云南南部野生大葉千斤拔資源遺傳多樣性的ISSR分析

王桂娟，肖文祥，唐壽賢

( 中國科學院西雙版納熱帶植物園，云南 勐臘 666303 )

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云南南部野生大葉千斤拔資源遺傳多樣性的ISSR分析

王桂娟*，肖文祥，唐壽賢

( 中國科學院西雙版納熱帶植物園，云南 勐臘 666303 )

應用ISSR分子標記技術，對云南南部7個地區(qū)的野生大葉千斤拔(Flemingiamacrophylla)居群進行了遺傳多樣性分析。結果表明：云南野生大葉千斤拔具有較高的遺傳多樣性。在物種水平上，平均每個位點的多態(tài)位點百分率(PPL)為94.85%，有效等位基因數(Ne)為1.462 7，Nei’s基因多樣性指數(He)為0.281 5，Shannon’s多樣性信息指數(Ho)為0.433 7；在居群水平上，PPL= 43.44%，Ne = 1.298 1，He = 0.170 4，Ho = 0.249 9。基于Nei’s遺傳多樣性分析可得出，居群間的遺傳分化系數(Gst)為0.397 5，表明居群內的遺傳變異為60.25%，居群間的遺傳變異為39.75%，這說明居群間的遺傳分化要低于居群內的遺傳分化。根據遺傳多樣性分析和聚類結果，應在大葉千金拔遺傳多樣性較高的勐臘易武(MY)、丘北(QB)和寧洱(NE)地區(qū)，設立保護點對其進行就地保護。

大葉千金拔, 遺傳多樣性, ISSR

大葉千斤拔(Flemingiamacrophylla)屬豆科(Leguminosae)千金拔屬(FlemingiaRoxb.)，分布于印度、孟加拉、緬甸、老撾、越南、柬埔寨、馬來西亞和印度尼西亞等亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)。在中國主要分布于云南、廣西、貴州、廣東、臺灣、海南和四川，其中以云南的資源最為豐富(韋裕宗，1991)。大葉千斤拔常生長于海拔260～1 800 m的草地和灌木叢，其根部具有祛風除濕、舒筋活絡、強筋壯骨及消炎止痛等功效，是婦科千金片、金雞膠囊、復方挫傷靈和活絡止痛丸等中成藥的主要原料(張麗霞等，2007)。大葉千金拔種子、葉片及嫩枝可作為畜禽的優(yōu)質蛋白飼料，是優(yōu)良的牧草資源(趙茜，2002)。此外，由于大葉千金拔具有較強的固氮作用，還可以用來改良土壤(呂?；?，1991)。近年隨著對大葉千金拔需求的加大，以及大量荒山和坡地被開墾，野生的大葉千金拔資源日趨減少，因此對其遺傳資源的研究及保護工作已十分必要。

ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)作為一種分子標記方法，由于其技術簡單方便、費用低、通用性好，在植物的遺傳多樣性研究中被廣泛使用(向振勇等，2007；Wang et al，2012；Liu et al，2013)。張忠廉等(2011)應用ISSR技術對千斤拔屬的14種植物親緣關系進行分析，表明千斤拔屬植物具有豐富的遺傳多樣性。千斤拔屬植物的主要活性成分為黃酮類物質，此外還含有香豆素類、萜類、揮發(fā)性油類、脂肪酸類等物質，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗病原微生物、抗氧化、抗血栓、保護神經及腦組織等功能(李莉等，2009；李寶強等，2009；李昌松等，2011)。此外，對大葉千金撥的地理分布及種子生物學等方面也有一定的研究(管艷紅等，2009；管志斌等，2011)。本研究采用ISSR分子標記技術對云南省分布的野生大葉千金拔居群進行研究，對其居群遺傳多樣性水平和遺傳結構進行分析，為科學合理地保護和利用現(xiàn)有的野生大葉千金拔資源提供理論依據和技術支持。

1　材料與方法

1.1 植物材料

研究材料采自云南的瀾滄、寧洱、丘北、象明、易武、楊武和嘎灑地區(qū)(圖1)，共計7個居群，135個樣本。采集過程中，對于個體數大于20株的居群按照均勻分布、隨機取樣的原則進行采樣，而對于個體少于此數的居群進行全部個體采樣，采集新鮮葉片，記錄各居群的采集地、生境、海拔、地理位置，所有樣本均在中國科學院西雙版納熱帶植物園進行遷地保存(表1，圖1)。

1.2 基因組DNA提取

采用改良后的CTAB法提取基因組DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，并在紫外分光光度計(Beckman DU 800)下檢測其質量和濃度，最后稀釋標定到10 ng·μL-1, 放入-20 ℃冰箱里儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物篩選與PCR擴增

所用引物參照加拿大哥倫比亞大學UBC公司公布的第9套ISSR引物序列，由生工生物工程(上海)股份有限工司合成。每個居群選取2個模版在20 μL 的反應體系中進行擴增篩選，從前60個引物中選取11個擴增條帶清晰、重復性好的引物(表2)用于全部7個居群樣本分析。

PCR擴增反應在Bio-Rad PCR儀上進行，經過比較與優(yōu)化確定最佳的ISSR擴增條件為20 μL的反應體系，內含1 × Buffer,2.0 mmol·L-1MgCl2, 250 μmol·μL-1dNTPs,0.5 μmol·μL-1引物，0.5 UTaqDNA聚合酶(TOYOBO),25 ng 模版DNA。PCR擴增程序為95 ℃預變性7 min；之后進行35個循環(huán)：95 ℃變性45 s,46～54 ℃退火(退火溫度隨引物而定，表2)45 s,72 ℃延伸42 s；72 ℃溫育7 min。

1.4 產物檢測

PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，溴化乙錠染色，在80 V電壓下電泳30 min左右，Marker用100 bp DNA lader(昆明云科生物技術有限公司)，在凝膠成像系統(tǒng)(UVP)中觀察、記錄和保存圖像。

1.5 數據統(tǒng)計分析

對電泳圖譜中同一位置上DNA帶的有無進行統(tǒng)計，有帶的記為“1”，無帶的記為“0”，僅記錄清晰、穩(wěn)定、且長度在300～1 500 bp范圍內的擴增帶，形成0/1矩陣圖輸入計算機。應用POPGENE 軟件(Yeh et al，1997)對全部居群和各單個居群分別進行遺傳參數分析，分別計算了多態(tài)位點百分率(PPL)、觀測等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Nei’s(1973)基因多樣性指數(He)、Shannon信息指數(Ho)、居群總基因多樣性(Ht)、居群內基因多樣性(Hs)、居群間的遺傳分化系數(Gst)、Nei’s(1978)遺傳距離(D)和遺傳一致度(I)。根據Nei’s遺傳距離，利用NTSYS-pc2.1軟件進行居群UPGMA聚類分析(Rohlf，2000)。居群間的基因流用公式Nm = 0.5(1-Gst)/Gst間接推算。

表 1　云南野生大葉千金拔居群取樣分布的采集地、生境、海拔、地理位置及采樣數Table 1　Locality, habitat, altitude, geographical location and sample size of Flemingia macrophylla populations from Yunnan

圖 1　7個云南野生大葉千金拔居群的取樣分布圖　居群代號同表1Fig. 1　Locations of the 7 sampled Flemingia macrophylla populations　Population codes are the same as those in Table 1

2　結果與分析

2.1 物種和群體水平的遺傳多樣性分析

用篩選到的11條ISSR引物，共檢測到97個位點(每條引物產生6～11個位點)，其中多態(tài)性位點92個。在物種水平上，多態(tài)位點百分率 (PPL) 為94.85%，Nei’s基因多樣性指數(He)為0.281 5，Shannon信息指數(Ho)為0.433 7(表3)。在居群水平上，每個位點等位基因數(Na)為1.257 7～1.628 9,平均為1.434 4。有效等位基因數(Ne)為1.161 6～1.436 0，平均為1.298 1。多態(tài)位點百分率(PPL)在25.77%～62.89%之間，平均為43.44%，最高的是勐臘易武(MY)居群，最低的是玉溪楊武(YY)居群。居群的Nei’s基因多態(tài)性指數 (He)在0.094 9～0.247 5之間，平均為0.170 4。Shannon信息指數(Ho)在0.141 1～0.362 1之間，平均為0.249 9。兩者大小與居群多態(tài)位點百分率的趨勢基本一致(表3)，由高到低依次為勐臘易武(MY)> 丘北(QB)> 寧洱(NE)> 勐臘象明(XM)> 景洪嘎灑鎮(zhèn)南林山(GS)> 瀾滄(LC)> 玉溪楊武(YY)。各居群間均有遺傳多樣性差異。其中勐臘易武(MY)居群的遺傳多樣性水平最高，PPL= 62.89%，Ne = 1.436 0,He = 0.247 5,Ho = 0.362 1；玉溪楊武居群的遺傳多樣性水平最低，PPL= 25.77,Ne = 1.161 6,He = 0.094 9,Ho = 0.141 1。

表 2　對大葉千金拔7個居群，135株 個體進行擴增的ISSR引物Table 2　ISSR primers used for generating ISSR markers from 135 individuals of 7 Flemingia populations

Note：Y=(C,T).

表 3　大葉千金拔居群的遺傳多樣性Table 3　Genetic diversity of Flemingia populations

Note：Na. Observed number of alleles;Ne. Effective number of alleles;He. Nei’s gene diversity;Ho. Shannon’s information index;PPL. Percentage of polymorphic loci.

表 4　大葉千金拔居群基因多樣性Nei′s(1987)分析Table 4　Nei’s(1987) analysis of gene diversity in Flemingia populations

Note：Ht. total gene diversity;Hs. gene diversity within populations;Gst. coefficient of gene differentiation;Nm. gene flow.(Nm = 0.5(1-Gst)/Gst)

2.2 居群間遺傳分化程度的比較

大葉千金拔各居群間存在著一定的遺傳分化(表4)。7個自然居群總的遺傳多樣性Ht = 0.282 8，其中居群內遺傳多樣性Hs = 0.170 4，居群間的基因多樣度(Dst =Ht-Hs)為0.112 4，Nei’s基因分化系數Gst = 0.397 5，表明有39.75%的遺傳變異存在于居群間，有60.25%的遺傳變異存在于居群內，居群內的遺傳分化大于居群間的分化。居群間基因流(Nm = 0.5(1-Gst)/Gst)為0.758 0。

2.3 聚類分析

大葉千金拔7個居群間的Nei’s遺傳一致度I值的變化范圍為0.783 2 ～ 0.904 1，遺傳距離D值的變化范圍為0.100 8 ～ 0.244 4(表5)。UPGMA法聚類分析表明，景洪嘎灑(GS)和玉溪楊武(YY)居群的遺傳一致度最高(0.904 1)，遺傳距離最近(0.100 8)，因此，在圖中這兩個居群首先聚在一起；而景洪嘎灑(GS)與瀾滄(LC)居群的遺傳一致度最低(0.783 2)，遺傳距離最遠(0.244 4)，在圖中的距離也最遠(圖2)。

3　討論

3.1 大葉千斤拔的遺傳多樣性

本研究利用11條ISSR引物從大葉千斤拔7個居群的135個樣品中共檢測到97個位點，其中92個是多態(tài)性位點。在物種水平上，Nei’s基因多樣性指數(He)為0.281 5，高于雙子葉植物的平均值(He = 0.191)(Nybom & Bartish，2004；Nybom，2000)，表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性，但在居群平均水平上He為0.179 4，相對較低。物種水平上的遺傳多樣性較高，可能是由于大葉千斤拔分布于物種多樣性豐富的熱帶和亞熱帶地區(qū)，生境差別較大，有利于多樣性的形成。廣布種比狹布種分布的物種具有更高的遺傳多樣性，物種分布的地理范圍與遺傳多樣性緊密相關，物種分布越廣泛，其遺傳多樣性越豐富(Hamrick et al，1991；Hamrick & Godt，1989)。本文云南野生大葉千斤拔的PPL= 94.85%，Na = 1.948 5，He = 0.281 5，Gst = 0.397 5，大葉千斤拔的多態(tài)位點百分率(PPL)，基因多樣性指數(He)及遺傳分化系數(Gst)均明顯偏高，說明大葉千斤拔具有較高的遺傳多樣性，這可能與大葉千斤拔是多年生植物，花期長，異花傳粉的習性，有利于基因間的交流有關。在大葉千斤拔各居群中，勐臘易武(MY)居群的遺傳多樣性最高，多態(tài)性位點百分率PPL為62.89%，He為0.247 5，推測該居群是云南南部大葉千斤拔較早的分布中心。象明和易武都屬勐臘地區(qū)，但象明居群(XM)的多態(tài)位點百分率PPL僅為38.14%，He僅為0.148 5，產生這么大差異的原因可能是由于云南特殊的地理位置，復雜的山川所致。

表 5　大葉千金拔7個居群間的Nei′s(1978)遺傳一致度 (I) 和遺傳距離 (D)Table 5　Nei’s(1978) genetic identity and genetic distance of 7 Flemingia populations

注：Nei’s遺傳一致度 (對角線上) 和遺傳距離 (對角線下)。

Note：Nei’s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal).

圖 2　大葉千斤拔居群間的Nei’s遺傳一致度UPGMA聚類圖Fig. 2　UPGMA dendrogram for 7 Flemingia populations based on Nei’s genetic identity

3.2 大葉千斤拔的遺傳結構

大葉千斤拔的遺傳變異分析結果表明，居群內的遺傳變異(60.25%)大于居群間的變異(39.75%)，遺傳變異主要發(fā)生在居群內，推斷可能在居群內存在一定的基因交流障礙，由于海拔、降雨量和地理環(huán)境等因素的影響。因此，在進行大葉千斤拔的就地或遷地保護時，應注意考慮同一居群內的不同種質資源。大葉千斤拔居群間的基因流Nm為0.758 0 < 1，顯示居群間也存在著一定的基因交流障礙，這很可能由于云南的地理環(huán)境和氣候條件形成。大葉千斤拔的聚類分析表明(圖2)，7個大葉千斤拔居群大致可以分為兩大支，即瀾滄、寧洱、丘北為一支；玉溪楊武、為一支。地理距離較遠的居群，如丘北與瀾滄和寧洱，玉溪楊武與象明、勐臘易武和景洪嘎灑，在親緣關系上卻較近，可能與云南地區(qū)的特殊地理環(huán)境和氣候條件有或人為因素有關。象明和易武居群在地理距離和親緣關系都較近，建議在進行種質資源收集時，可作為一個地點進行樣品采集。

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Analysis of genetic diversity of Flemingia macrophylla resources from South Yunnan by ISSR

WANG Gui-Juan*，XIAO Wen-Xiang，TANG Shou-Xian

( Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Mengla 666303, China )

The genetic diversity of 135 individuals collected from 7 wild populations ofFlemingiamacrophyllawas estimated using ISSR method. An high level of genetic diversity was detected in wild populations ofF.macrophyllafrom South Yunnan Province. At species level, the percentage of polymorphic lociPPL= 94.85%, effective number of allelesNe = 1.462 7, Nei’s gene diversityHe = 0.281 5, and Shannon’s information indexHo = 0.433 7; at population level,PPL= 43.44%,Ne = 1.298 1, Nei’s gene diversityHe = 0.170 4, and Shannon’s in formation indexHo = 0.249 9. The level of genetic differentiation (39.75%) among populations is lower than that within populations (60.25%). Based on the results, we suggest that the protected areas ofF.macrophyllashould be build in MY, QB and NE because of the high level of genetic diversity.

Flemingiamacrophylla, genetic diversity, ISSR

10.11931/guihaia.gxzw201407050

2014-07-30

2015-01-31

中國科學院西雙版納熱帶植物園創(chuàng)新工程試點項目(0501073003)[Supported by Innovation Project Pilot Funding of Xishuangbana Tropical Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences(0501073003)]。

王桂娟(1974-)，女，內蒙古通遼人，碩士，實驗師，主要從事生物多樣性研究,(E-mail)wanggj@xtbg.org.cn。

Q949.7

A

1000-3142(2016)07-0812-06

王桂娟，肖文祥，唐壽賢. 云南南部野生大葉千斤拔資源遺傳多樣性的ISSR分析 [J]. 廣西植物，2016，36(7):812-817

WANG GJ，XIAO WX，TANG SX，et al. Analysis of genetic diversity ofFlemingiamacrophyllaresources from South Yunnan by ISSR [J]. Guihaia，2016，36(7):812-817