西洋參多糖酶解產物寡糖的純化及鑒定

李 麗 新，　金 鳳 燮，　魚 紅 閃

(大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連　116034 )

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西洋參多糖酶解產物寡糖的純化及鑒定

李 麗 新，金 鳳 燮，魚 紅 閃

(大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連116034 )

對生物酶法轉化西洋參多糖的產物進行分離純化得到寡糖，并對其進行鑒定。西洋參多糖的酶解產物經Sevage法除蛋白、Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱層析分離純化，得到2個組分PP-1、PP-2相對分子質量約為7.5×104和6.7×103，其中PP-2為酶降解寡糖。HPLC法對PP-2進行鑒定，結果表明，PP-2為均一的寡糖，其單糖組成為葡萄糖。高碘酸氧化、Smith降解、紅外光譜對PP-2的結構進行鑒定，表明PP-2為主鏈由α-D-(1→4)和α-D-(1→6)吡喃葡萄糖構成的葡聚糖。

西洋參多糖；生物酶法；寡糖

0　引　言

以植物來源多糖為主的天然多糖類物質，毒性極低或沒有細胞毒性，對人體具有極大的利用價值，已成為醫(yī)藥界的熱門研究對象[1]。西洋參多糖(polysaccharides inPanaxquinquefolium)具有多種藥用價值[2]，但其相對分子質量大，進入人體內吸收效果較差，溶血性不好，長期注射服用很容易造成人體表面肌膚出現(xiàn)硬結。研究發(fā)現(xiàn)，多糖的水解產物也具有多種生理活性功能，還具有低熱量、穩(wěn)定性高及安全無毒等理化特性，由于其相對分子質量較低，很容易被人體吸收利用[3]。利用生物酶法對多糖進行轉化，可切斷特定糖苷鍵，制得特定聚合度的寡糖，產品均一性好，反應條件溫和，工藝易控制，是較為理想的轉化方法[4]。

目前尚無關于酶法轉化西洋參多糖的深入研究。本實驗對生物酶法轉化西洋參多糖的產物進行分離純化，初步鑒定其結構，為進一步研究其生物活性奠定基礎。

1　材料與方法

原料與試劑：西洋參多糖酶解產物粗品，實驗室自制；Sephadex G-75，美國Pharmacia公司；單糖標準品，美國Sigma公司；標準系列葡聚糖，美國Pharmacia公司；色譜純乙腈，美國Merck公司，其余試劑均為國產分析純。

儀器：JASCO LC-2000系列高效液相色譜儀，日本分光公司；檢測器為Alltech 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器，美國Alltech公司；GC-9A氣相色譜，日本島津公司；傅里葉變換紅外光譜儀，美國珀金埃爾默公司。

1.2方法

1.2.1西洋參多糖酶解產物的分離純化

西洋參多糖酶解產物粗品經Sevage法[5]除蛋白3次后，冷凍干燥。將凍干樣品200 mg用2 mL 純凈水溶解，經Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱分離純化，苯酚硫酸法檢測糖含量[6]。

1.2.2相對分子質量的測定

根據(jù)文獻[7]的方法，取純化后的組分各5 mg 經Sephadex G-75洗脫，得到各組分洗脫體積V。取標準系列葡聚糖Dextran T-70、T-40、T-10 和相對分子質量為4 600的葡聚糖標準品在同等條件下洗脫，得到相應標準品洗脫體積Ve。取相對分子質量200萬的藍色葡聚糖，在同等條件下洗脫，得凝膠柱空體積Vo。Ve/Vo與相應標準品相對分子質量的對數(shù)作曲線，得出回歸方程，即可計算得各組分相對分子質量。

1.2.3純度鑒定

采用高效液相色譜法鑒定純化后寡糖純度。色譜柱，TOSOH TSK-Gel G4000PWXL(7.8 mm×300 mm，10 μm)；流動相，純凈水，體積流量為0.5 mL/min。采用蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)檢測，溫度110 ℃，上樣量20 μL。

1.2.4單糖組成分析

精確稱取寡糖樣品20 mg，分別加入2 mL 2 mol/L H2SO4溶液，105 ℃反應8 h。反應結束后以過量BaCO3中和，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，上清液定容至5 mL。利用HPLC分析全水解樣品的成分，色譜柱：Hypersil NH2(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：體積比80∶20 的乙腈-水混合液；體積流量1.0 mL/min。采用蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)檢測，溫度35 ℃，上樣量20 μL。得到的樣品HPLC圖譜出峰時間與標準單糖的HPLC圖譜比較，確定寡糖樣品的單糖種類。

1.2.5高碘酸氧化

高碘酸氧化[8]：稱取25 mg寡糖樣品溶于少量純凈水，加入12.5 mL 30 mmol/L的高碘酸鈉溶液，定容至25 mL，于暗處反應，間歇振蕩。間隔0、6、12、24、48、60…96 h取樣0.1 mL，測定223 nm處吸光度。

甲酸生成量的測定：氧化反應完成時，取2 mL 乙二醇加入反應液消耗剩余的高碘酸。以酚酞為指示劑，測定甲酸的生成量。

根據(jù)高碘酸鈉的消耗量和甲酸的生成量，可初步判斷寡糖的糖苷鍵鏈接方式。

1.2.6Smith降解

方法“1.2.5”中終止反應的高碘酸氧化反應液經對流水透析48 h后，蒸餾水透析過夜，60 ℃減壓濃縮至10 mL左右，加入70 mg硼氫化鈉，于暗處振蕩反應過夜，使糖醛還原為糖醇。再經流水透析48 h，蒸餾水透析過夜，透析液冷凍干燥。凍干樣品完全酸水解后與標準品丙三醇、赤蘚醇分別進行乙?；苌幚恚汫C檢測[9]。色譜條件：色譜柱HP-5(30 m×0.32 mm×0.1 μm)，柱溫200 ℃；檢測器為氫火焰離子(FID)檢測器，溫度260 ℃；載氣為N2，體積流量1 mL/min；氣化室溫度220 ℃；上樣1 μL。

1.2.7紅外光譜法

稱取干燥的寡糖樣品粉末2 mg，研磨均勻后壓成薄片在4 000～400 cm-1紅外波數(shù)范圍內掃描。

2　結果與討論

2.1西洋參多糖酶解產物的分離純化

200 mg西洋參多糖酶解產物經過Sephadex G-75柱洗脫，洗脫曲線如圖1所示，有2個峰且均為單一對稱峰，說明酶解產物含有2個組分且比較純，分別命名為PP-1、PP-2，質量分數(shù)分別為8.2%和81.8%。

圖1　酶解產物的洗脫曲線圖

2.2酶解產物的相對分子質量

由方法“1.2.2”測定組分PP-1和PP-2的洗脫體積分別為58.1和140.6 mL。測得Sephadex G-75柱的外水體積Vo(藍色葡聚糖)及各標準品洗脫體積Ve，結果見表1。

表1　標準品的Sephadex G-75柱洗脫體積

根據(jù)lgMr與Ve/Vo關系作圖，得到的相對分子質量標準曲線方程為y=-0.306 7x+5.613 9，R2=0.997 1，可計算得2個組分PP-1、PP-2的相對分子質量分別為7.5×104和6.7×103，即PP-1為多糖，PP-2為寡糖。實驗室前期測定出西洋參多糖組分PPQ-1的相對分子質量約為7.9×104[10]，與PP-1極為相近，因此可判定PP-1為少量未被酶降解的底物西洋參多糖，而底物大部分降解成了PP-2寡糖。

2.3寡糖純度的鑒定

PP-2經HPLC檢測其純度，出現(xiàn)了一個對稱大峰，說明為比較單一的寡糖組分，可對其結構進行進一步分析。

圖2　PP-2的HPLC圖譜

2.4寡糖的單糖組成

PP-2經“1.2.4”的方法全水解后，產物經HPLC檢測，由圖3可以看出，保留時間為8.548 min，與葡萄糖標準品保留時間8.482 min相近，則說明該寡糖組分由葡萄糖組成。

2.5高碘酸氧化結果

根據(jù)“1.2.5”的實驗方法，繪制高碘酸鈉消耗量標準曲線，得回歸方程y=0.039 7x，R2=0.999 7。PP-2的高碘酸氧化反應過程中吸光度的變化如表2所示。由表2可知，經60 h后吸光度達到穩(wěn)定，根據(jù)吸光度變化及標準曲線，可算得平均1 mol的PP-2己糖殘基消耗0.635 mol的高碘酸鈉。反應液經NaOH滴定有甲酸生成，據(jù)高碘酸氧化結果初步分析，該寡糖組分為葡萄糖之間以1→4和1→6糖苷鍵連接為主[11]。

(a) PP-2 (b) 葡萄糖標準品

表2　PP-2高碘酸氧化過程中吸光度的變化

2.6Smith降解產物分析

利用Smith降解法進一步確定寡糖組分PP-2 的糖苷鍵連接方式。標準品丙三醇、赤蘚醇乙?；苌锏腉C圖譜分別如圖4、5所示，由圖知保留時間分別為4.554、8.806 min。

圖4　標準品丙三醇的GC圖譜

PP-2寡糖樣品經高碘酸氧化、Smith降解所得的產物進行乙酰化衍生處理，GC檢測結果如圖6所示。由圖6可知，PP-2的Smith降解產物出現(xiàn)保留時間為4.537、8.794 min的2個峰，與標準品丙三醇及赤蘚醇的保留時間相近，結合高碘酸氧化結果，進一步說明PP-2為1→4和1→6位糖苷鍵連接的葡聚糖[12]。

圖5　標準品赤蘚醇的GC圖譜

圖6　PP-2的Smith降解產物的GC圖譜

2.7紅外光譜分析

PP-2的紅外光譜圖如圖7所示，由圖可知，PP-2紅外光譜圖中出現(xiàn)典型的糖類特征吸收峰：3 600～3 200 cm-1的羥基伸縮振動峰(O—H)；3 000～2 800 cm-1的亞甲基伸縮振動峰(C—H)，可進一步判定PP-2為糖類。

圖7　PP-2的紅外光譜圖

除2個特征吸收峰外，圖中還出現(xiàn)1 363.70 cm-1處的亞甲基彎曲振動吸收峰(C—H)；1 200～1 000 cm-1的吡喃環(huán)C—O—C 和C—O—H的伸縮振動特征吸收峰；960～930 cm-1的糖分子振動的特征吸收區(qū)域；844 cm-1附近的α-端基差向異構C—H變角振動；770 cm-1附近的對稱環(huán)伸縮振動峰[13]。

綜合PP-2紅外光譜與單糖組成結果分析，可認為寡糖組分PP-2為α-D-吡喃型葡聚糖。

3　結　論

生物酶法轉化后的西洋參多糖酶解產物粗品經Sevage法除蛋白，Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱分離純化得到2個組分PP-1、PP-2，其相對分子質量約為7.5×104和6.7×103。其中PP-1為少量未被酶降解的底物西洋參多糖，而底物大部分降解成了PP-2寡糖。通過HPLC法對PP-2進行純度鑒定，發(fā)現(xiàn)PP-2為均一的寡糖，HPLC檢測其全水解產物，結果表明其單糖組成為葡萄糖。高碘酸氧化、Smith降解、紅外光譜法分別對PP-2的結構進行鑒定，結果表明PP-2為主鏈由α-D-(1→4)和α-D-(1→6)吡喃葡萄糖構成的葡聚糖。初步鑒定了西洋參多糖酶解產物寡糖的結構，為進一步研究其生物活性奠定基礎。

[1] 朱欣婷.植物多糖的生物活性研究進展[J].安徽農業(yè)科學,2008,36(28):12076-12077.

[2] 鄭明權,劉彥臣.西洋參莖葉總皂苷和根多糖的藥理學研究進展[J].中醫(yī)藥信息,2000(2):12-13.

[3] 繆月秋,顧龔平,吳國榮.植物多糖水解及其產物的研究進展[J].中國野生植物資源,2005,24(2):4-7.

[4] 劉穎新,范業(yè)雪.酶技術在中藥有效成分提取與轉化中的研究現(xiàn)狀[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報,2008,10(9):46-47.

[5] 董英,張艷芳,孫艷輝.水飛薊粗多糖脫蛋白方法的比較[J].食品科學,2007,28(12):82-84.

[6] 賀紅星,張霽紅,趙瑛,等.苯酚-硫酸法測定普魯蘭含量[J].農產品加工(學刊),2007(12):15-19.

[7] 黨秀麗,劉雪英,王慶偉,等.蘆薈多糖的分離純化及其相對分子質量和含量測定[J].醫(yī)藥導報,2012,31(1):67-71.

[8] 張惟杰.糖復合生化技術[M].杭州:浙江大學出版社,1999.

[9] 呂寧,浦軍平,金鳳燮,等.麥冬多糖OPF-1的結構分析[J].大連工業(yè)大學學報,2012,31(4):243-246.

[10] 艾曉娜.人參多糖提取純化及結構的初步鑒定[D].大連:大連工業(yè)大學,2014.

[11] 周鵬,謝明勇,傅博強.多糖的結構研究[J].南昌大學學報(理科版),2001,25(2):197-203.

[12] 伍樂芹,張靜,孫潤廣.白術多糖的分離純化與結構表征[J].高等學?；瘜W學報,2011,32(12):2812-2816.

[13] 夏朝紅,戴奇,房韋.幾種多糖的紅外光譜研究[J].武漢理工大學學報,2007,29(1):45-47.

Purification and identification of oligosaccharide from enzymatic hydrolysis of polysaccharides inPanaxquinquefolium

LILixin,JINFengxie,YUHongshan

(School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

OligosaccharidewasobtainedbyenzymaticallydegradingpolysaccharidesinPanax quinquefolium.AfterremovedproteinscomponentsbySevagemethod,twofractionsPP-1andPP-2wereobtainedbySephadexG-75,relativemolecularweightsofwhichwereabout7.5×104and6.7×103.PP-2wasahomogeneousoligosaccharidefromenzymatichydrolysis,whichwasmainlycomposedofglucose.ResultsofMalapradereaction,SmithdegradationandIRsuggestedthatPP-2wasglucanandmainlycomposedofα-D-(1→4)andα-D-(1→6)pyranglucose.

polysaccharides inPanaxquinquefolium; biological enzymatic method; oligosaccharide

李麗新,金鳳燮,魚紅閃.西洋參多糖酶解產物寡糖的純化及鑒定[J].大連工業(yè)大學學報,2016,35(4):250-253.

LI Lixin, JIN Fengxie, YU Hongshan.Purification and identification of oligosaccharide from enzymatic hydrolysis of polysaccharides inPanaxquinquefolium[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2016, 35(4): 250-253.

2015-01-09.

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2012ZX09503001-003).

李麗新(1990-)，女，碩士研究生；通信作者：魚紅閃(1968-)，男，教授.

TS202.1

A

1674-1404(2016)04-0250-04