產(chǎn)7α,15α-雙羥基去氫表雄酮的球黑孢菌紫外誘變育種及發(fā)酵條件

唐 　 潔，　崔 　 勵(lì)，　吳 明 杰

(大連工業(yè)大學(xué) 輕工與化學(xué)工程學(xué)院, 遼寧 大連　116034 )

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產(chǎn)7α,15α-雙羥基去氫表雄酮的球黑孢菌紫外誘變育種及發(fā)酵條件

唐 潔，崔 勵(lì)，吳 明 杰

(大連工業(yè)大學(xué) 輕工與化學(xué)工程學(xué)院, 遼寧 大連116034 )

球黑孢菌可以在去氫表雄酮(DHEA)的C-7α和C-15α位進(jìn)行雙羥基化反應(yīng)，生成7α,15α-雙羥基去氫表雄酮(7α,15α-diOH-DHEA)。以球黑孢菌FN-A127為出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變，篩選出最佳菌株FN-A7，并對FN-A7進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性研究和發(fā)酵條件優(yōu)化。結(jié)果表明，紫外誘變最佳照射時(shí)間為15 min，菌株FN-A7的遺傳穩(wěn)定性良好。在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入2 g/L的DHEA，在8%的接種量、30 ℃進(jìn)行發(fā)酵，突變菌株FN-A7將DHEA轉(zhuǎn)化為7α,15α-diOH-DHEA的產(chǎn)率可達(dá)到31.96%。

球黑孢菌；去氫表雄酮；紫外誘變；發(fā)酵條件

0　引　言

屈螺酮是新一代甾體類避孕藥，由于其副作用小、毒性低、耐受性好，是目前最好的第4代口服避孕藥之一。7α,15α-雙羥基去氫表雄酮(7α,15α-diOH-DHEA)是合成屈螺酮的重要中間體[1-2]。多種真菌能進(jìn)行7α,15α-diOH-DHEA的微生物轉(zhuǎn)化，其中亞麻刺盤孢菌(Colletotrichumlini)和赤霉菌(Gibberellaintermedia)的使用較為廣泛[3]。亞麻刺盤孢菌能引起植物炭疽病[4]；赤霉菌引起的麥類赤霉病導(dǎo)致受侵小麥籽粒中含有真菌毒素對食品安全和人畜健康造成危害[5]。荷蘭聯(lián)合利華公司在2004年提出了球黑孢菌提取物可以作為化妝品中的添加劑使用[6]，說明球黑孢菌具有較高的生物安全性。球黑孢菌作為甾體羥基化反應(yīng)的微生物，之前報(bào)道可以進(jìn)行的羥化反應(yīng)位置有C-11α、C-15α和C-19位[7-8]。本文以球黑孢菌FN-A127為出發(fā)菌株，研究了使用球黑孢菌將去氫表雄酮(DHEA)轉(zhuǎn)化為7α,15α-diOH-DHEA，并討論了菌種的紫外誘變育種和發(fā)酵條件。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

球黑孢菌FN-A127(NigrosporasphaericaFN-A127),清華大學(xué)生命科學(xué)院提供。

1.1.2材料

去氫表雄酮、7α,15α-雙羥基去氫表雄酮標(biāo)準(zhǔn)品，湖北方通藥業(yè)有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，玉米漿膏10，黃豆餅粉12.5，硝酸鈉2，磷酸二氫鉀1，磷酸氫二鉀2，七水合硫酸鎂0.5，七水合硫酸亞鐵0.02，氯化鉀 0.5，pH 自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：同“種子培養(yǎng)基”，pH 6.2。

脫氧膽酸鈉平板：斜面培養(yǎng)基中加0.05%的脫氧膽酸鈉，以抑制菌絲的生長。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌20 min.

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種活化

將原始球黑孢菌接入斜面培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)7 d。250 mL三角瓶中裝入50 mL不加瓊脂的PDA培養(yǎng)基，接入一環(huán)球黑孢菌孢子，搖床28 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。

1.2.2菌懸液制備

取球黑孢菌FN-A127斜面2支，將適量無菌水倒入斜面菌苔上，清洗孢子。將菌液倒入已滅菌的裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)搖勻。將菌液倒入已滅菌裝有2層紗布的漏斗內(nèi)過濾，制成108個(gè)/mL左右的菌懸液。

1.2.3紫外誘變方法

取2～4 mL菌懸液于無菌培養(yǎng)皿中，放入一無菌磁力轉(zhuǎn)子，置于磁力攪拌器上。關(guān)閉所有照明，30 W紫外燈下分別照射5、10、15、20、25、30 min，照射距離30 cm。紫外線照射菌液依次稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，將稀釋菌液移至PDA平板中，每個(gè)平板上加入0.1 mL 菌液，用無菌涂布器涂勻，每個(gè)梯度設(shè)置2個(gè)平行樣，28 ℃避光培養(yǎng)6 d。

1.2.4單菌落篩選

初篩：從培養(yǎng)皿中挑選菌落單一、大小適中、邊緣光滑的10株球黑孢菌單菌落轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上，28 ℃避光培養(yǎng)5 d，待進(jìn)一步篩選使用。

復(fù)篩：初篩獲得的菌株上取一環(huán)孢子轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中，起始菌株FN-A127作對照，30 ℃、220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)52 h，測定7α,15α-diOH-DHEA的產(chǎn)率。

每個(gè)搖瓶裝100 mL種子培養(yǎng)基，各接入5%的孢子菌懸液，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)，每隔6 h取樣，測定每瓶發(fā)酵液的總量,3 500 r/min離心后去上層清液測菌體的濕重。

1.2.6轉(zhuǎn)化工藝

將5%、108個(gè)/mL的孢子菌懸液加入種子培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min發(fā)酵轉(zhuǎn)化52 h。

1.2.77α,15α-diOH-DHEA檢測方法

取復(fù)篩后的發(fā)酵液1 mL，加入1 mL乙酸乙酯，充分萃取后在3 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心分層，取上清液蒸干，剩余固體用甲醇溶解、稀釋后用孔徑0.45 μm的有機(jī)濾膜過濾，作為待測樣品。

HPLC分析。色譜條件：C18烷基硅烷鍵合反相柱；流動(dòng)相V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=36∶24∶40；進(jìn)樣量20 μL；體積流量0.8 mL/min；色譜柱溫25 ℃；紫外檢測器波長210 nm。

將標(biāo)準(zhǔn)品7α,15α-diOH-DHEA制成質(zhì)量濃度為1 g/L的甲醇溶液，梯度稀釋至0.5、0.33、0.25、0.2 g/L，分別進(jìn)行HPLC檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程：y=5×10-7x，R=0.996 8，線性關(guān)系良好。

數(shù)據(jù)管理、預(yù)警管理與預(yù)警發(fā)布管理3個(gè)模塊安裝在服務(wù)器端，由于交互性較強(qiáng)，采用B/S架構(gòu)，基于ASP.NET的MVC模式設(shè)計(jì)。預(yù)警分析引擎也安裝在服務(wù)器端，由于不需要進(jìn)行詳細(xì)的配置，采用C/S架構(gòu)。服務(wù)器端實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)程數(shù)據(jù)管理、預(yù)警規(guī)則設(shè)定、預(yù)警分析處理等功能，在接收到實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)后，進(jìn)行分析計(jì)算，判別是否超警，同時(shí)生成預(yù)警消息，推送至客戶端。

1.2.8復(fù)篩菌株的遺傳穩(wěn)定性

將復(fù)篩的菌株做6次傳代培養(yǎng)，測定每代菌株進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化后7α,15α-diOH-DHEA的產(chǎn)率。

2　結(jié)果與討論

2.1紫外誘變時(shí)間對球黑孢菌致死率的影響

球黑孢菌紫外線照射后的致死率曲線如圖1所示。照射5 min時(shí)，致死率較低，從10 min開始，致死率大幅提升，10～15 min致死率增加2倍多，說明此時(shí)的輻射量是處于多數(shù)孢子的敏感區(qū)域與耐受極限[9]，照射15 min時(shí)致死率達(dá)到75%。致死率過低誘變的孢子活性不高，且正突變菌落較少；致死率過高誘變的孢子的存活率太低，且這些孢子可能因?yàn)樽贤饩€照射的時(shí)間過長而使相應(yīng)的酶活降低，甚至產(chǎn)生負(fù)突變。因此，選擇致死率在75%左右為最佳，最佳紫外誘變時(shí)間為15 min。

圖1　紫外線照射時(shí)間對球黑孢菌致死率的影響

2.2復(fù)篩結(jié)果

對照實(shí)驗(yàn)組FN-A127菌株發(fā)酵培養(yǎng)52 h后，測得7α,15α-diOH-DHEA的產(chǎn)率為11.05%。

復(fù)篩的誘變菌株對7α,15α-diOH-DHEA的產(chǎn)率如表1所示。誘變菌株中FN-A1、FN-A2、FN-A3、FN-A5、FN-A6、FN-A7、FN-A8和FN-A9 的產(chǎn)率相對于對照實(shí)驗(yàn)組FN-A127菌株均有提高，其中FN-A7的轉(zhuǎn)化效果最好。劉佩卉[10]在去氫表雄酮的生物法羥基化修飾研究中用紫外誘變選育青霉菌，僅將菌種的轉(zhuǎn)化率提高到13.9%。本實(shí)驗(yàn)中菌株FN-A7將產(chǎn)率提高到17.34%，因此選定FN-A7為復(fù)篩最佳菌株。

表1　復(fù)篩誘變菌株轉(zhuǎn)化結(jié)果

2.3復(fù)篩菌株遺傳穩(wěn)定性

復(fù)篩最佳菌株FN-A7連續(xù)6次轉(zhuǎn)接的斜面做發(fā)酵轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。復(fù)篩最佳菌株FN-A7連續(xù)6次傳代斜面對底物進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，發(fā)酵液中產(chǎn)物質(zhì)量濃度基本穩(wěn)定在0.99 g/L左右，表明其遺傳穩(wěn)定性良好。

表2　復(fù)篩最佳菌株遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.4菌株FN-A7的生長曲線及接種時(shí)間

復(fù)篩菌株FN-A7的生長曲線如圖2所示，24 h 前為生長遲緩期，培養(yǎng)24 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，54 h到達(dá)穩(wěn)定期。對數(shù)生長期內(nèi)，48 h時(shí)的菌濃較高，菌絲體處于生長旺盛期，菌體生理活性較高。種子培養(yǎng)時(shí)間過短會(huì)延緩菌體的生長代謝，過長又會(huì)造成菌體細(xì)胞老化、代謝功能衰退[11]。因此，確定FN-A7的接種時(shí)間為48 h，即可將培養(yǎng)48 h的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

圖2　菌株FN-7的生長曲線

2.5發(fā)酵轉(zhuǎn)化條件

2.5.1DHEA加入時(shí)間對轉(zhuǎn)化的影響

底物加入時(shí)間對菌體的微生物轉(zhuǎn)化能力有重要的影響。李會(huì)等[12]在用赤霉菌將DHEA轉(zhuǎn)化為7α,15α-diOH-DHEA的研究中，在培養(yǎng)24 h后加入底物可以使轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高。本實(shí)驗(yàn)分別于菌體培養(yǎng)0、6、12、24、30 h時(shí)加入5 g/L的DHEA，轉(zhuǎn)化時(shí)間均為52 h。結(jié)果如圖3所示，初始時(shí)加入底物，7α,15α-diOH-DHEA的產(chǎn)率最高，6 h時(shí)產(chǎn)率開始明顯下降。發(fā)酵培養(yǎng)前先加底物，可能會(huì)對酶有誘導(dǎo)的作用，難溶的底物可以隨著菌體的生長而被包覆在易成團(tuán)的球黑孢菌體內(nèi)，有利于轉(zhuǎn)化的進(jìn)行，所以產(chǎn)率反而高于菌體成熟后再加入底物。因此，確定底物的加入時(shí)間在培養(yǎng)初始時(shí)。

圖3DHEA加入時(shí)間對7α,15α-diOH-DHEA產(chǎn)率的影響

Fig.3EffectofDHEAadditiontimeon7α,15α-diOH-DHEAyield

2.5.2發(fā)酵溫度對轉(zhuǎn)化的影響

溫度一方面可以影響發(fā)酵過程中各種酶反應(yīng)的速率和蛋白質(zhì)的性質(zhì)；另一方面會(huì)影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)[13]。在原培養(yǎng)條件30 ℃基礎(chǔ)上，改變轉(zhuǎn)化溫度，選出菌體發(fā)酵轉(zhuǎn)化最適宜的溫度。本實(shí)驗(yàn)考察在26、28、30、32、34 ℃ 5個(gè)不同溫度下進(jìn)行發(fā)酵，52 h后檢測7α,15α-diOH-DHEA的產(chǎn)率。結(jié)果如圖4所示，26 ℃時(shí)產(chǎn)率較低，產(chǎn)率隨著溫度的升高而升高，30 ℃時(shí)產(chǎn)率達(dá)到最高。當(dāng)溫度繼續(xù)升高，產(chǎn)率開始下降，可能是溫度過高，使羥化酶的催化活力下降[14]。所以，選擇30 ℃作為發(fā)酵轉(zhuǎn)化的溫度。

圖4發(fā)酵溫度對7α,15α-diOH-DHEA產(chǎn)率的影響

Fig.4Effectoffermentationtemperatureon7α,15α-diOH-DHEAyield

2.5.3DHEA質(zhì)量濃度對轉(zhuǎn)化的影響

甾體化合物的微生物轉(zhuǎn)化是酶促反應(yīng)，隨著底物質(zhì)量濃度增加，酶被底物飽和，底物的轉(zhuǎn)化率不再升高，甚至下降[15]。本實(shí)驗(yàn)分別考察了2、5、8、15、20 g/L的DHEA添加量下發(fā)酵轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物得率。結(jié)果如圖5所示，隨著底物質(zhì)量濃度增大，產(chǎn)率開始下降，到達(dá)8 g/L時(shí)，下降幅度更為明顯。說明當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度達(dá)到一定的臨界值后，底物在菌體外堆積，而對菌體生長起到抑制作用，不利于轉(zhuǎn)化的進(jìn)行。底物質(zhì)量濃度低于2 g/L，轉(zhuǎn)化所得的實(shí)際產(chǎn)量過低，可能對以后實(shí)際生產(chǎn)的收益影響較大。袁東超等[16]在研究底物濃度對降解大豆甾醇生產(chǎn)雄甾烯酮的影響中發(fā)現(xiàn)，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過0.3%就能明顯抑制分枝桿菌的生長，過高的底物濃度對最終轉(zhuǎn)化率的提高無利。所以，選擇2 g/L為所需底物濃度。

圖5DHEA質(zhì)量濃度對7α,15α-diOH-DHEA產(chǎn)率的影響

Fig.5EffectofDHEAconcentrationon7α,15α-diOH-DHEAyield

2.5.4接種量對轉(zhuǎn)化的影響

接種量的大小決定了菌體的生長繁殖狀態(tài)，從而影響菌體內(nèi)酶對底物的催化作用。魏長龍等[17]在研究接種量對微生物轉(zhuǎn)化生成9α-羥基雄烯二酮中得出，接種量僅為4.0%時(shí)甾體轉(zhuǎn)化率提升最快。本實(shí)驗(yàn)考察了在不同接種量下反應(yīng)的轉(zhuǎn)化情況，結(jié)果如圖6所示，接種量在8%時(shí)，7α,15α-diOH-DHEA產(chǎn)率較高。采用較大的接種量可以加快菌絲的繁殖速度，縮短調(diào)整期，減少反應(yīng)時(shí)間。當(dāng)接種量到10%時(shí)，產(chǎn)率大幅下降，可能是接種量過大，菌絲體生長的過多，易將菌體包裹成團(tuán)，引起溶氧不足，影響產(chǎn)物的合成[18]。接種量過低使菌體生長較慢，導(dǎo)致用于轉(zhuǎn)化的酶不足；過高則會(huì)使酶活力降低，抑制產(chǎn)率的提高。因此，選擇8%為發(fā)酵轉(zhuǎn)化的接種量。

圖6　接種量對7α,15α-diOH-DHEA產(chǎn)率的影響

2.5.5助溶劑對轉(zhuǎn)化的影響

甾體化合物在水中的溶解度很低，微生物轉(zhuǎn)化過程中，底物不溶于水相的發(fā)酵液，會(huì)影響菌體對底物的吸收利用，且底物易包埋在析出的產(chǎn)物中 ，影響底物與酶的有效接觸，限制最終產(chǎn)率[19]。駱健美等[20]研究不同有機(jī)溶劑對甾體C1,2脫氫反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，添加乙醇時(shí)簡單節(jié)桿菌的細(xì)胞膜通透性最好，醋酸可的松的轉(zhuǎn)化率最高。增大底物在反應(yīng)體系中的溶解度對提高反應(yīng)效率有重要作用。本文采用吐溫80、無水酒精、豆油和PEG 4種不同助溶劑，添加量為2.0%。結(jié)果如圖7所示，無水酒精對底物的轉(zhuǎn)化效果最好。底物DHEA易結(jié)塊，以水相為主的發(fā)酵液中添加少量極性的有機(jī)助溶劑，可以增加疏水性底物的溶解度[21]，而其他幾種助溶劑都不能很好地改善底物的分散情況，因此，選擇無水酒精作為底物的助溶劑。

圖7　助溶劑對7α,15α-diOH-DHEA產(chǎn)率的影響

3　結(jié)　論

球黑孢菌株FN-A127通過紫外線輻射15 min 的誘變，篩選出最佳菌株FN-A7，比出發(fā)菌株的7α,15α-diOH-DHEA產(chǎn)率提高了6.29%，且遺傳穩(wěn)定性良好。利用誘變復(fù)篩菌株FN-A7對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，配制發(fā)酵培養(yǎng)基同時(shí)加入用無水酒精溶解的底物，質(zhì)量濃度為2 g/L，高溫滅菌后接入8%的種子液，在30 ℃進(jìn)行發(fā)酵，7α,15α-diOH-DHEA的產(chǎn)率提高到31.96%。

球黑孢菌是微生物轉(zhuǎn)化DHEA產(chǎn)7α,15α-diOH-DHEA的新菌種，該菌在甾體羥基化反應(yīng)方面的應(yīng)用有所創(chuàng)新。球黑孢菌的生物安全性較高，可以作為潛在的工業(yè)菌，下一步需要用更好的優(yōu)化手段來提高產(chǎn)率，以達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的目的。

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Mutantion ofNigrosporasphaericaby ultraviolet mutation to produce 7α,15α-dihydroxyl dehydroepiandrosterone and its fermentation condition

TANGJie,CUILi,WUMingjie

(School of Light Industry and Chemical Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Nigrospora sphaericacouldproduce7α,15α-dihydroxyldehydroepiandrosterone(7α,15α-diOH-DHEA)bydihydroxylationreactiononC-7αandC-15αofdehydroepiandrosterone(DHEA).AfterultravioletmutationonemutantFN-A7wasobtained.Itsgeneticscharacteristicwasstablein15minofmutationtimeandtheyieldof7α,15α-diOH-DHEAcouldreachto31.96%withinoculationof8%andDHEAof2g/Lat30 ℃.

Nigrosporasphaerica; dehydroepiandrosterone; ultraviolet mutation; fermentation condition

唐潔,崔勵(lì),吳明杰.產(chǎn)7α,15α-雙羥基去氫表雄酮的球黑孢菌紫外誘變育種及發(fā)酵條件[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,35(4):254-258.

TANG Jie, CUI Li, WU Mingjie. Mutantion ofNigrosporasphaericaby ultraviolet mutation to produce 7α,15α-dihydroxyl dehydroepiandrosterone and its fermentation condition [J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2016, 35(4): 254-258.

2015-01-08.

唐 潔(1989-)，女，碩士研究生；通信作者：崔 勵(lì)(1964-)，女，教授.

Q815

A

1674-1404(2016)04-0254-05