銀杏葉多糖的制備及其抗氧化性

許 春 雨，　王　爽，　王　璐，　馬 志 揚，　鄒 丁 丁，　葉 淑 紅，　劉　艷

(1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連　116034；2.江蘇三儀生物工程有限公司, 江蘇 邳州　221300 )

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銀杏葉多糖的制備及其抗氧化性

許 春 雨1，王爽1，王璐1，馬 志 揚1，鄒 丁 丁1，葉 淑 紅1，劉艷2

(1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連116034；2.江蘇三儀生物工程有限公司, 江蘇 邳州221300 )

采用適當(dāng)?shù)牧弦罕?、提取溫度、提取時間、提取pH對銀杏葉進行浸提，采用Sevage法將提取液中的蛋白從粗多糖中去除，經(jīng)DEAE-52和Sephadex G-100純化得到均一多糖。以VC為參照，分別研究GBLP對超氧陰離子自由基、羥基自由基和1,1-二苯基-2-苦味酰基自由基的清除作用。結(jié)果表明，以料液比1∶40、溫度100 ℃、時間4 h、pH 5.0 為提取條件時，提取率可達到12.8%。通過測定GBLP對超氧陰離子自由基、羥基自由基和1,1-二苯基-2-苦味?；杂苫那宄士芍珿BLP具有較強的抗氧化性，可作為天然抗氧化劑。

銀杏葉；多糖；抗氧化性；清除率

0　引　言

銀杏葉內(nèi)含有重要生理和藥理活性作用的功能活性成分[1-2]。近年來，由銀杏開發(fā)而成的銀杏提取物及其制劑是較受歡迎的天然植物制劑之一[3]。熊平源等[4]的研究表明，銀杏葉提取物可通過調(diào)整CD4+/CD8+T細胞亞群的比值來增強小鼠免疫功能。目前，在銀杏葉提取物抑制腫瘤方面研究也很多，從不同方面證明其具有抑制腫瘤作用[5-6]，但對于GBLP抗氧化性研究結(jié)果存在差異性。本實驗以大連銀杏黃葉為原料，采用水提醇沉的方式提取多糖。水溶性多糖的提取方法有熱水浸提法、微波輔助法、超聲波輔助法、酶法提取等[7-8]。熱水浸提法成本低廉，最易進行工業(yè)化控制，故采取水提醇沉的方式制備銀杏葉多糖[9]，并進一步研究其體外抗氧化性。

1　材料與方法

1.1材料

大連工業(yè)大學(xué)校園內(nèi)收集的秋日銀杏黃葉。

95%乙醇、丙酮、苯酚、濃硫酸、Cellulose DEAE-52、Sephadex G-100、Tris-HCl、抗壞血酸、DPPH、鄰苯三酚、硫酸亞鐵。

1.2方法

1.2.1銀杏葉多糖的制備

將收集好的銀杏葉用清水洗去表面灰塵，放入恒溫鼓風(fēng)干燥箱，在70 ℃條件下將葉子的水分完全烘干。用粉碎機將烘干的葉子粉碎后，過60目篩，得到細膩的銀杏葉粉末。

在料液比1∶40、提取溫度100 ℃、提取時間4 h、提取液pH 5.0的條件下，浸提銀杏葉粉末。55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)提取液至原體積的1/3，加入4倍體積95%的乙醇，離心取沉淀，丙酮清洗2次、95%乙醇清洗2次，少量去離子水溶解多糖沉淀，凍干備用。

1.2.2銀杏葉多糖的純化

1.2.2.1DEAE-52色譜柱的分離純化

將GBLP配成溶液，上樣于DEAE-52離子交換柱(2.2 cm×25 cm)，用0～2.0 mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫，體積流量為1 mL/min。用自動部分收集器以5 mL/管收集洗脫液，隔管檢測多糖(苯酚-硫酸法，A=490 nm)。

1.2.2.2 Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱的分離純化

將Sephadex G-100裝入1.6 cm×50 cm色譜層析柱中，用5 mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡。將多糖單一組分配成10 mg/mL的溶液，上樣量200 mg，用Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.6) 洗脫，洗脫速度為0.3 mL/min，8 mL/管分部收集，隔管檢測多糖(苯酚-硫酸法，A=490 nm)。

1.2.3銀杏葉多糖的抗氧化性

取4.5 mL Tris-HCl緩沖液(pH 8.2，50 mmol/L)，于25 ℃水浴預(yù)熱20 min，加入0.1 mL 不同濃度樣液。將7 mmol/L鄰苯三酚溶液0.4 mL加入反應(yīng)體系，加入2滴10 mol/L濃鹽酸終止反應(yīng)。在320 nm處測定吸光度[10]，計算清除率。

清除率=[1-(A2-A1)/A0]×100%

式中：A0、A1、A2分別為空白組、對照組和樣品組的吸光度。

1.2.3.2對羥基自由基(·OH)的清除作用

參照張佳佳[11]的方法，按表1依次加入試劑?；靹蚝笥?7 ℃恒溫水浴中保溫30 min，冷卻至室溫，在530 nm處測定吸光度。

表1　對·OH的清除作用的試劑列表

等體積去離子水代替樣品溶液作空白對照(A0)，等體積去離子水代替樣品溶液(A2)和過氧化氫溶液作對照組(A1)，計算清除率。

清除率=(A1-A2)/(A1-A0)×100%

1.2.3.3 對1,1-二苯基-2-苦味?；杂苫?DPPH·)的清除作用

參照姜波[12]的方法并加以修改，多糖樣液2.0 mL，加入0.2 mmol/L的DPPH溶液2.0 mL，混勻后避光靜置30 min，在517 nm處測定吸光度。以95%乙醇與樣液為對照組(A1)，95%乙醇代替樣品溶液為空白(A0)。以同濃度抗壞血酸作為陽性對照(A2)，計算清除率。

清除率=[1-(A2-A1)/A0]×100%

1.2.4數(shù)據(jù)分析

通過SPSS 16.0、Excel和Graph pad 5.0對數(shù)據(jù)進行整理分析。

2　結(jié)果與討論

2.1多糖的純化

當(dāng)GBLP溶液通過Cellulose DEAE-52離子交換柱時，帶負電基團的多糖能夠結(jié)合到帶正電的離子交換劑上，用NaCl溶液洗脫，Cl-可以將多糖組分從交換劑上置換出來，此時得到的多糖為酸性多糖，因多糖中官能團的取向、類型及數(shù)量有差異，可以利用不同離子強度的NaCl溶液進行洗脫分離。圖1(a)中，2個峰分別由0.2和0.3 mol/L 的NaCl溶液洗脫得到，后者對稱性較好。

使用葡聚糖凝膠色譜柱洗脫時，相對分子質(zhì)量不同的多糖通過層析柱時間不同，因此根據(jù)流出時間可以對不同相對分子質(zhì)量的多糖進行分離純化。本實驗中，通過DEAE-52收集到酸性多糖再經(jīng)過Sephadex G-100，呈現(xiàn)單一對稱峰，如圖1(b)所示，表明GBLP為相對分子質(zhì)量相對均一的組分。

(a) DEAE-52

(b) Sephadex G-100

圖1GBLP的DEAE-52和Sephadex G-100洗脫曲線

Fig.1Purification results of GBLP by DEAE-52 cellulose and Sephadex G-100

2.2抗氧化性

圖2　GBLP對的清除作用

2.2.2對·OH的體外清除作用

由圖3可以看出，GBLP對于·OH的清除作用僅次于VC。當(dāng)質(zhì)量濃度由1.0 mg/mL增加到1.5 mg/mL時，GBLP對·OH清除率大幅度上升，表明GBLP具有較好的抗氧化能力。

2.2.3對DPPH·的體外清除作用

如圖4所示，GBLP對DPPH·的清除作用不同于之前二者，起始清除率較高，斜率較小。當(dāng)GBLP質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時清除率即達到

圖3　GBLP對·OH的清除作用

52.67%，隨著GBLP質(zhì)量濃度增加，清除率上升緩慢。GBLP清除DPPH·的IC50為0.36 mg/mL，VC為0.01 mg/mL。GBLP存在對DPPH·的抑制作用，說明它具有體外抗氧化活性。

圖4　GBLP對DPPH·的清除作用

從圖5比較可知，同一濃度的GBLP對不同的自由基清除作用不同。超氧陰離子的清除作用呈緩慢上升趨勢；對于羥基自由基清除率由低到高快速升高；在遇到DPPH時，雖然清除率上升趨勢較平穩(wěn)，但是低濃度即可到達較高清除率。由此可見，GBLP具有一定的抗氧化性。

圖5　GBLP對 、·OH、DPPH·的清除作用

3　結(jié)　論

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[3] 仰榴青,徐佐旗,吳向陽,等.銀杏多糖的研究進展[J].食品科學(xué),2004,25(11):372-375.

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[5] 陳群,楊文貴,郭麗,等.銀杏葉多糖的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用[J].中藥藥理與臨床,2003,19(5):32-33.

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Preparation ofGinkgobilobapolysaccharides and its antioxidant activity

XU Chunyu1,WANG Shuang1,WANG Lu1,MA Zhi yang1,ZOU Ding ding1,YE Shu hong1,LIU Yan2

(1.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.Jiangsu Sanyi Bioengineering Company Limited, Pizhou 221300, China )

PolysaccharideinGinkgo bilobaleaves(GBLP)waspreparedanditsantioxidationwasdetermined.GBLPwasextractedfromGinkgo bilobaleavesbywaterextractionandalcoholprecipitationandproteinswereremovedbySevagemethod.ThecrudepolysaccharideswerepurifiedbyDEAE-52andSephadexG-100.TheextractionrateofGBLPwas12.8%attheoptimalextractionconditionofsolid-liquidratio1∶40,extractiontemperature100 ℃,extractiontime4h,extractpH5.0.ResultssuggestedthatGBLPcouldbeusedasanaturalantioxidantwithhighantioxidantactivity.

Ginkgobilobaleaves; polysaccharide; antioxidant activity; scavenging rate.

許春雨,王爽,王璐,馬志揚,鄒丁丁,葉淑紅.銀杏葉多糖的制備及其抗氧化性[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,35(4):235-238.

XU Chunyu, WANG Shuang, WANG Lu, MA Zhiyang, ZOU Dingding, YE Shuhong.Preparation ofGinkgobilobapolysaccharides and its antioxidant activity[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2016, 35(4): 235-238.

2015-03-13.

國家自然科學(xué)基金資助項目(31370554).

許春雨(1991-)，女，碩士研究生；通信作者：葉淑紅(1972-)，女，教授.

TS201.2

A

1674-1404(2016)04-0235-04