排石沖劑對高齡腎結(jié)石大鼠TGF-β1、KIM-1表達的影響*

羅俊華　魏金霞（廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院，湖北 武漢430070）

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排石沖劑對高齡腎結(jié)石大鼠TGF-β1、KIM-1表達的影響*

羅俊華魏金霞
（廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院，湖北 武漢430070）

目的 觀察排石沖劑對高齡腎結(jié)石大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、腎損傷分子（KIM-1）表達的影響。方法 將40只雄性高齡Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組、枸櫞酸鉀組和排石沖劑組，每組10只。采用1%乙二醇自由飲水和2%氯化銨灌胃建立大鼠草酸鈣腎結(jié)石模型，同時各組給予相應藥物，觀察大鼠一般情況、體質(zhì)量、24 h尿量，顯微鏡下觀察腎組織切片中草酸鈣結(jié)晶沉積，并采用酶聯(lián)免疫吸附法及免疫組化法檢測外周血及腎組織中TGF-β1、KIM-1的水平。結(jié)果 4周末大鼠24 h尿量比較，枸櫞酸鉀組和排石沖劑組均高于正常組和模型組（P＜0.05）；枸櫞酸鉀組與排石沖劑組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。枸櫞酸鉀組和排石沖劑組草酸鈣結(jié)晶評分均高于正常組，低于模型組（P＜0.05）；排石沖劑組結(jié)晶評分低于枸櫞酸鉀組（P＜0.05）。枸櫞酸鉀組、排石沖劑組血清及腎組織TGF-β1、KIM-1水平明顯低于模型組（P＜0.05）。與枸櫞酸鉀組比較，排石沖劑組血清及腎組織TGF-β1、KIM-1水平顯著下降（P＜0.05）。結(jié)論 排石沖劑能有效減少高齡腎結(jié)石大鼠TGF-β1、KIM-1的產(chǎn)生，減輕腎臟氧化應激及炎癥損傷，抑制結(jié)石形成。

排石沖劑尿路結(jié)石轉(zhuǎn)化生長因子β1腎損傷分子

【Abstract】Objective：To investigate the effects of Paishi Granule on TGF-β1 and KIM-1 in elderly rats with renal calcium oxalate stone.Methods：A total of 40 SPF level elderly male Wistar rats were separated into 4 groups by random number table methods，including the normal group，the model group，Potassium citrate-treated group and Paishi granule-treated group（n=10 for each）.The rat model of renal calcium oxalate stone was induced by intragastrically administrated 2%ammonium chloride（AC），together with 1%ethylene glycol（EG）for free drink.At the same time，each group was treated with corresponding drugs.Individual weight and urine volume were recorded.The paraffin sections of kidney were prepared for observing the calcium oxalate deposit under the microscope.The levels of TGF-β1and KIM-1 in peripheral blood and renal tissues were detected by enzymelinked immunosorbent assay and immunohistochemistry.Results：24 h urine volumes in Potassium citrate-treated group and Paishi granule-treated group were significantly higher than those in normal group and model group（P＜0.05），despite a non-significant difference between Potassium citrate-treated group and Paishi Granule group（P＞0.05）.The scores of calcium oxalate crystallization in the two treated groups were significantly higher than that in the normal group，conversely，lower than the model group（P＜0.05）.Furthermore，the score in Paishi granuletreated group was lower than that in Potassium citrate-treated group（P＜0.05）.The levels of TGF-beta 1 and KIM-1 in serum and renal tissue of Potassium citrate group and Paishi Granule group were significantly lower than those in the model group（P＜0.05）.Compared with those in potassium citrate group，The levels of TGF-beta 1 and KIM-1 of Paishi Granule group were significantly decreased（P＜0.05）.Conclusion：Paishi granule can reduce the produce of TGF-β1 and KIM-1 in elderly rats with renal calcium oxalate stone，reduce renal oxidative stress and inflammatory damage，and inhibit the formation of stones.

【Key words】Paishi Granule；Urinary calculi；TGF-β1；KIM-1

尿路結(jié)石是臨床常見病、多發(fā)病，全球患病率為1%～20%，我國為0.12%～6.02%。近二十多年來，微創(chuàng)外科技術(shù)在臨床應用較廣泛，但存在操作復雜、費用高、治療不徹底、對腎組織有損傷、結(jié)石復發(fā)率高等弊端。尤其是高齡結(jié)石患者，上述弊端更明顯。中藥排石沖劑在臨床30余年的應用中，取得了顯著療效［1］。筆者前期研究表明，排石沖劑可以顯著降低尿路結(jié)石患者血清MDA、8-OHdG水平，升高SOD水平［2］，其機理可能與排石沖劑能有效減輕機體氧化應激損傷有關(guān)。為進一步探討其作用機制，本實驗以高齡草酸鈣腎結(jié)石大鼠為模型，觀察了排石沖劑對大鼠血清及腎組織轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、腎損傷分子（KIM-1）表達的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物SPF級健康雄性Wistar大鼠40只，周齡18～20周，體質(zhì)量（200±20）g，購自湖北省實驗動物研究中心，實驗動物使用許可證號：SCXK（鄂）2011-0003。

1.2藥物與試劑排石沖劑由湖北省中醫(yī)院制劑中心提供，組成：金錢草30 g，海金沙15 g，雞內(nèi)金15 g，王不留行15 g，滑石15 g，生牡蠣10 g，冬葵子15 g，白芍15 g，甘草5 g，石韋20 g，川楝子15 g等。TGF-β1、KIM-1酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒及 TGF-β1、KIM-1免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物工程公司。

1.3造模及給藥40只Wistar大鼠在恒溫自然晝夜光照的環(huán)境中，適應性飼養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法分為4組，每組10只。正常組：給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，每日2 mL；模型組：給予1%乙二醇自由飲水和2%氯化銨溶液灌胃（成石劑）［3-5］，每日2 mL；枸櫞酸鉀組：給予成石劑及25%枸櫞酸鉀溶液灌胃，每日2 mL；排石沖劑組：給予成石劑及排石沖劑配成1.2 g/mL的混懸液灌胃，每日2 mL。各組大鼠均在相同條件下飼養(yǎng)，實驗周期為4周（用1%乙醇自由飲水和2%氯化銨灌胃造腎結(jié)石模型的預實驗，均造模成功。因本研究旨在觀察排石沖劑對結(jié)石的預防作用，故造模和治療同時進行）。

1.4標本采集及檢測各組實驗結(jié)束時，將大鼠置于代謝籠，收集24 h尿液并計量，加防腐劑 （甲苯，用量1.0～2.0 mL甲苯/100 mL尿液），4℃保存?zhèn)溆茫粚⒋笫蠓Q質(zhì)量后，10%水合氯醛按0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動脈采集血液標本，靜置離心后，留取淡黃色上清液（血清）備用；取左腎置4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，作常規(guī)切片（厚度為2 μm）。

1.4.1一般情況觀察大鼠的體毛、小便、體質(zhì)量、飲食、精神及活動情況等。

1.4.2血清TGF-β1、KIM-1檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測 （均按試劑盒說明操作），腎組織TGF-β1、KIM-1采用免疫組化法測定（均按試劑盒說明操作）。

1.4.3腎臟結(jié)晶沉淀檢測石蠟切片分別做HE染色和Von Kossa染色。每只大鼠選取5張切片，于每張切片腎皮質(zhì)處隨機選5個視野，觀察草酸鈣結(jié)晶，以每個視野的平均值來表示該片的結(jié)晶，按形態(tài)分級評分法進行評分［6］：0分=無結(jié)晶；1分=有散在的結(jié)晶亮點；2 分=廣泛的不成堆或局限結(jié)晶；3分=有成堆結(jié)晶散在不連接；4分=結(jié)晶成堆且互相連接；5分=廣泛成堆結(jié)晶，連接成片。

1.5統(tǒng)計學處理應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，結(jié)晶評分組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗，兩兩比較采用Nemenyi檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)　果

2.1各組一般情況見表1。正常組、模型組、枸櫞酸鉀組和排石沖劑組大鼠造模前4周毛色、小便、體質(zhì)量、食欲、活動均未見明顯變化；模型組第3周后大鼠出現(xiàn)毛色雜亂，食欲減退，飲水減少，尿量減少，精神倦怠，活動度減少。而枸櫞酸鉀組和排石沖劑組大鼠，尿量增加，精神狀況良好，飲食活動基本正常。4組大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。4組大鼠24 h尿量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；枸櫞酸鉀組和排石沖劑組均高于正常組和模型組（P＜0.05）；枸櫞酸鉀組與排石沖劑組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1　各組大鼠體質(zhì)量及24 h尿量比較（±s）

表1　各組大鼠體質(zhì)量及24 h尿量比較（±s）

與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組　別　n　體質(zhì)量（g）　24 h尿量（mL）正常組　10　201±18　15.3±0.6模型組　10　180±20　14.5±4.9枸櫞酸鉀組　10　192±16　20.4±6.3*△排石沖劑組　10　195±16　23.1±5.8*△

表2　各組大鼠血清TGF-β1、KIM-1水平比較（±s）

表2　各組大鼠血清TGF-β1、KIM-1水平比較（±s）

與枸櫞酸鉀組比較，▲P＜0.05。下同。

組　別　n　TGF-β1（μg/mL）　KIM-1（ng/mL）正常組　10　1.52±0.36　4.32±1.41模型組　10　4.52±0.61**　12.84±3.22**枸櫞酸鉀組　10　2.88±0.34*△　8.63±2.11*△排石沖劑組　10　1.95±0.21*△▲　5.86±1.64*△▲

2.2各組大鼠血清中TGF-β1、KIM-1水平的比較見表2。4周末時，模型組、枸櫞酸鉀組、排石沖劑組大鼠血清TGF-β1、KIM-1水平均高于正常組 （P＜0.01 或P＜0.05）。枸櫞酸鉀組、排石沖劑組血清TGF-β1、KIM-1水平明顯低于模型組（P＜0.05）。與枸櫞酸鉀組比較，排石沖劑組血清TGF-β1、KIM-1水平顯著下降（P＜0.05）。

2.3排石沖劑對腎組織TGF-β1、KIM-1水平的影響見表3。免疫組化結(jié)果顯示，正常組TGF-β1表達較少，模型組在腎小球系膜細胞、腎小管、腎間質(zhì)中均有明顯陽性表達（顯示結(jié)果為棕色區(qū)域），枸櫞酸鉀組和排石沖劑組較模型組輕，見圖1。正常組KIM-1在腎小管中表達較少，而模型組腎小管有陽性表達（顯示結(jié)果為棕色區(qū)域），枸櫞酸鉀組和排石沖劑組KIM-1表達較模型組明顯減少，見圖2。與模型組比較，排石沖劑組及枸櫞酸鉀組TGF-β1、KIM-1表達累積光密度值下降（P＜0.05），且排石沖劑組低于枸櫞酸鉀組（P＜0.05）。

2.4各組大鼠腎組織中結(jié)晶形成情況見表4。4組間結(jié)晶評分比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；其中，枸櫞酸鉀組和排石沖劑組草酸鈣結(jié)晶評分高于正常組，低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；排石沖劑組低于枸櫞酸鉀組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3　各組大鼠TGF-β1和KIM-1表達累積光密度定量比較（μm2，±s）

表3　各組大鼠TGF-β1和KIM-1表達累積光密度定量比較（μm2，±s）

組別　n　TGF-β1　KIM-1正常組　10　1498±110.5　28.8±6.4模型組　10　2060±152.7**　67.4±8.2**枸櫞酸鉀組　10　1780±98.6*△　38.6±5.1*△排石沖劑組　10　1640±82.1*△▲　31.6±4.4*△▲

圖1　各組大鼠腎組織TGF-β1的表達（SP法，200倍）

圖2　各組大鼠腎組織KIM-1的表達（SP法，200倍）

表4　各組大鼠腎組織草酸鈣結(jié)晶評分比較（±s）

表4　各組大鼠腎組織草酸鈣結(jié)晶評分比較（±s）

組別　n 結(jié)晶評分正常組　10模型組　10枸櫞酸鉀組　10 0.13±0.11 3.24±1.67*1.52±1.04*△排石沖劑組　100.42±0.26*△▲

3　討　論

尿路結(jié)石屬于中醫(yī)“石淋”“砂淋”“腰痛”等范疇。以清熱利濕活血法治療尿路結(jié)石的新型純中藥制劑排石沖劑［7］，全方組成包括金錢草、海金沙、雞內(nèi)金、王不留行、滑石、生牡蠣、冬葵子、白芍、甘草、石韋、川楝子，已在臨床應用30余年。前期臨床研究表明：排石沖劑治療尿路結(jié)石總有效率86%，能有效提高結(jié)石排出率，縮短結(jié)石排出時間，改善臨床癥狀及陽性體征，無毒副作用［1］。

尿路結(jié)石80%為含鈣結(jié)石，其中又以草酸鈣為主要成分，占到80%［8］。草酸不僅以草酸鈣結(jié)晶的形式參與結(jié)石的形成，而且高濃度的草酸、草酸鈣晶體會誘導腎上皮細胞氧化應激及炎癥損傷，損傷的腎上皮細胞為結(jié)石晶體的黏附提供了條件，同時產(chǎn)生的細胞碎片促進草酸鈣結(jié)晶的核化和聚集。因此腎上皮細胞氧化應激及炎癥損傷是結(jié)石形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［9-10］，也是結(jié)石容易復發(fā)的原因之一。我們前期研究表明排石沖劑能有效防治尿路結(jié)石，其機理可能與排石沖劑能有效減輕機體氧化應激損傷有關(guān)［2］。研究證實，草酸、草酸鈣結(jié)晶對腎上皮細胞氧化應激及炎癥損傷的機理主要包括：1）產(chǎn)生大量TGF-β1，激活NADPH氧化酶，誘導大量活性氧簇（ROS），引起谷胱甘肽（GSH）氧化-還原失衡，導致腎上皮細胞自身凋亡、壞死［11-12］。2）激活NF-κB等，誘發(fā)腎臟上皮細胞產(chǎn)生一系列細胞因子，如KIM-1等，引發(fā)自身的炎癥反應［13-14］。3）激活腎素、血管緊張素系統(tǒng)，加重氧化應激損傷及炎癥反應等［15］。由此，本實驗以高齡草酸鈣腎結(jié)石大鼠為模型，觀察排石沖劑對TGF-β1、KIM-1表達的影響，來進一步探討排石沖劑治療尿路結(jié)石的作用機理。

本實驗腎組織病理切片顯示模型組、枸櫞酸鉀組和排石沖劑組大鼠腎臟內(nèi)均有不同程度的草酸鈣結(jié)晶，說明制作草酸鈣結(jié)石大鼠模型是成功的。排石沖劑組草酸鈣結(jié)晶數(shù)量明顯低于模型組（P＜0.05），草酸鈣結(jié)晶在腎臟的沉積面積明顯縮小，腎小管水腫明顯改善，而且觀察到排石沖劑組大鼠一般情況明顯好于模型組，說明排石沖劑能有效防治尿路結(jié)石，并改善腎功能。本實驗結(jié)果進一步顯示模型組、枸櫞酸鉀組、排石沖劑組大鼠血清及腎組織TGF-β1、KIM-1水平均高于正常組（P＜0.05或P＜0.01），提示結(jié)石形成與腎氧化應激及炎癥損傷密切相關(guān)，這與以往的研究報道一致。同時研究結(jié)果還表明排石沖劑組大鼠血清及腎組織TGF-β1、KIM-1水平明顯低于模型組（P＜0.05），說明排石沖劑能減少機體TGF-β1、KIM-1的產(chǎn)生，從而維持GSH氧化-還原平衡，有效減輕腎臟氧化應激及炎癥損傷，抑制結(jié)石形成。

綜上所述，腎臟氧化應激及炎癥損傷在腎結(jié)石發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，排石沖劑能有效減少高齡腎結(jié)石模型的TGF-β1、KIM-1的產(chǎn)生，減輕腎臟氧化應激及炎癥損傷，為該方能更廣泛應用于高齡尿路結(jié)石患者，提供必要的理論依據(jù)。

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Effects of Paishi Granule on TGF-β1 and KIM-1 in Elderly Rats with Renal Calcium Oxalate Stone

LUO Junhua，WEI Jinxia.Wuhan General Hospital of PLA Guang-zhou Military Command，Hubei，Wuhan 430070，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）05-0842-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.027

武漢總醫(yī)院青年基金項目（YZ201524）

2016-01-11）