新醫(yī)學(xué)時(shí)代：治療性基因組編輯

李升偉/編譯

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新醫(yī)學(xué)時(shí)代：治療性基因組編輯

李升偉/編譯

1901年，阿奇博爾德·加洛德爵士鑒定出已知的第一種人體遺傳疾病尿黑酸尿癥。今天我們認(rèn)識(shí)到，至少有8 000種人體疾病是由單個(gè)基因突變引起的，稱為單基因病，其數(shù)目幾乎每天都在增加。這些疾病在美國(guó)被分類為“罕見病”，因?yàn)樗鼈兊氖芾廴巳憾忌儆?0萬(wàn)人，而在全球范圍它們則可能累及4億人口。一些疾病，如鐮刀細(xì)胞病，全球累及數(shù)千萬(wàn)人口，而在世界的特定區(qū)域它只能分類為“罕見”，包括美國(guó)、歐洲和亞洲的遠(yuǎn)東地區(qū)。對(duì)于少數(shù)病人，同種異體造血干細(xì)胞移植（allo-HSCT）或者實(shí)體器官移植可用來(lái)治愈其遺傳性疾?。粚?duì)于絕大多數(shù)病人來(lái)說，沒有治療手段，最多進(jìn)行一些癥狀管理。

使用基因組編輯治療單基因病從概念上來(lái)說是簡(jiǎn)單的——基因組編輯可以用來(lái)糾正致病的基因組“排版印刷”錯(cuò)誤?；蚪M編輯的力量在于，它可以提供一種機(jī)制來(lái)做比簡(jiǎn)單修飾單個(gè)核苷酸更多的事情。它是一種可以制造更復(fù)雜而細(xì)微的基因組改變的方法，可以被用來(lái)治療更為常見的疾病或修飾它們的成因。這篇綜述將介紹基因組編輯的基本戰(zhàn)略和工具，它們既可以拿來(lái)糾正印刷錯(cuò)誤也可以對(duì)基因組做出更為復(fù)雜的改變。還將討論基因組編輯是如何被研發(fā)用以治療遺傳性疾病、傳染性疾病和獲得性疾病的。最后，簡(jiǎn)要討論圍繞基因組編輯應(yīng)用的技術(shù)問題：從可能導(dǎo)致工程化遺傳改變到可能從一代傳到下一代。

基因組編輯工具箱

基因組編輯又稱為基因打靶，是科學(xué)家手中一種強(qiáng)有力的研究工具?；虼虬性诮湍钢泻苋菀走M(jìn)行，酵母即成為研究人體病理生理學(xué)的一種重要模式生物體?；虼虬凶鳛橐环N研究工具，其重要性進(jìn)一步彰顯，在于2007年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予了奧利弗·史密斯和馬里奧·卡佩奇博士，以表彰他們對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞基因打靶的發(fā)展及對(duì)小鼠的后續(xù)精準(zhǔn)遺傳工程研究。這是人體病理生理學(xué)領(lǐng)域的轉(zhuǎn)折性進(jìn)步。在基因治療（研究）的最早期，人們就認(rèn)識(shí)到基因組編輯可以成為治愈遺傳疾病的理想方法，但是最早的研究中，通過在人體體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組來(lái)進(jìn)行基因糾正的絕對(duì)頻率低下（10-6），讓人們頗感困惑。關(guān)鍵的突破是發(fā)現(xiàn)了在靶基因內(nèi)構(gòu)建一種位點(diǎn)特異性DNA雙鏈折斷（DSB），有可能通過同源重組刺激基因組編輯提升2～5個(gè)數(shù)量級(jí)，提供出5%或更多的總體頻率。除了通過同源重組刺激基因打靶可以提高5個(gè)數(shù)量級(jí)，一種位點(diǎn)特異性DSB可能刺激突變，比如引起DSB位點(diǎn)上的微小插入/缺失提高達(dá)9個(gè)數(shù)量級(jí)。正因?yàn)槿绱?，DSB被認(rèn)定為基因組編輯研發(fā)中一個(gè)關(guān)鍵的原則。

基于核酸酶的基因組編輯基本過程是在基因組內(nèi)構(gòu)建一個(gè)位點(diǎn)特異性DSB，然后催動(dòng)細(xì)胞自己的內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制來(lái)修復(fù)折斷（圖1）。細(xì)胞可以使用兩種基本機(jī)理來(lái)修復(fù)折斷：非同源性末端連接（NHEJ）或同源重組（HR）。當(dāng)單個(gè)折斷的編輯因NHEJ而發(fā)生，就可以在折斷位點(diǎn)上構(gòu)建出插入/缺失之類的突變（圖1a）。缺失的尺寸趨向于大于插入的尺寸，當(dāng)染色體外DNA在折斷位點(diǎn)處被捕捉時(shí)例外（其發(fā)生率罕見但是可測(cè)量），這種時(shí)候可以發(fā)生數(shù)百堿基對(duì)的插入。當(dāng)使用捐贈(zèng)者的供體序列進(jìn)行HR而發(fā)生單個(gè)折斷的編輯時(shí)，會(huì)發(fā)生基因組內(nèi)的精準(zhǔn)核苷酸改變，從單個(gè)堿基長(zhǎng)度的插入到大型基因盒的導(dǎo)入。當(dāng)兩個(gè)折斷的編輯通過NHEJ而發(fā)生時(shí)，染色體缺失、倒轉(zhuǎn)或易位可以得到構(gòu)建（圖1b）。這些總體染色體重排可以有針對(duì)性地生成以供治療用，但是它們還必須得到評(píng)價(jià)，因?yàn)槿魏魏怂崦钙脚_(tái)都有產(chǎn)生脫靶效應(yīng)的潛能。

圖1.基于核酸酶的基因組編輯在基因組內(nèi)構(gòu)建了一種特異性雙鏈折斷（DSB），然后形成細(xì)胞自己的內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制來(lái)修復(fù)這種折斷

在證明了DSBs重要性的研究論文中，研究人員使用了一種人工系統(tǒng)，在其內(nèi)的天然歸巢核酸內(nèi)切酶（有時(shí)也稱為“大范圍核酸酶”）的靶位點(diǎn)ISceI被工程化進(jìn)入了體細(xì)胞的基因組內(nèi)；基因組編輯的頻率可以在該工程化的 I-SceI位點(diǎn)得到測(cè)度。高頻率編輯的障礙是，不論是I-SceI還是其他大范圍核酸酶都不能輕易地再工程化以識(shí)別基因組內(nèi)的天然靶部位。這個(gè)問題的第一種解決方法是已經(jīng)建立了的鋅指核酸酶（ZFNs），最初稱為“嵌合體限制酶”，后來(lái)被稱為“嵌合體核酸酶”。ZFNs是一類人工蛋白質(zhì)，其一種鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與衍生自IIS型FokI限制性核酸酶的非特異性核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生了融合。首先，在刺激人類體細(xì)胞內(nèi)基因打靶方面，工程化ZFNs被證明與I-SceI一樣有效。然后，因?yàn)殇\指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以被工程化以識(shí)別新的靶位點(diǎn)，基于ZFN的方案成為第一種用來(lái)刺激人類體細(xì)胞內(nèi)基因組編輯的方法，其（編輯）頻率可達(dá)到治療相關(guān)水平。與這項(xiàng)人類體細(xì)胞內(nèi)的研究工作相提并論的重要工作是德納·卡羅爾（Dana Carroll）及其同事們證明了ZFNs可以被用來(lái)編輯真核生物黑腹果蠅的復(fù)雜基因組，使用突變?cè)訬HEJ和同源重組方法均可。多年以來(lái)，碩果僅存的工程化核酸酶，在基因組編輯工具箱內(nèi)來(lái)說是ZFNs和再工程化大范圍核酸酶。但是，在過去5年中，TAL效應(yīng)物 核 酸 酶 （TALENs）、CRISPR/ Cas9核酸酶和雜交核酸酶平臺(tái)的研發(fā)與構(gòu)建已經(jīng)戲劇性地?cái)U(kuò)展了工程化核酸酶工具箱。

工程化核酸酶平臺(tái)有六種，四種是基本的、兩種是雜交的，它們是：工程化巨核核酸酶、ZFNs、TALENs、CRISPR/ Cas9核酸酶、巨大TAL核酸酶和Cas9-FokI核酸酶（表1）。這些核酸酶平臺(tái)之間都有細(xì)微的差異，例如，構(gòu)建起來(lái)的折斷類型是不同的：大范圍核酸酶和巨大TALs生成的是3′突出端的折斷；ZFNs構(gòu)建的是5′突出端的折斷；TALENs構(gòu)建的折斷在位置上是可變的，通常是（但不總是）5′突出端，由FokI核酸酶（Fn）的性能決定；而CRISPR/Cas9核酸酶構(gòu)建的是鈍的折斷。但總的來(lái)說，這些平臺(tái)中每一個(gè)都可以介導(dǎo)它們的編輯效用，是通過一種DSB的構(gòu)建實(shí)現(xiàn)的，因此它們共享了一種基礎(chǔ)性的作用機(jī)制。

表1.四種標(biāo)準(zhǔn)的核酸酶平臺(tái)的比較特征

NHEJ介導(dǎo)的基因組編輯所需要的唯一工具是一種工程化核酸酶，但是HR介導(dǎo)的基因組編輯還需要一種工程化的供體性載體。供體性載體可以被設(shè)計(jì)來(lái)使單個(gè)堿基對(duì)變化發(fā)生模板化擴(kuò)增或者將大型多基因盒插入到基因組內(nèi)。核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯的同源臂可以比鼠胚胎干細(xì)胞內(nèi)HR介導(dǎo)的基因打靶所要求的同源臂短許多：不再必須有10千堿基對(duì)或更長(zhǎng)，它們可以短至400堿基對(duì)。但是，如果將同源臂進(jìn)一步縮短至400堿基對(duì)以下，或?qū)p少總體編輯效率。單鏈寡核苷酸（ssODNs）還曾經(jīng)被用來(lái)催動(dòng)導(dǎo)入一種折斷后使微小核苷酸改變發(fā)生模板化擴(kuò)增。單鏈寡核苷酸可以很容易得到合成，這種方法易于為研究人員得到和使用，但是，單鏈寡核苷酸構(gòu)建基因組內(nèi)一種靶擊性改變的機(jī)制并不依賴于經(jīng)典的同源重組途徑，這種事情還沒有得到充分的認(rèn)識(shí)。單鏈寡核苷酸甚至還可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和細(xì)胞周期停滯，并且很可能比原初治療學(xué)相關(guān)人體細(xì)胞類型更為值得懷疑，這部分地得到了胡班（Hoban）等人的證明。

輸送和處理的研發(fā)問題

這個(gè)領(lǐng)域內(nèi)的魔咒一直是基因治療的三個(gè)最重要問題：輸送，輸送，還是輸送?；蚪M編輯的工具箱已經(jīng)擴(kuò)展開來(lái)，這一魔咒現(xiàn)在還被用于治療性基因組編輯的許多問題中：什么是將高活躍性基因組編輯試劑輸送進(jìn)入臨床相關(guān)性細(xì)胞類型的最理想程序呢？這個(gè)問題的回答正在日益形成疾病特異性。確定恰當(dāng)?shù)妮斔蛻?zhàn)略，最重要的注意事項(xiàng)是：基因組編輯相對(duì)于基因增益戰(zhàn)略來(lái)說是一種切中肯綮的方法。事實(shí)上，核酸酶的持續(xù)表達(dá)不僅是不需要的，還應(yīng)該規(guī)避：某種核酸酶的連續(xù)表達(dá)增加了有害基因組不穩(wěn)定性的機(jī)率，既可能使受編輯細(xì)胞的適應(yīng)能力減弱，又可以造成已暴露細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

對(duì)于細(xì)胞的體外到體內(nèi)操作來(lái)說，標(biāo)準(zhǔn)的非病毒性輸送方法，如核酸酶之于RNA或者核糖核蛋白（RNP）之于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，似乎是最有希望的方法。輸送核酸酶元件如RNA或RNP，保證了既激活I(lǐng)型干擾素應(yīng)答，又使表達(dá)的持續(xù)期最小化。RNA或RNP可以通過一系列機(jī)制輸送進(jìn)入一個(gè)細(xì)胞內(nèi)，這些機(jī)制是由特定細(xì)胞類型用不同的復(fù)合體轉(zhuǎn)染的能力所決定的。有效穿越所有細(xì)胞類型的輸送的一種通用方法是電穿孔：使用RNA或RNP將這類細(xì)胞混合起來(lái)，然后一類簡(jiǎn)短的電脈沖穿越這些混合物，從而構(gòu)建起了一些膜孔，讓RNP或RNA進(jìn)入膜內(nèi)。目前，已經(jīng)有多種不同的電穿孔儀器可供使用，通過這些儀器，可以發(fā)現(xiàn)構(gòu)建最小細(xì)胞毒性的電穿孔情形，條件是激活天然免疫系統(tǒng)的DNA或其他核苷酸不被摻合進(jìn)入混合物中。對(duì)于需要核酸酶的簡(jiǎn)單應(yīng)用來(lái)說，這似乎是一種穩(wěn)健的解決方案。對(duì)于需要同源重組介導(dǎo)的編輯的用途來(lái)說，還需要一種DNA分子得到輸送。將裸露DNA輸送進(jìn)入癌癥細(xì)胞株，已經(jīng)是一種輸送供體載體的有效方法，但是將裸露DNA輸送進(jìn)入原初細(xì)胞，尤其是T細(xì)胞和造血干/祖細(xì)胞，會(huì)激活一種有害的天然免疫應(yīng)答，既降低基因組編輯的頻率，又危及被編輯細(xì)胞的優(yōu)度。使用腺相關(guān)病毒（AAV）將供體模板輸送進(jìn)入細(xì)胞，可以是問題的一種解決方案，因?yàn)锳AV與許多病毒一樣，已經(jīng)進(jìn)化到了可以逃避被天然細(xì)胞內(nèi)免疫應(yīng)答識(shí)別的程度。

對(duì)于要求細(xì)胞在體編輯的治療性應(yīng)用來(lái)說，挑戰(zhàn)更為巨大，還沒有確定哪怕是一種解決方案。再者說，在體輸送問題的解決方案可能各自不同，取決于需要被鑒定的靶細(xì)胞類型。例如，編輯肝細(xì)胞的解決方案很可能與編輯肌肉的解決方案有非常大的不同，還可能與編輯中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞的解決方案大相徑庭。盡管如此，隨著具有優(yōu)先轉(zhuǎn)導(dǎo)不同的在體細(xì)胞類型的多種不同AAV病毒血清型的研發(fā)，輸送mRNAs進(jìn)入細(xì)胞的新方法的研發(fā)以及輸送特異性組織的納米顆粒（包括脂質(zhì)基和非脂質(zhì)基納米顆粒）的復(fù)雜性日益增加，似乎可以在不久的將來(lái)形成一些解決方案。研發(fā)一種核酸酶在持續(xù)期間內(nèi)不表達(dá)的輸送方法是重要的，既可以從基因毒性立足點(diǎn)出發(fā)，也可以從免疫學(xué)立足點(diǎn)出發(fā)。這是可以預(yù)期的，但必須得到證明，否則，所有的工程化核酸酶平臺(tái)將被免疫系統(tǒng)察覺為外源，并將引發(fā)一種穩(wěn)健的免疫應(yīng)答，這種免疫應(yīng)答能夠消除治療性編輯細(xì)胞并可導(dǎo)致中毒性器官損傷。

隨著治療性基因組編輯研究走向高潮，與日俱增的創(chuàng)新方法正在得到應(yīng)用。它們可以沿三種不同的軸向進(jìn)行分類：非同源性末端連接對(duì)同源重組介導(dǎo)基因組編輯軸；體外導(dǎo)入體內(nèi)（ex vivo）對(duì)在體（in vivo）輸送軸；遺傳性對(duì)傳染性或非遺傳性疾病適用性軸。下面對(duì)這些不同的戰(zhàn)略舉幾例進(jìn)行討論。

非同源性末端連接介導(dǎo)治療學(xué)

使用NHEJ介導(dǎo)的基因組編輯可以解決的疾病是那些某種遺傳學(xué)元件突變引發(fā)并可能導(dǎo)致臨床利好的疾病，這類遺傳學(xué)元件到底是一種編碼區(qū)域，還是一種調(diào)控元件，抑或是一些其他的遺傳元件值得琢磨。這種方法的一例是：刪除造血干/祖細(xì)胞（HSPCs）內(nèi)Bcl11A基因的紅系增強(qiáng)子，以便上調(diào)γ球蛋白來(lái)治療鐮刀細(xì)胞病和β地中海貧血。鐮刀細(xì)胞病和β地中海貧血都是由HBB基因內(nèi)的突變導(dǎo)致的單基因疾病。如果一種與HBB緊密相關(guān)的基因HBG得到上調(diào)，從而既可替代丟失的（β地中海貧血）γ球蛋白、又可應(yīng)對(duì)（鐮刀細(xì)胞病的）γ球蛋白的功能紊亂，則這兩種疾病都可以治愈。對(duì)球蛋白開關(guān)的研究已經(jīng)證明，Bcl11A基因是HBG基因的一種轉(zhuǎn)錄阻抑物，這種Bcl11A基因的阻抑可以導(dǎo)致HBG基因的去阻抑。而且，當(dāng)其被用作一種研究工具時(shí)，基因組編輯證明：紅系增強(qiáng)子Bcl11A基因內(nèi)一種特異性調(diào)控元件的缺失可以阻抑紅系譜系內(nèi)的Bcl11A基因，但在B細(xì)胞譜系內(nèi)則不能，因而認(rèn)證了HSPCs細(xì)胞內(nèi)的非同源性末端連接介導(dǎo)的基因組編輯所導(dǎo)致的這種元件失活是一種治療學(xué)戰(zhàn)略。

使用NHEJ介導(dǎo)的基因組編輯的一種不同戰(zhàn)略正在得到研發(fā)，來(lái)治療杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良，這是一種由肌營(yíng)養(yǎng)不良基因內(nèi)突變導(dǎo)致的單基因疾病。這種在體戰(zhàn)略內(nèi)，一種單個(gè)核酸酶可以被輸送進(jìn)入肌纖維，來(lái)治療插入/缺失，抵消原初性移框突變，從而可以逆轉(zhuǎn)病理性讀框突變?；蛘呖梢詫⒁粚?duì)核酸酶輸送進(jìn)入肌纖維，以便刪除一套外顯子從而刪除病理性突變，將杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良轉(zhuǎn)換為較不嚴(yán)重的貝克氏肌營(yíng)養(yǎng)不良。對(duì)于這兩種戰(zhàn)略來(lái)說，概念認(rèn)證研究都已經(jīng)得到了發(fā)表，但是挑戰(zhàn)依舊，那就是達(dá)到了肌纖維的一部分，包括心臟和隔膜組織的理想編輯效果，其大小程度足以改變疾病特異性的臨床期間。另外，作為一種普遍原理，任何一種可以通過RNA干擾（RNAi）介導(dǎo)的某種基因敲除而治療的疾病都可以更加確定性地被基因組編輯治療。編輯可以導(dǎo)致該基因的永久性敲除，因此將不需要敲除性RNA干擾劑的重復(fù)（給藥）劑量。

對(duì)于傳染性疾病來(lái)說，從體外導(dǎo)入到體內(nèi)的NHEJ介導(dǎo)的基因組編輯已經(jīng)達(dá)到了臨床II期臨床試驗(yàn)，這是一種產(chǎn)生對(duì)HIV病毒感染具有耐受性的T細(xì)胞群體的方法。這些研究是基于這樣的發(fā)現(xiàn)：CCR5基因內(nèi)出現(xiàn)雙等位基因突變的人體對(duì)HIV病毒感染產(chǎn)生了接近完全的耐受性，而且，使用干細(xì)胞內(nèi)包含CCR5基因內(nèi)雙等位基因突變的供體所進(jìn)行的同種異體造血干細(xì)胞移植，治愈了一位HIV病人。Sangamo生物科學(xué)公司和他們的合作者們已經(jīng)工程化構(gòu)建了ZFNs來(lái)靶擊CCR5基因，然后使用這些ZFNs來(lái)突變衍生自已經(jīng)感染了HIV病毒的病人體內(nèi)的原初T細(xì)胞內(nèi)的CCR5基因。在I期臨床試驗(yàn)中，他們證明了這種方法既是可行的也是安全的，Ⅱ期試驗(yàn)正在進(jìn)行中。

基于NHEJ的在體基因組編輯方法在傳染性疾病中得到了研發(fā)。在多項(xiàng)概念認(rèn)證研究中，已經(jīng)工程化構(gòu)建了核酸酶來(lái)識(shí)別多種病毒基因組（包括HIV病毒和乙肝病毒的基因組）的關(guān)鍵部件，以便構(gòu)建可以用來(lái)滅活該病毒的突變。這些研究已經(jīng)證明：這樣的核酸酶可以得到工程化構(gòu)建，它們可以改變離體模式生物體內(nèi)的病毒動(dòng)力學(xué)，但是真實(shí)的挑戰(zhàn)仍然存在，那就是如何在一種在體條件下運(yùn)用這種戰(zhàn)略，這種條件要求必須達(dá)到向所有感染細(xì)胞的輸送，這種方式并不要求核酸酶的結(jié)構(gòu)性表達(dá)。

最后，NHEJ介導(dǎo)的基因組編輯已經(jīng)被用于概念認(rèn)證研究中，以作為治療高膽固醇的潛在方法。PCSK9基因是一種膽固醇的調(diào)節(jié)物，那些PCSK9基因內(nèi)有罕見純合性缺乏的病人只是擁有極低的膽固醇水平，在其他方面則是健康的。在體核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯已經(jīng)被用來(lái)使肝內(nèi)PCSK9基因發(fā)生突變，結(jié)果導(dǎo)致膽固醇水平的下降。盡管這些實(shí)驗(yàn)具有多方面的困難，它們實(shí)實(shí)在在地證明了，原理上在體編輯是如何用來(lái)治療多因子性疾病的，這些疾病的病程可以使用基因組編輯進(jìn)行調(diào)整，以構(gòu)建一種臨床有用性的基因型。

同源重組介導(dǎo)治療學(xué)

對(duì)特定疾病的病理生理學(xué)進(jìn)行深入認(rèn)識(shí)可以證明，NHEJ介導(dǎo)的基因組編輯是如何成為這些疾病的治療方法的。但是，總體上來(lái)說，在體外導(dǎo)入體內(nèi)和在體兩種途徑上都具備了同源重組介導(dǎo)的基因組編輯能力后，有潛能影響更多疾病。

使用同種異體造血干細(xì)胞移植方法可以治愈多種與人類造血干/祖細(xì)胞相關(guān)的遺傳性疾病，如鐮刀細(xì)胞性疾病、β地中海貧血、重癥聯(lián)合性免疫缺陷和慢性肉芽腫疾病。在這些類型疾病的同種異體造血干細(xì)胞移植應(yīng)用中，造血系統(tǒng)可以用包含該基因的至少一種野生型版本的細(xì)胞來(lái)替代，因此一些此類方法已經(jīng)被稱為“同種異體基因療法”。由于HR介導(dǎo)的基因組編輯方法的使用，可以用遺傳學(xué)糾正的自體細(xì)胞來(lái)替代遺傳學(xué)糾正的同種異體干細(xì)胞。要做到此，既可以直接糾正缺陷基因，也可以使用同源重組介導(dǎo)的基因組編輯來(lái)將治療性轉(zhuǎn)基因靶向到一種“安全的避難所”，在這種基因組位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)基因可以在需要的水平上表達(dá)、并且不會(huì)導(dǎo)致被修飾細(xì)胞的功能紊亂或轉(zhuǎn)化。用同源重組進(jìn)行的基因糾正有一個(gè)潛在的問題，那就是除鐮刀細(xì)胞性疾病外的許多遺傳性疾病可以由遍布該基因的突變引發(fā)。在可能考慮為單個(gè)突變?cè)O(shè)計(jì)核酸酶的工具中，工程化核酸酶工具箱可用。一種替代的方法是設(shè)計(jì)供體載體，在這種情況下，在同源重組之后，整合性轉(zhuǎn)基因可以功能性地糾正所有的 （或者大多數(shù)）致病性突變。使用這種戰(zhàn)略，一種單個(gè)的組合試劑可以研發(fā)來(lái)治療所有的遺傳病個(gè)體，這種戰(zhàn)略可以顯著簡(jiǎn)化研發(fā)和管理過程。

對(duì)于在體同源重組基因組編輯來(lái)說，概念認(rèn)證研究已經(jīng)得到了描述：不僅致病的突變本基因可以得到直接的糾正，而且可以將某種轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)入一個(gè)特定的位點(diǎn)，使之可以在足以解救致病缺陷的水平上得到表達(dá)。在直接基因糾正戰(zhàn)略中，核酸酶和供體載體被輸送到了延胡索酰乙酰乙酸酶（FAH）缺陷小鼠體內(nèi)。正常說來(lái)，F(xiàn)AH缺陷導(dǎo)致了肝細(xì)胞死亡，但是，在基因組編輯機(jī)制得到輸送后，小量的肝細(xì)胞得到了糾正。這些被糾正了的肝細(xì)胞在其他存活肝內(nèi)再次生長(zhǎng)繁殖，從而解救了小鼠不出現(xiàn)肝衰竭。在這些實(shí)驗(yàn)中，被糾正的細(xì)胞相對(duì)于未糾正的細(xì)胞來(lái)說有一種巨大的選擇優(yōu)勢(shì)，這種選擇優(yōu)勢(shì)的原理是一種被基因治療學(xué)術(shù)界常規(guī)使用的原理。在轉(zhuǎn)基因靶擊戰(zhàn)略中，核酸酶被用來(lái)刺激某種治療性轉(zhuǎn)基因（IX因子或溶酶體貯存酶類）的靶向性導(dǎo)入進(jìn)入某個(gè)基因座，可以驅(qū)動(dòng)肝細(xì)胞的高水平表達(dá)。在這種方法中，小量的被修飾肝細(xì)胞能夠在一種系統(tǒng)化水平上解救致病性遺傳學(xué)缺陷。

從體外導(dǎo)入到體內(nèi)的同源重組基因組編輯正在研發(fā)以作為治療HIV病毒耐性的免疫系統(tǒng)的一種方法。HIV病毒的特性是它的突變和逃避任何抑制的能力，因此，簡(jiǎn)單突變CCR5共同受體將不足以給予HIV病毒的細(xì)胞耐性。而且，許多HIV病毒感染病人已經(jīng)構(gòu)建了HIV變異型，通過CXCR4共同受體進(jìn)入細(xì)胞，因此可能逃避任何只靶向CCR5基因的方法；但是，通過使用同源重組介導(dǎo)的編輯，可以在插入一個(gè)抗HIV病毒基因盒的同時(shí)滅活CCR5基因，因此構(gòu)建起針對(duì)HIV病毒生命周期的多個(gè)遺傳學(xué)阻抑物，并且抑制了通過CXCR4共同受體進(jìn)入的變異型。

最后，從體外導(dǎo)入到體內(nèi)的同源重組介導(dǎo)的基因組編輯已經(jīng)在概念認(rèn)證實(shí)驗(yàn)中得到了證明，是某種獲得性疾病的治療學(xué)方法。在這些實(shí)驗(yàn)中，通過同源重組工程化構(gòu)建了成纖維細(xì)胞來(lái)分泌某種創(chuàng)傷愈合生長(zhǎng)因子。當(dāng)這些工程化成纖維細(xì)胞被植入到小鼠創(chuàng)口時(shí)，它們通過刺激血管形成而加速了創(chuàng)口的愈合。從原理上來(lái)說，這證明了通過工程化構(gòu)建，使得細(xì)胞分泌出可以解救非遺傳性疾病的治療用蛋白，可用于人體的創(chuàng)口愈合。但是人們還是可能推測(cè)，例如，某種類似的方法可以用來(lái)工程化細(xì)胞構(gòu)建，不論是體外導(dǎo)入到體內(nèi)還是在體，都可以分泌神經(jīng)保護(hù)因子來(lái)減緩或中止神經(jīng)退行性病變或者促進(jìn)創(chuàng)傷后的神經(jīng)形成或神經(jīng)再生。

安全性與毒理學(xué)

與其他永久改變細(xì)胞基因組的方法相比，基因組編輯的巨大潛在優(yōu)勢(shì)之一是其過程的特異性。而且，通過某種位點(diǎn)特異性工程化核酸酶而導(dǎo)入某種雙鏈折斷（DSB）是基因編輯的關(guān)鍵問題，雙鏈折斷可以產(chǎn)生基因組學(xué)不穩(wěn)定性，包括染色體易位、染色體丟失和非整倍性。因此，核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯臨床研發(fā)的一個(gè)關(guān)鍵問題是，建立一系列試驗(yàn)來(lái)評(píng)估該過程的潛在安全性。這個(gè)領(lǐng)域還很年輕，沒有任何單個(gè)的或成套的試驗(yàn)已經(jīng)被認(rèn)證了可以建立起對(duì)人體來(lái)說將是安全的編輯過程。相反，安全性和毒理學(xué)分析的評(píng)估是根據(jù)以下原理進(jìn)行的：一是使脫靶雙鏈折斷及其可能產(chǎn)生的插入/缺失最小化或得到消除；二是使用最佳可得模型來(lái)評(píng)估被編輯細(xì)胞的功能性行為；三是將基因組編輯過程放入到每個(gè)人體內(nèi)連續(xù)不斷地發(fā)生的天然基因組學(xué)不穩(wěn)定性的背景中去。這些基礎(chǔ)性的標(biāo)準(zhǔn)適用于任何被使用的核酸酶平臺(tái)，因?yàn)槊總€(gè)平臺(tái)都是通過某種雙鏈折斷的構(gòu)建來(lái)運(yùn)作的。

評(píng)估某種核酸酶的特異性既有偏倚性方法也有非偏倚性方法。生物信息學(xué)工具的基本原理是搜索與靶位點(diǎn)相似序列的位點(diǎn)，這有助于預(yù)測(cè)哪些脫靶位點(diǎn)應(yīng)該得到檢查。一旦一套位點(diǎn)得到了鑒定，就可以應(yīng)用深度測(cè)序來(lái)審查那些位點(diǎn)，以便確定在那些位點(diǎn)上是否存在核酸酶產(chǎn)生的插入/缺失。基于深度測(cè)序方法學(xué)目前的錯(cuò)誤率，某種給定位點(diǎn)的檢測(cè)限度是0.01%左右。而且，生物信息學(xué)算法仍然處于它們的早期研發(fā)階段，還不能可靠地鑒定所有潛在的脫靶位點(diǎn)。為了使用生物信息學(xué)來(lái)對(duì)偏倚性方法進(jìn)行補(bǔ)充，人們新研發(fā)了非偏倚性工具，包括折斷指導(dǎo)性測(cè)序、HTGTS、BLESS和Digenome-seq方法。其他試驗(yàn)使用染色體外DNA，包括腺相關(guān)病毒、裸露DNA質(zhì)粒和整合缺陷性輪狀病毒載體來(lái)捕捉折斷，有助于評(píng)估某種核酸酶的特異性。這些工具擁有特定的效力，因?yàn)樗鼈冞€可以鑒定規(guī)模性染色體重排（如易位），后者使用偏倚性方法是不能得到鑒定的。由于染色體易位將是一種罕見但是不可避免的誘導(dǎo)性雙鏈折斷的結(jié)果，它的嚴(yán)謹(jǐn)操作可以避免靶向那些在治療性基因組編輯研發(fā)階段癌癥關(guān)聯(lián)性染色體易位所涉及的基因。

這些無(wú)偏倚方法的挑戰(zhàn)是，它們已經(jīng)在特異性癌癥細(xì)胞株內(nèi)得到了研發(fā)，這些細(xì)胞株并沒有完整的DNA修復(fù)通路，它們需要適應(yīng)于擁有完整DNA修復(fù)通路的原初臨床相關(guān)性細(xì)胞類型。而且，這些工具還提供了對(duì)優(yōu)化某種核酸酶的特異性有用的信息。例如，如果這些試驗(yàn)揭示了核酸酶擁有多個(gè)脫靶位點(diǎn)，則它們提示核酸酶應(yīng)該得到再設(shè)計(jì)，以更加具有特異性。對(duì)于鋅指核酸酶來(lái)說，這可能需要使用核酸酶結(jié)構(gòu)域中強(qiáng)迫性異二聚體結(jié)構(gòu)，或者探索氨基酸內(nèi)的特異性改變，來(lái)調(diào)整對(duì)靶序列的識(shí)別。對(duì)于TAL效應(yīng)物核酸酶來(lái)說，這可能需要使用核酸酶結(jié)構(gòu)域中強(qiáng)迫性異二聚體結(jié)構(gòu)，或者使用TAL效應(yīng)物識(shí)別結(jié)構(gòu)域內(nèi)的替代性重復(fù)可變性雙殘基（RVDs）。對(duì)于CRISPR/Cas9核酸酶來(lái)說，改善設(shè)計(jì)可能需要檢驗(yàn)?zāi)撤N不同的指導(dǎo)序列，或者使用某種截?cái)囗敹说闹笇?dǎo)序列或配對(duì)切割酶方法。對(duì)于所有這些平臺(tái)來(lái)說，可以通過限制核酸酶表達(dá)期間來(lái)增加特異性，這種期間是減少核酸酶暴露的AUC值（曲線下面積）的藥理學(xué)等價(jià)物。

對(duì)于直接鑒定核酸酶的潛在脫靶位點(diǎn)的意圖來(lái)說，一種補(bǔ)充方法是通過更為經(jīng)典的功能性藥理學(xué)－毒理學(xué)方法來(lái)評(píng)估基因組編輯過程。這種戰(zhàn)略評(píng)估的是，基因組編輯過程是否會(huì)構(gòu)建出不能執(zhí)行它們正常功能（例如造血干細(xì)胞重構(gòu)多譜系血細(xì)胞生成的能力）并轉(zhuǎn)化成為癌細(xì)胞的細(xì)胞，或者是否會(huì)導(dǎo)致群體變得克隆斜交（一種可能的預(yù)兆，細(xì)胞的構(gòu)建可能在某種時(shí)間框架后得到轉(zhuǎn)化，不僅僅可以用目前的試驗(yàn)來(lái)測(cè)度）。

偏倚性、非偏倚性和功能性方法需要在受研的治療性細(xì)胞類型內(nèi)得到執(zhí)行，使用的是規(guī)劃好的臨床級(jí)別基因組編輯過程，因?yàn)樵谄渌?xì)胞類型內(nèi)的評(píng)估，尤其是已經(jīng)轉(zhuǎn)化了的癌癥細(xì)胞株的評(píng)估，可能是不相關(guān)的。

應(yīng)該記住的一個(gè)重要原理是分裂中的細(xì)胞正在形成持續(xù)性的基因組學(xué)挑戰(zhàn)（激發(fā)）。據(jù)估計(jì)，每次當(dāng)細(xì)胞分裂的時(shí)候，它必須修復(fù) 20~40個(gè)DNA雙鏈折斷，不用考慮數(shù)百萬(wàn)個(gè)其他類型的DNA病灶。這種天然基因組學(xué)挑戰(zhàn)的結(jié)果是一個(gè)正常分裂干細(xì)胞在每次細(xì)胞分裂中獲得了接近3~30個(gè)突變。據(jù)估計(jì)在每個(gè)個(gè)體內(nèi)每秒發(fā)生了一百萬(wàn)個(gè)突變。有人已經(jīng)提出，通過病人衍生的誘導(dǎo)多潛能細(xì)胞的基因組編輯而進(jìn)行的基因糾正，然后進(jìn)行全基因組測(cè)序來(lái)確定是否已經(jīng)發(fā)生了有害突變，可能是一種更為安全的方法。從體外到體內(nèi)擴(kuò)展所導(dǎo)致的突變負(fù)荷，從單個(gè)細(xì)胞到治療相關(guān)性細(xì)胞數(shù)目（對(duì)于造血系統(tǒng)疾病來(lái)說，根據(jù)病人細(xì)胞大小的不同，介于50~800百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的數(shù)量級(jí)），相對(duì)于只修飾巨大數(shù)量的體細(xì)胞而不能對(duì)任何一個(gè)細(xì)胞的基因組進(jìn)行測(cè)序，可能更具致癌性。

胚系基因組編輯的挑戰(zhàn)

強(qiáng)勁的基因組編輯工具箱的研發(fā)，并用來(lái)通過受精卵注射構(gòu)建多種多樣的遺傳修飾物種，已經(jīng)提高了這樣的可能性：一些人可能使用人體受精卵內(nèi)的基因組編輯來(lái)構(gòu)建人體。這種可能性得到了一些中國(guó)研究人員工作的彰顯，他們?cè)谌巳梭w受精卵內(nèi)使用了這種方法，這類人體受精卵從遺傳學(xué)上來(lái)說不能在人體內(nèi)得到研發(fā)，但是在概念上接近于與二倍體受精卵相一致。三原核受精卵注射實(shí)驗(yàn)提示了這種過程的低效率和不可預(yù)測(cè)性，這些發(fā)現(xiàn)得到了使用健康二倍體受精卵的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的預(yù)測(cè)。這些結(jié)果清楚地證明，如同受精卵注射之類的基因組編輯技術(shù)應(yīng)用，盡管從倫理學(xué)判決上來(lái)說是可允許的或令人滿意的，還不足以進(jìn)入人體應(yīng)用。而且，這些特異性實(shí)驗(yàn)和總體概念已經(jīng)產(chǎn)生了大量的專業(yè)或非專業(yè)的文獻(xiàn)報(bào)道。在發(fā)展方向上來(lái)說仍有許多問題需要加以確定，但是就前沿研究工作來(lái)說，我希望提出自己的幾項(xiàng)原則：首先，倫理學(xué)問題不應(yīng)該阻礙基因組編輯工具在研究中的運(yùn)用，這種運(yùn)用為胚系細(xì)胞、胚系細(xì)胞研發(fā)和早期胚胎發(fā)育提供了更好的認(rèn)識(shí)。其次，應(yīng)該聽取來(lái)自不同領(lǐng)域的科學(xué)領(lǐng)軍人物的討論，還要考慮來(lái)自不同的利益相關(guān)者的意見，尤其包括那些發(fā)生了多個(gè)世代的致命性遺傳病家系的意見。第三，目前還沒有單個(gè)的倫理學(xué)觀點(diǎn)形成優(yōu)勢(shì)觀點(diǎn)，理想的結(jié)果是，新的認(rèn)識(shí)和觀點(diǎn)可以整合進(jìn)入一種持續(xù)、反復(fù)的過程，而不僅僅是形成一種在單個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的清晰分辨率。最后，使用基因組編輯的問題可能導(dǎo)致特異性基因型傳播到未來(lái)世代，需要放在這些動(dòng)態(tài)的背景下加以考慮，它們已經(jīng)發(fā)生，同樣也影響到了未來(lái)世代的基因型結(jié)構(gòu)。兩項(xiàng)這樣的例子是選擇性受精卵植入中的植入前遺傳學(xué)診斷和治愈或幫助遺傳疾病病人 （一種明確的好事），使得他們不將他們的致病突變遺傳給他們的兒孫們。

基因組編輯的精準(zhǔn)性和糾正DNA序列內(nèi)致病性基因組信息錯(cuò)誤的能力，已經(jīng)使得這個(gè)領(lǐng)域在概念上吸引了人們的關(guān)注和興趣。人們激動(dòng)地預(yù)測(cè)，在接下來(lái)的十年中，將會(huì)有數(shù)十項(xiàng)（或許還不止）基因組編輯臨床試驗(yàn)得到來(lái)自學(xué)術(shù)界、生物科技創(chuàng)新公司和藥企的研發(fā)。但是，還有一些重大問題未能得到解決。包括建立適合于基本技術(shù)的管理框架；建立安全有效的機(jī)理；建立靈活的、適應(yīng)性強(qiáng)的管理框架。這些框架需要考慮受到這個(gè)問題影響的多種多樣利益相關(guān)者的訴求，還必須尊重目前不同的發(fā)展理念和發(fā)展文化。

［資料來(lái)源：Genome Biology］［責(zé)任編輯：彥 隱］