Ⅰ，Ⅱ期宮頸癌組織HIF-1α與COX-2蛋白共表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響及機(jī)制*

羅愛華，豐大利，付娟，李欣

（三峽大學(xué)第二人民醫(yī)院暨宜昌市第二人民醫(yī)院 腫瘤放化療科，湖北 三峽 443000）

?

Ⅰ，Ⅱ期宮頸癌組織HIF-1α與COX-2蛋白共表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響及機(jī)制*

羅愛華，豐大利，付娟，李欣

（三峽大學(xué)第二人民醫(yī)院暨宜昌市第二人民醫(yī)院 腫瘤放化療科，湖北 三峽 443000）

目的探討Ⅰ，Ⅱ期宮頸癌組織中HIF-1α與COX-2蛋白的共表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響及可能的機(jī)制。方法免疫組織化學(xué)法分析71例宮頸癌標(biāo)本的HIF-1α和COX-2的共表達(dá)情況；RT-PCR法檢測(cè)標(biāo)本中HIF-1α mRNA和COX-2 mRNA的表達(dá)水平。χ2檢驗(yàn)分析不同表達(dá)組患者1、2和3年存活率的差異；采用KM生存分析法了解不同表達(dá)組患者的存活時(shí)間的差異；采用相關(guān)分析了解蛋白及mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性。結(jié)果HIF-1α和COX-2共表達(dá)組患者的3年存活率低于非共表達(dá)組（P＜0.05）；HIF-1α和COX-2共表達(dá)組患者的存活時(shí)間低于非共表達(dá)組（P＜0.05）；在Ⅱ期患者中，HIF-1α的蛋白水平與COX-2 mRNA的水平正相關(guān)（rs=0.594，P＜0.05）。結(jié)論在Ⅰ，Ⅱ期宮頸癌中，HIF-1α和COX-2共表達(dá)組預(yù)后較差；HIF-1α蛋白可能正向調(diào)控COX-2 mRNA的表達(dá)。

宮頸癌；缺氧誘導(dǎo)因子1α；環(huán)氧合酶2；共表達(dá)；生存分析

缺氧是實(shí)體腫瘤形成的重要因素之一，在腫瘤形成時(shí)會(huì)造成正常血管壓迫或阻塞導(dǎo)致缺氧環(huán)境加重，但在缺氧微環(huán)境下惡性腫瘤仍可不斷生長(zhǎng)、浸潤(rùn)甚至發(fā)生轉(zhuǎn)移，說明腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力。缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）是1992年SEMENZA與WANG在低氧的肝癌細(xì)胞株Hep3 B細(xì)胞的核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)，由兩個(gè)亞基組成的異二聚體：HIF-1α和HIF-1β，都具有二聚化所需的堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic-helix-loop-helix，bHLH）和PAS（PERARNT-SIM）結(jié)構(gòu)域［1］。缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）既是HIF-1活性的調(diào)節(jié)亞基又是活性亞基，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一的一個(gè)特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子。已在多種惡性腫瘤及癌前病變中檢測(cè)到HIF-1α蛋白的過度表達(dá)，但正常組織及良性病變中則無表達(dá)。環(huán)氧合酶（Cyclooxygenase，COX，）是分解花生四烯酸（arachidonic acid，AA），生成各種內(nèi)源性前列腺素（Prostaglandins，PGs）過程中重要的限速酶。目前，人們認(rèn)為COX至少有3種形式：COX-1，COX-2，COX-3［2］。COX-2屬于反應(yīng)基因，在靜止細(xì)胞中不易被檢測(cè)到。COX-2呈誘導(dǎo)性表達(dá)，在大多數(shù)正常組織中表達(dá)極少，而當(dāng)細(xì)胞接受各種刺激如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、癌基因及促腫瘤劑的誘導(dǎo)后表達(dá)上調(diào)，參與炎癥及腫瘤的發(fā)生［3-5］。包括結(jié)腸癌［6］，肝癌［7-8］，胰腺癌［9］在內(nèi)的多種腫瘤組織均發(fā)現(xiàn)有COX-2的高表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)及RT-PCR方法檢測(cè)HIF-1α和COX-2的蛋白和mRNA表達(dá)水平。按蛋白表達(dá)情況分組，探討HIF-1α和COX-2共表達(dá)及非共表達(dá)組的生存率及生存時(shí)間的差異。探討HIF-1α蛋白水平和COX-2 mRNA水平的相關(guān)性，或COX-2蛋白水平和HIF-1αmRNA水平的相關(guān)性，明確HIF-1α和COX-2可能存在的調(diào)節(jié)關(guān)系。

1　資料與方法

1.1臨床資料

選取2003年9月～2012年2月確診并行手術(shù)治療的71例宮頸癌標(biāo)本。所有病例臨床資料完整，患者年齡23～77歲，平均年齡46.3歲。所有患者術(shù)前均未行放化療，術(shù)后病理類型均為鱗癌，分期為Ⅰb～Ⅱb期。術(shù)后行放療或放化療。

1.2HIF-1α和COX-2免疫組織化學(xué)檢測(cè)

1.2.1實(shí)驗(yàn)方法及步驟固定后洗滌、脫水、透明浸蠟包埋，5μm切片，60度30 min脫蠟2次。水化后抗原修復(fù)、阻斷、封閉。然后加一抗，HIF-1α多克隆抗體濃度為1∶400、COX-2多克隆抗體濃度為1∶150，上述一抗均購(gòu)自Abcam公司。4℃過夜，再加HRP標(biāo)記二抗40 min；DAB染色3～10 min，蘇木精復(fù)染，顯微鏡下觀察。

1.2.2免疫組織化學(xué)結(jié)果判定采用病理圖像系統(tǒng)分析每張切片隨機(jī)取3個(gè)高倍視野（10×20），HIF-1α按細(xì)胞核或細(xì)胞漿呈棕黃色染色為陽性；COX-2以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。免疫組織化學(xué)染色指數(shù)為染色面積與染色強(qiáng)度的乘積。

1.3RT-PCR檢測(cè)宮頸癌組織HIF-1αmRNA與COX-2 mRNA的表達(dá)情況

Trizol試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度（A260/250＞1.8）。取總RNA 5μg，按逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑說明完成cDNA的合成。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃、15 s、60℃、45 s循環(huán)40次。取2μl PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析，ABI Prism 7500 SDS Software。見表1。

表1　擴(kuò)增引物序列表

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用相關(guān)分析，生存分析采用Kaplan-Meier統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及COX回歸分析。

2　結(jié)果

2.1免疫組織化學(xué)結(jié)果

HIF-1α陽性表達(dá)的宮頸癌標(biāo)本細(xì)胞成團(tuán)分布，細(xì)胞質(zhì)濃染，呈棕黃色染色，見圖1。71例宮頸癌組織中41例HIF-1α陽性，陽性率57.8%。COX-2陽性表達(dá)的宮頸癌標(biāo)本細(xì)胞成團(tuán)分布，細(xì)胞質(zhì)濃染，呈棕黃色染色，見圖2。71例宮頸癌組織中53例COX-2陽性，陽性率74.6%。71例宮頸癌組織中HIF-1α與COX-2共表達(dá)33例，共表達(dá)率46.5%。

2.2HIF-1α和COX-2共表達(dá)對(duì)生存率的影響

根據(jù)HIF-1α和COX-2的表達(dá)情況分為4組：1組，HIF-1α 陰性，COX-2陰性組；2組，HIF-1α陰性，COX-2陽性組；3組，HIF-1α陽性，COX-2陰性組；4組，HIF-1α陽性，COX-2陽性組。各組的存活率見表2，經(jīng)χ2檢驗(yàn)各組3年存活率有顯著性差異，P＜0.05。經(jīng)行×列χ2分割分析，HIF-1α和COX-2共表達(dá)組即4組的3年存活率顯著低于另外3組，Pearsonχ2=7.289，P=0.007；而非共表達(dá)的3組間3年存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3生存時(shí)間的影響因素

根據(jù)HIF-1α和COX-2的表達(dá)情況分為4組：1組，HIF-1α陰性，COX-2陰性組；2組，HIF-1α陰性，COX-2陽性組；3組，HIF-1α陽性，COX-2陰性組；4組，HIF-1α陽性，COX-2陽性組。以上4組K-M生存曲線見圖3，Breslowχ2=9.845，P=0.02，提示按免疫組織化學(xué)不同分組的生存分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。按患者年齡分組，以45歲為劃分標(biāo)準(zhǔn)，按年齡＜45歲組與齡≥45歲組對(duì)生存生存時(shí)間的影響，做Kaplan-Meier統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Breslowχ2=0.027，P=0.870，提示不同年齡分組的生存分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。按患者臨床分期進(jìn)行Kaplan-Meier統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，了解臨床分期對(duì)患者生存時(shí)間的影響，Breslow χ2=8.482，P=0.014，提示不同臨床分期的生存分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用COX回歸模型分析影響患者生存分布的危險(xiǎn)因素。多因素回歸分析提示患者臨床分期及HIF-1α和COX-2免疫組織化學(xué)表達(dá)情況分別是獨(dú)立的預(yù)后因素，見表3。

2.4HIF-1α和COX-2 mRNA的表達(dá)情況

HIF-1αmRNA和COX-2 mRNA的擴(kuò)增動(dòng)力曲線見圖4。COX-2 mRNA在宮頸癌組織中的表達(dá)水平與分期有關(guān)，Ⅱ期宮頸癌組織的表達(dá)水平顯著高于Ⅰ期宮頸癌患者。

2.5HIF-1α蛋白水平和COX-2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

免疫組織化學(xué)指數(shù)反映蛋白的表達(dá)水平，mRNA含量反應(yīng)了mRNA的表達(dá)水平。在Ⅱ期宮頸癌中，HIF-1α蛋白水平和COX-2 mRNA的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，r=0.594，P＜0.05。而在Ⅰ期宮頸癌組織中兩者相關(guān)性不明顯。可能與Ⅱ期宮頸癌組織乏氧狀況更明顯有關(guān)。

圖1　HIF-1α陽性表達(dá)情況 （SP×200）

圖2　COX-2陽性表達(dá)情況 （SP×200）

表2　各組存活率的比較

表3　COX模型篩選的危險(xiǎn)因素及參數(shù)估計(jì)

圖3　不同免疫組織化學(xué)分組的Kapplan-meire生存曲線

圖4　mRNA擴(kuò)增動(dòng)力曲線

3　討論

惡性實(shí)體腫瘤由于增長(zhǎng)迅速，經(jīng)常會(huì)常出現(xiàn)缺氧的微環(huán)境，缺氧是惡性腫瘤治療效果差，容易出現(xiàn)放化療耐受性的常見原因之一。CHOI等［10］認(rèn)為在腫瘤發(fā)生早期即可發(fā)生HIF-1的過度表達(dá)，并且HIF-1的過度表達(dá)與腫瘤血管形成、侵襲轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。正常氧分壓下，細(xì)胞內(nèi)HIF-1α不穩(wěn)定，經(jīng)泛素一蛋白酶體等途徑迅速降解。缺氧時(shí)，胞質(zhì)中HIF-1α穩(wěn)定性增加，降解受阻，積聚增多并轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，與核內(nèi)的HIF-β結(jié)合成二聚體，形成有活性的HIF-1，繼而與缺氧反應(yīng)基因結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄過程，引起一系列的細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)［11］。迄今為止，確定的受HIF-1調(diào)控的缺氧反應(yīng)基因有70多種［12］。該產(chǎn)物涉及參與腫瘤細(xì)胞的能量代謝、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、耐藥及血管擴(kuò)張、血管新生等多個(gè)方面。COX-2屬于反應(yīng)基因，在靜止細(xì)胞中不易被檢測(cè)到。COX-2在上皮組織癌（包括胃癌、直結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、頭頸部腫瘤等）中普遍存在過度表達(dá)現(xiàn)象，并影響患者的預(yù)后［13］。COX-2介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)涉及腫瘤血管新生、細(xì)胞的增殖和凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移，細(xì)胞黏附和腫瘤侵襲等。有資料顯示HIF-1α，COX-2表達(dá)情況與患者預(yù)后有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)資料顯示，HIF-1α和COX-2共表達(dá)組的1年，2年，3年存活率均低于非共表達(dá)組；HIF-1 α和COX-2共表達(dá)組的存活時(shí)間顯著低于非共表達(dá)組，并且HIF-1α和COX-2共表達(dá)可以作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素。兩者共表達(dá)預(yù)后較差，可能與兩者共同促進(jìn)腫瘤的惡性行為有關(guān)。

對(duì)于HIF-1α和COX-2的關(guān)系，STASINOPOULOS等［14］認(rèn)為COX-2可通過其催化產(chǎn)物PGE2激活HIF-1α活性以促進(jìn)腫瘤血管生成。TAMMALI等［15］提出COX-2/PGE2/HIF-1α/VEGF途徑可能是COX-2促進(jìn)腫瘤血管生成的又一條途徑。LIM等［16］通過研究發(fā)現(xiàn)，COX-2選擇性抑制劑NS398通過COX-2/PGE2途徑抑制HIF-1αmRNA的表達(dá)，減少HIF-1α的合成，從而抑制缺氧誘導(dǎo)的血管生成。JUNG等［17］的研究顯示，HIF-1是關(guān)聯(lián)炎癥和癌變過程的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子，IL-1誘導(dǎo)活化NFKB/COX-2途徑，上調(diào)HIF-1α蛋白的表達(dá)，并最終上調(diào)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成。STASINOPOULOS等［14］發(fā)現(xiàn)PGE-2可以增強(qiáng)絲裂原活化激酶（MAPK）的活性，從而加速HIF-1α翻譯轉(zhuǎn)錄和在核內(nèi)的積聚。上述研究均表明，COX-2可調(diào)控HIF-1α蛋白的表達(dá)。但也有學(xué)者持不同意見，認(rèn)為COX-2是HIF-1α下游的靶基因之一，受缺氧的誘導(dǎo)活化［18］。CSIKI等［19］的最新的研究通過對(duì)缺氧反應(yīng)基因序列的比較，COX-2啟動(dòng)子缺失分析和定向誘變，證實(shí)在COX-2啟動(dòng)子內(nèi)存在缺氧反應(yīng)元件（hypoxia-responsive element，HRE），通過其與HIF-1α的結(jié)合，激活肺癌細(xì)胞中COX-2的表達(dá)。本組資料顯示，HIF-1α和COX-2 mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.594，P＜0.05），因此可以推斷，COX-2 mRNA的表達(dá)受HIF-1α水平的調(diào)控。HIF-1α可能通過與COX-2啟動(dòng)子內(nèi)存在缺氧反應(yīng)元件（HRE）結(jié)合，促進(jìn)COX-2的轉(zhuǎn)錄。從而認(rèn)為COX-2是HIF-1α下游的靶基因之一。HIF-1α蛋白可能正向調(diào)控COX-2 mRNA的表達(dá)。

［1］OGAWA，KAZUHIKO，CHIBA，et al.Clinical significance of hiflalpha expression in patients with esophageal cancer treated with concurrent chemoradiotherapy［J］.Anticancer Research，2011，31（6）: 2351-2359.

［2］STASINOPOULOS I，SHAH T，PENET M F，et al.COX-2 in cancer:Gordian knot or Achilles heel［J］.Frontiers in Pharmacology，2013，4:1-7.

［3］PENG L，PENG Z，XIN L，et al.Micro ribonucleic acid（RNA）-101 inhibits cell proliferation and invasion of lung cancer by regulating cyclooxygenase-2［J］.Thoracic Cancer，2015，6（6）:778-784.

［4］YONG P，YAN J，LIN T，et al.Deletion of cyclooxygenase-2 inhibits K-ras-induced lung carcinogenesis［J］.Oncotarget，2015，6（36）:38816-38826.

［5］TOOMEY D P，MURPHY J F，CONLON K C.COX-2，VEGF and tumour angiogenesis［J］.Surgeon Journal of the Royal Colleges of Surgeons of Edinburgh&Ireland，2009，7（7）:174-180.

［6］WU Q B，SUN G P.Expression of COX-2 and HER-2 in colorectal cancer andtheir correlation［J］.World Journal of Gastroenterology，2015，21（20）:6206-6214.

［7］OU C，ZHENG H P，SU J J，et al.Effect of Ginkgo biloba extract on the expressions of Cox-2 and GST-Pi in rats with hep atocellular carcinoma risk［J］.African Health Sciences，2014，14（1）: 37-48.

［8］YANG Y，ZHU J，GOU H，et al.Clinical significance of Cox-2，survivin and Bcl-2 expression in hepatocellular carcinoma（HCC）［J］. Medical Oncology，2011，28（3）:796-803.

［9］MA J X，SUN Y L，WANG Y Q，et al.Triptolide induces apoptosis and inhibits the growth and angiogenesis of human pancreatic cancer cells by downregulating COX-2 and VEGF［J］.Oncology Research Featuring Preclinical&Clinical Cancer Therapeutics，2013，20（8）:359-368.

［10］CHOI J Y，JANG Y S，MIN S Y，et al.Overexpression of MMP-9 andHIF-1alpha in breast cancer cells under hypoxic conditions［J］.Journal of Breast Cancer，2011，14（2）:88-95.

［11］SHEN R J，JIANG X Y，PU J W，et al.HIF-1 alpha and-2 alpha genes in a hypoxia-sensitive teleost species megalobrama amblycephala:cDNA cloning，expression and different responses to hypoxia.［J］.Comparative Biochemistry&Physiology Part B Biochemistry&Molecular Biology，2010，157（3）:273-280.

［12］MASOUD G N，WEI L.HIF-1α pathway:role，regulation and intervention for cancer therapy［J］.Acta Pharmaceutica Sinica B，2012，3（12）:53-54.

［13］JANA D，SARKAR D K，GANGULY S，et al.Role of cyclooxygenase 2（COX-2）in prognosis of breast cancer［J］.Indian Journal of Surgical Oncology，2014，5（1）:59-65.

［14］STASINOPOULOS I，O'BRIEN D Z.Inflammation，but not hypoxia，mediated HIF-1alpha activation depends on COX-2.［J］. Cancer Biology&Therapy，2009，8（1）:31-35.

［15］TAMMALI R，SAXENA A，SRIVASTAVA S K，et al.Aldose reductase inhibition prevents hypoxia-induced increase in hypoxia-inducible factor-1alpha（HIF-1alpha）and vascular endothelialgrowthfactor（VEGF）byregulating26Sprotea some-mediated protein degradation in human colon cancer cells.［J］. Journal of Biological Chemistry，2011，286（27）:24089-24100.

［16］LIM W，RARK C，SHIM M K，et al.Glucocorticoids suppress hypoxia-induced COX-2 and hypoxia inducible factor-1α expression through the induction of glucocorticoid-induced leucine zipper［J］.BritishJournalofPharmacology，2014，171（3）: 735-745.

［17］JUNG Y J，ISAACS J S，LEE S，et al.IL-1 beta-mediated up-regulation of HIF-1 alpha via an NF kappa B/COX-2 pathway identifies HIF-1 as a critical link between inflammation and oncogenesis［J］.Faseb Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology，2003，17（14）:2115-2117.

［18］LEE J J，MITSUTERU N，SHINYA O，et al.Hypoxia activates the cyclooxygenase-2-prostaglandin E synthase axis［J］.Carcinogenesis，2010，31（3）:427-34.

［19］CSIKI I，YANAGISAWA K，HARUKI N，et al.Thioredoxin-1 modulatestranscriptionofcyclooxygenase-2viahypoxia-inducible factor-1 in non-small cell lung cancer［J］.Cancer Research，2006，66（1）:143-150.

（張蕾編輯）

Influence of the coexpression of HIF-1α and COX-2 on prognosis of patients with cervical cancer in stageⅠand stageⅡand possible functional mechanism*

Ai-hua Luo，Da-li Feng，Juan Fu，Xin Li
（Department of Chemo-irradiation Oncology，Yichang Second People's Hospital，Yichang，Hubei 443000，China）

Objective To investigate the influence of the coexpression ofHIF-1αandCOX-2on the prognosis of patients with cervical cancer in stageⅠ and stageⅡ and the possible functional mechanism.Methods The coexpressions ofHIF-1αandCOX-2were detected in 71 cases with cervical cancer by immunohistochemical.The levels ofHIF-1αmRNA andCOX-2mRNA were detected by RT-PCR.Chi-squared test was used to analyze the differences of survival rate from one year to three year in different groups；KM survival analysis was used for the survival time in different groups；correlation analysis was used to analyze the correlation between protein and mRNA level.Results The survival rate of three year in the group of coexpression ofHIF-1αandCOX-2was significantly lower than that in the non-coexpression group（P＜0.05）.The survival time in the group of coexpression ofHIF-1α andCOX-2was significantly shorter than that in the non-coexpression group（P＜0.05）.There was a positive correlation between theHIF-1αprotein level and theCOX-2mRNA level in the patients with cervical cancer in stageⅡ（rs=0.594，P＜0.05）.Conclusions The prognosis is poorer in the group of coexpression ofHIF-1αand COX-2of patients with cervical cancer in stageⅠ and stageⅡ than the non-coexpression group.TheHIF-1αprotein may upregulate the level ofCOX-2mRNA.

cervical cancer；HIF-1α；COX-2；coexpression；survival analysis

R737.33

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.16.014

1005-8982（2016）16-0067-05

2016-04-14

宜昌市醫(yī)療衛(wèi)生科研項(xiàng)目（No：A14301-31）［通信作者］李欣，E-mail：lixinyc5189@163.com