，但總體規(guī)模還不大，還未被絕大多數(shù)檢測(cè)機(jī)構(gòu)所采用；特別是基層實(shí)驗(yàn)室因條件受限，采用酶底物法的比例更少。作者所處的屬于基層實(shí)驗(yàn)室，我們借助較為簡(jiǎn)易的基層條件，分別使用酶底物法和多管發(fā)酵法對(duì)飲用水中的總大腸菌群進(jìn)行檢測(cè)，分析發(fā)現(xiàn)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果有高度的一致性。現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1樣品

大英縣農(nóng)村飲用水22份。

1.2試劑

酶底物法由株洲鴻潤(rùn)檢測(cè)技術(shù)有限公司提供的總大腸菌群-大腸埃希氏菌測(cè)定試劑盒，十管法，批號(hào)為20150416。多管發(fā)酵法的乳糖培養(yǎng)基由杭州濱和微生物試劑有限公司提供，批號(hào)為20150822，EC肉湯由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，批號(hào)為20141222，伊紅美藍(lán)瓊脂由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，批號(hào)為20141222。

1.3原理

酶底物法是利用大腸菌群可產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，該酶能分解試劑盒中底物鄰-硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），而生成黃色的鄰-硝基酚，使培養(yǎng)基呈現(xiàn)顏色變化，顏色會(huì)從無(wú)色變成黃色，指示有大腸菌群的存在；而大腸埃希氏菌可產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶，而β-葡萄糖醛酸酶能對(duì)試劑中的4-甲基傘形酮葡糖苷酸 （MUG）成份進(jìn)行代謝，使其產(chǎn)生熒光，可在紫外燈下進(jìn)行鑒別。多管發(fā)酵法是根據(jù)大腸菌群能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣及具備革蘭氏染色陰性，無(wú)芽孢呈桿狀等有關(guān)特性的菌群組。

1.4方法

每份水樣分成兩份接種以下兩種方法，根據(jù)污染程度進(jìn)行稀釋。

1.4.1酶底物法采用十管法，直接將水樣100 mL加入含有“科立德”酶底物試劑的無(wú)菌瓶中，蓋上瓶蓋，顛倒混勻，使酶底物試劑充分溶解，加樣：使用10 mL無(wú)菌刻度吸管吸取上述處理好的水樣10 mL加入到試劑盒的方格中，共十格，蓋上蓋子（36±1）℃，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行判讀，如果結(jié)果可疑，可延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間到28 h進(jìn)行結(jié)果判讀，查MPN檢索表報(bào)告水樣中的MPN值。

1.4.2多管發(fā)酵法應(yīng)先接種水樣到乳糖蛋白胨培養(yǎng)基，于（36±1）℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（24±1）h，如所有培養(yǎng)管均不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為總大腸菌群陰性；如有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，則需要轉(zhuǎn)種于伊紅美蘭平板，對(duì)可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢和證實(shí)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)證實(shí)為總大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù)，查MPN檢索表報(bào)告水樣中的MPN值［2］。

1.5統(tǒng)計(jì)方法

按假設(shè)檢驗(yàn)分析整理統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

2　結(jié)果

采用酶底物法和多管發(fā)酵法測(cè)定水樣中的總大腸菌群的結(jié)果詳見下表。

表1　酶底物法和多管發(fā)酵法測(cè)定水樣中的總大腸菌群結(jié)果匯總

通過(guò)多管法和酶底物法對(duì)22份水樣檢查結(jié)果進(jìn)行比較，對(duì)于同一受試對(duì)象分別接受2種不同處理方法采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析，計(jì)算結(jié)果：則t=1.640，P＞0.05，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　討論

管發(fā)酵法（GB/T5750-2006）。在目前生活飲用水檢測(cè)工作中絕大多數(shù)的還采用經(jīng)典的。究其原因是多管發(fā)酵法穩(wěn)定性好，結(jié)果容易判斷，物資成本低。但從本組實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不難發(fā)現(xiàn)，多管發(fā)酵法很多是使用的半成品培養(yǎng)基，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室自行配制后再用于樣品的檢測(cè)，要經(jīng)過(guò)一系列準(zhǔn)備工作才能用于檢測(cè)，任何一個(gè)環(huán)節(jié)的誤差都會(huì)給檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)影響。如：原材料的質(zhì)量，試劑稱量的準(zhǔn)確性和高壓消毒的參數(shù)等諸多因素均會(huì)對(duì)最終結(jié)果造成影響。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還需要轉(zhuǎn)種，驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)步驟較為繁瑣，程序越多引入的誤差可能性越大，結(jié)果的可靠性也就越?。患又S多實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有條件按照國(guó)標(biāo)用質(zhì)控菌株對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行性能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量的最后把關(guān)環(huán)節(jié)存在一定風(fēng)險(xiǎn)。這就將一些不確定性因素引入到了檢測(cè)過(guò)程中，難以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，需要2～5 d，更不能對(duì)水質(zhì)的衛(wèi)生狀況做出快速評(píng)價(jià)也是制約工作的缺陷。

酶底物法因技術(shù)要求高、檢測(cè)費(fèi)用高等原因致該法應(yīng)用少。作者通過(guò)實(shí)踐證實(shí)具有人力成本較低，步驟簡(jiǎn)便，結(jié)果產(chǎn)生快，容易判斷，穩(wěn)定性也好等優(yōu)點(diǎn)。試劑盒是在全程質(zhì)量控制下，按照國(guó)標(biāo)要求配制，消毒并用質(zhì)控菌株進(jìn)行性能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)；其操作方便無(wú)需確證實(shí)驗(yàn)，此法還可監(jiān)測(cè)大腸埃希氏菌，該菌更有病原學(xué)意義；酶底物法穩(wěn)定，無(wú)二次污染，檢測(cè)時(shí)間較短，18～24 h即可出結(jié)果，判斷出大腸菌群和大腸埃希氏菌的MPN值；試劑盒占空間體積較小，受影響因素小，又特別適合大批量和應(yīng)急檢測(cè)的需求。值得推廣應(yīng)用。

該組對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明，相對(duì)于多管發(fā)酵法，酶底物法用于測(cè)定水樣中的總大腸菌群具有高度的一致性 （P＞0.05），兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有實(shí)驗(yàn)者發(fā)現(xiàn)酶底物法可以同時(shí)檢測(cè)總大腸菌群和大腸埃希氏菌。大量研究資料證實(shí)：大腸埃希氏菌與腸道傳染?。ㄈ绺篂a），消化系統(tǒng)疾?。ㄈ缥笣儯┑扔忻芮械年P(guān)系［3-4］，因此監(jiān)測(cè)水中含大腸埃希氏菌的多少更有利于說(shuō)明水質(zhì)的安全狀況。近年來(lái)，我國(guó)《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》與世界接軌，已經(jīng)增加大腸埃希氏菌的檢測(cè)作為評(píng)價(jià)飲用水水質(zhì)的指標(biāo)。通過(guò)檢索表的對(duì)比可發(fā)現(xiàn)由于多管發(fā)酵法每100 mL水樣中最低檢出限為2個(gè)大腸菌群，而酶底物法每100 mL水樣中最低檢出限為1個(gè)大腸菌群，酶底物法在腸桿菌屬的檢出靈敏度上顯著高于多管發(fā)酵法，顯然酶底物法更適合大腸菌群較低的水樣；而在埃希氏菌屬的檢出靈敏度基本一致［5－7］。

4　結(jié)語(yǔ)

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)證明：酶底法和多管發(fā)酵法對(duì)生活飲用水中總大腸菌群的檢測(cè)結(jié)果具有一致性，這和孫宗科，趙春霞等的研究結(jié)果相同［6-7］。隨著社會(huì)發(fā)展對(duì)檢測(cè)結(jié)果的快速準(zhǔn)確要求，國(guó)家對(duì)實(shí)驗(yàn)室的投入及實(shí)驗(yàn)室的自身發(fā)展，加之國(guó)產(chǎn)酶底物試劑的質(zhì)量逐步優(yōu)化，與進(jìn)口試劑等效［8］，檢測(cè)成本也將不斷降低，酶底物法對(duì)大腸菌群的檢測(cè)是個(gè)必然趨勢(shì)。由于基層實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)人員的配備不夠，節(jié)省人力成本，步驟簡(jiǎn)便的酶底物法特別適合在基層實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。

［1］Yakub GP，Castric DA，Stadterman-Knauer KL，et al.Evaluation of coliert and enterolert defined substrate methodology for wastewater application［J］.Water Environ Res，2002，74（2）：131-135.

［2］衛(wèi)生部.GB/T5750.12-2006生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法［D］.微生物指標(biāo)，北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006.

［3］USEPA.Standard methods for the examination of water and wastewater 20th edition［M］.

［4］USEPA.Ambient Water Quality Criteria for Bacteria.［S］.1986.

［5］王晉宇，趙旭坤，郭志宇，等.酶底物法與多管發(fā)酵法檢測(cè)總大腸菌群差異分析 ［J］.中國(guó)給排水，2012，28（20）：139-141.

［6］孫宗科，丁培，薛金榮，等.水中大腸菌群快速檢測(cè)方法-酶底物與多管發(fā)酵法的比較［J］.衛(wèi)生研究，2006，35（4）：497-498.

［7］趙春霞，張哲海，歷以強(qiáng)，等.酶底物法與多管發(fā)酵法和紙片法監(jiān)測(cè)環(huán)境水樣大腸菌群的比較［J］.環(huán)境監(jiān)測(cè)管理與技術(shù)，2009，21（2）：63-64.

［8］陳艷宏，馬健，權(quán)玉玲.2種試劑的酶底物法和多管發(fā)酵法檢測(cè)水中總大腸菌群的比較研究［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜質(zhì)，2014，24（22）：3257-3261.

Comparative Research on Enzyme Substrate Technique and Multi-tube Zymolytic Method in Detecting Total Coliform Group in Water

JIANG Ling，LI Xue
Center for Disease Control and Prevention of Daying，Daying，Sichuan Province，629300 China

R19

A

1672-5654（2016）06（c）-0120-02

10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.18.120

蔣玲（1979.4-），女，四川遂寧人，本科，主管檢驗(yàn)師，主要從事微生物檢驗(yàn)工作。

（2016-03-27）