miR-498在人卵巢癌組織中的表達及對人卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

鄭玲芝

miR-498在人卵巢癌組織中的表達及對人卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

鄭玲芝

目的研究微小RNA-498（miR-498）在人卵巢癌組織中的表達及對人卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，探討其在人卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用和意義。方法應(yīng)用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）方法檢測miR-498在人卵巢癌以及癌旁組織中的表達；對人卵巢癌細(xì)胞株（SKOV3、OVCAR3）轉(zhuǎn)染miR-498 mimics（模擬物）后，采用噻唑藍（MTT）法觀察人卵巢癌細(xì)胞的體外增殖活性，采用流式細(xì)胞儀法檢測細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果RT-qPCR結(jié)果顯示miR-498在人卵巢癌組織中表達顯著低于癌旁組織（＜0.05），細(xì)胞體外增殖實驗和凋亡實驗結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-498 mimics后，SKOV3細(xì)胞增殖能力下降、凋亡增加（均＜0.05）；OVCAR3細(xì)胞也出現(xiàn)增殖能力下降、凋亡增加（均＜0.05）。結(jié)論miR-498與人卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡有關(guān)，在人卵巢癌組織中表達下降，可能參與了人卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。

卵巢腫瘤；癌；微小RNA-498；增殖；凋亡

微小RNA（miRNAs）是一種小的非編碼RNA，長度20～22個核苷酸，作為一種新的基因表達調(diào)節(jié)物，它能通過與目的 mRNA結(jié)合，從而引起目的mRNA的降解或者抑制目的mRNA的翻譯［1］。miRNAs在體內(nèi)參與多種生物過程的信號通路調(diào)控，如細(xì)胞增殖、凋亡、應(yīng)激及脂肪代謝，在腫瘤發(fā)生發(fā)展上起著重要作用［2］，是目前生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點之一。已有研究證實，miR-498的異常表達與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如非小細(xì)胞肺癌［3］。為探討miR-498在人卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮的作用，筆者通過臨床標(biāo)本檢測該小分子在人卵巢癌組織以及癌旁組織中的差異表達情況，利用體外細(xì)胞學(xué)實驗觀察miR-498對人卵巢癌細(xì)胞的增殖和凋亡作用，為進一步探討其在人卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制奠定研究基礎(chǔ)?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1　資料與方法

1.1組織標(biāo)本收集浙江省余姚市第二人民醫(yī)院2013年7月至2014年7月共30份（30例患者）手術(shù)切除的新鮮組織標(biāo)本，人卵巢癌組織：取自實性癌中未壞死的區(qū)域。癌旁組織：癌周圍2cm以外的未壞死組織。所有患者術(shù)前未行放療、化療。

1.2細(xì)胞株及試劑人卵巢癌細(xì)胞株（SKOV3、OVCAR3）為浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院中心實驗室饋贈。培養(yǎng)基RPMI-1640購自Hycolone公司，胎牛血清購自 Gibco公司，Taqman micro-RNA assays購自ABI公司；Lipofectamine2000、Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒購自Invitrogen公司；MTT購自sigma公司；凋亡檢測試劑盒購自BD公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染兩種人卵巢癌細(xì)胞株均用含 10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。miR-498 mimics和mimics negative control購自上海吉瑪公司。取對數(shù)生長期細(xì)胞，按脂質(zhì)體試劑盒操作說明書進行轉(zhuǎn)染。

1.4RT-PCR收取細(xì)胞沉淀后直接用Trizol重懸，組織標(biāo)本則加入1 ml Trizol后用勻漿器研磨，加入200 l氯仿，劇烈震蕩15s，室溫靜置10min后，12000r/min 4℃離心15 min，吸取上層水相加入等體積預(yù)冷的異丙醇置于冰上30 min，再用12 000 r/min，4℃離心15 min后棄上清，用75%乙醇漂洗RNA沉淀，DEPC水溶解RNA沉淀。Nanodrop 1000（美國）檢測總mRNA濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作，制備cDNA產(chǎn)物，以U6為內(nèi)參，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，在實時定量PCR儀（First7500美國）上進行PCR擴增。PCR擴增體系：10 l 2×SYBRGreen Realtime PCR Master Mix、20 mol/L的正反鏈引物各1l，4l逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，加滅菌雙蒸水至總反應(yīng)體積20 l。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性1 min，95℃15 s，60℃20 s，70℃l0 s，共40個循環(huán)，采用相對定量方法計算靶miRNA相對表達量。

1.5MTT檢測將轉(zhuǎn)染后的人卵巢癌細(xì)胞接種于96孔板（5000個細(xì)胞/孔）后繼續(xù)培養(yǎng)72h，然后加入20 l的MTT試劑（5 mg/L），在37℃恒溫孵育箱中孵育4 h，吸出液體后加入150l二甲基亞砜（DMSO）溶解，在酶標(biāo)儀570nm波長處測定吸光度（OD）值。每組實驗重復(fù)3次。

1.6細(xì)胞凋亡檢測將轉(zhuǎn)染24 h后的人卵巢癌細(xì)胞更換為無血清培養(yǎng)基，置于1%CO2、37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞后加入5 l Annexin V和5 l PI，混勻，室溫下避光孵育30 min，然后送流式細(xì)胞儀檢測。每組實驗重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計方法數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-檢驗；兩組比較采用 檢驗。＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

圖1　人卵巢癌組織和癌旁組織的 miR-498表達情況（**＜0.01）

2.1人卵巢癌組織中 miR-498的表達顯著降低相對于癌旁組織，人卵巢癌組織的miR-498表達顯著降低（15.31±0.952.51±0.62；=11.43，＜0.05），見圖1。

2.2轉(zhuǎn)染miR-498 mimics后人卵巢癌細(xì)胞增殖活性下降將人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3、OVCAR3分為轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染miR-498 mimics）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染miR-498 negative control）和空白轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，采用MTT法檢測細(xì)胞在不同轉(zhuǎn)染處理后的吸光值（A值）。結(jié)果顯示，SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染組的OD值和陰性對照組的OD值相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）；OVCAR3細(xì)胞有著相同的趨勢，見表1。

表1　轉(zhuǎn)染72 h后各組細(xì)胞的OD值比較

2.3轉(zhuǎn)染 miR-498mimics后促進人卵巢癌細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果如圖所示（圖2），在轉(zhuǎn)染48 h后SKOV3細(xì)胞 miR-498 mimics組凋亡率顯著高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），陰性對照組與空白轉(zhuǎn)染組凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞ 0.05），OVCAR3細(xì)胞組趨勢相同（表2）。

表2　各組細(xì)胞凋亡率的比較　%

圖2SKOV3細(xì)胞株凋亡圖

3　討論

卵巢癌的確切發(fā)病機制目前尚不清楚，缺乏有效的靶向藥物；因此，盡快闡明卵巢癌發(fā)生發(fā)展的潛在機制十分必要。miRNAs已被證實廣泛參與體內(nèi)多種生理或病理生理過程，包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展在內(nèi)。miRNA可以通過調(diào)節(jié)其靶mRNA的表達，發(fā)揮促進或者抑制腫瘤進展的作用［4-6］。miR-498位于人染色體19q13.41位置上。Schepeler報道m(xù) iR-498在II期結(jié)腸癌中表達降低，而且降低地程度與患者的不良預(yù)后相關(guān)［7］。miR-498在急性髓細(xì)胞白血病中表達下降，而在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中高表達，在內(nèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的 CD4+T細(xì)胞中表達下降［8］，Yan等［9］報道了miR-498在單純皰疹病毒-1介導(dǎo)的卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒復(fù)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，由于它是轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的關(guān)鍵因子，因此研究該小分子在人卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用，對更加深入了解人卵巢癌的發(fā)病機制以及新的抗癌藥物的研發(fā)具有重要意義［10］。

本文研究結(jié)果顯示，人卵巢癌組織中miR-498的表達顯著高于癌旁組織，提示與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)；體外細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)抑制miR-498后人卵巢癌細(xì)胞增殖能力下降，凋亡增多，提示該小分子RNA與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡緊密相關(guān)。關(guān)于miR-498的靶基因，目前尚未明確，有報道它通過調(diào)節(jié)FOXO3基因的表達來發(fā)揮抑制腫瘤的作用，miR-498可能與腫瘤的發(fā)生相關(guān)［11］。miR-498的功能可能還涉及其他靶基因或信號途徑的作用，需要進一步研究。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.07.042

R737.31

A

1671-0800（2016）07-0923-03

315400浙江省余姚，余姚市第二人民醫(yī)院

鄭玲芝，Email：2525001 06@qq.com

2015-11-20（本文編輯：姜曉慶）