木丹顆粒對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響*

李瑩瑩，于世家遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧沈陽110032

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木丹顆粒對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響*

李瑩瑩，于世家
遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧沈陽110032

目的：探究木丹顆粒對鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響。方法：將50只大鼠隨機(jī)分為正常對照組（11只）、模型組（13只）、甲鈷胺片組（13只）和木丹顆粒組（13只），采用STZ誘導(dǎo)復(fù)制糖尿病模型，正常對照組和模型組灌胃生理鹽水，甲鈷胺片組和木丹顆粒組分別灌胃甲鈷胺片和木丹顆粒，觀察各組大鼠血糖變化、背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡陽性百分比、背根神經(jīng)節(jié)形態(tài)。結(jié)果：血糖水平模型組給藥后顯著高于給藥前（P＜0.05），甲鈷胺片組和木丹顆粒組給藥前后無明顯變化（P＞0.05）；模型組、甲鈷胺片組和木丹顆粒組大鼠給藥后背根神經(jīng)節(jié)凋亡細(xì)胞陽性率小于正常對照組（P＜0.05）；木丹顆粒組和甲鈷胺片組大鼠給藥后背根神經(jīng)節(jié)凋亡細(xì)胞陽性率小于模型組（P＜0.05）；木丹顆粒組和甲鈷胺片組大鼠背根神經(jīng)節(jié)形態(tài)結(jié)構(gòu)雖然出現(xiàn)了和模型組相似的損傷，但損傷程度小于模型組（P＜0.05）。結(jié)論：木丹顆粒對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。

木丹顆粒；糖尿?。槐掣窠?jīng)節(jié)；神經(jīng)元細(xì)胞凋亡

近年來糖尿病的發(fā)病人數(shù)呈逐年增加的趨勢，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國近20年來糖尿病的發(fā)病率增加了3～6倍［1］。糖尿病患者可合并多種并發(fā)癥，其中糖尿病周圍神經(jīng)病變是最為常見且危害最大的一種并發(fā)癥。目前西醫(yī)對糖尿病周圍神經(jīng)病變的治療主要是通過抗氧化應(yīng)激，常用的藥物有α-硫辛酸、維生素類藥物，這類藥物在治療糖尿病神經(jīng)病變時(shí)療效有限，不能完全滿足臨床需求［2-3］。目前中藥或者中西藥合用治療糖尿周圍病神經(jīng)病變收到較為滿意的治療效果。木丹顆粒在臨床上治療糖尿病周圍神經(jīng)病變時(shí)收到了十分滿意的治療效果［4］。本研究以STZ誘導(dǎo)大鼠復(fù)制糖尿病模型，來研究木丹顆粒對糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)的病理和神經(jīng)節(jié)的影響，為木丹顆粒在臨床上治療糖尿病周圍神經(jīng)病變提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物選擇50只健康Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量200～250 g，均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證號為SCXK（京）2007-0001。將所購大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2主要試劑及儀器STZ（Sigma公司提供）；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；木丹顆粒（奧達(dá)制藥有限公司）；甲咕胺片（日本衛(wèi)材株式會社）；石蠟包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)（德國徠卡公司提供）；數(shù)碼顯微鏡、熒光顯微鏡、生物顯微鏡（日本OLYMPUS公司提供）。

1.3分組方法將11只正常的大鼠分入正常對照組，將造模成功的39只大鼠隨機(jī)平均分入模型組、木丹顆粒組、甲鈷胺片組，每組13只。正常對照組腹腔注射枸櫞酸緩沖液；對模型組、木丹顆粒組和甲鈷胺片組大鼠腹腔注射濃度為2%的鏈脲佐菌素枸櫞酸緩沖溶液，劑量為57 mg/kg，腹腔注射鏈脲佐菌素72小時(shí)后檢查血糖，血糖濃度＞16.7 mmol/L的判定為模型復(fù)制成功。

1.4給藥方法正常對照組和模型組大鼠均灌胃生理鹽水，木丹顆粒組大鼠灌胃木丹顆粒生理鹽水溶液，每日劑量為2.3 g/kg；甲鈷胺片組大鼠灌胃甲鈷胺片生理鹽水溶液，每日劑量為125 μg/kg。各組大鼠分別連續(xù)給藥4周。

1.5指標(biāo)觀察

1.5.1給藥前后血糖變化各組大鼠給藥前、后抽取尾靜脈血，用血糖儀檢測各組大鼠尾靜脈血中的血糖濃度。

1.5.2HE染色待各組中亞組大鼠連續(xù)灌胃4周后，腹腔注射水合氯醛麻醉，取背根神經(jīng)節(jié)，4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、脫蠟至水、蘇木素染色、封片。

1.5.3細(xì)胞凋亡TUNEL法檢測按照TUNEL法檢測試劑盒中的使用說明，F(xiàn)ITC熒光染色觀測雪旺細(xì)胞凋亡，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)和凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以（χ±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1血糖水平血糖水平模型組、甲鈷胺片組和木丹顆粒組給藥前、后均顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組給藥后高于給藥前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；甲鈷胺片組、木丹顆粒組給藥后高于給藥前，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；給藥后甲鈷胺片組、木丹顆粒組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1　各組大鼠血糖水平比較m m ol/L

2.2背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡背根神經(jīng)節(jié)凋亡細(xì)胞陽性百分率給藥后模型組、甲鈷胺片組和木丹顆粒組小于對照組（P＜0.05）；木丹顆粒組、甲鈷胺片組小于模型組（P＜0.05）；木丹顆粒組與甲鈷胺片組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2　各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡比較

2.3各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)形態(tài)比較正常對照組大鼠的背根神經(jīng)節(jié)髓神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)形態(tài)沒有損傷，背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞呈現(xiàn)為球形或者不規(guī)則的卵圓形，各神經(jīng)元細(xì)胞間可以見到毛細(xì)血管網(wǎng)、雪旺細(xì)胞等；模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)在造模成功后髓神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷，并且隨著STZ作用時(shí)間的增加損傷的程度逐漸加重，表現(xiàn)為部分細(xì)胞的胞漿出現(xiàn)褶皺收縮，少部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡壞死，有嗜神經(jīng)節(jié)和衛(wèi)星現(xiàn)象。木丹顆粒組和甲鈷胺片組大鼠的背根神經(jīng)節(jié)形態(tài)結(jié)構(gòu)雖然出現(xiàn)了和模型組相似的損傷，但損傷程度小于模型組。見圖1。

圖1　大鼠背根神經(jīng)節(jié)形態(tài)圖

3　討論

中醫(yī)認(rèn)為絡(luò)病是由于肝腎陰虛、氣陰兩虛、痰陰痹阻這三大原因所致，且認(rèn)為糖尿病發(fā)病初期患者多為陰津耗虧、熱燥偏盛?！秲?nèi)經(jīng)》中有云：“邪之所湊，其氣必虛”［5］。所以認(rèn)為糖尿病神經(jīng)病變患者正氣虛弱為其發(fā)病內(nèi)因，肝腎虛虧首當(dāng)其沖。于世家［6］教授通過長期對糖尿病周圍神經(jīng)病變的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病周圍神經(jīng)病變多見于糖尿病病程較長并且體陰虛、飲食不節(jié)、情志失控、勞累過度的糖尿病患者。同時(shí)于世家［7］教授研究認(rèn)為，糖尿病周圍神經(jīng)病變患者的病機(jī)特點(diǎn)為陰虛為本、燥熱為標(biāo)、氣陰兩虛、陰陽俱虛。除此之外中醫(yī)認(rèn)為血瘀阻滯、脈絡(luò)受阻、陰虛內(nèi)熱、痰瘀內(nèi)滯等也是糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病原因［8］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，中醫(yī)中的“絡(luò)脈”和神經(jīng)組織在功能和形態(tài)上許多方面具有相似之處，故現(xiàn)代中醫(yī)往往將神經(jīng)組織歸屬中醫(yī)“絡(luò)脈”的范疇。又因?yàn)樘悄虿≈車窠?jīng)病變與絡(luò)病有相似的臨床特點(diǎn)，故現(xiàn)代中醫(yī)又將糖尿病周圍神經(jīng)病變歸屬“絡(luò)病”的范疇，結(jié)合絡(luò)病的發(fā)病原因，中醫(yī)認(rèn)為糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病原因主要為氣陰兩虛、氣虛血瘀、瘀血阻絡(luò)。故中醫(yī)對于糖尿病周圍神經(jīng)病變的治療原則為益氣補(bǔ)陰、活血化瘀、祛瘀生新［9］為主。

木丹顆粒由沒藥、延胡索（醋制）、三七、赤芍、丹參、川芎、紅花、蘇木、雞血藤共9味中藥組成，是于世家根據(jù)久病必虛、久病入絡(luò)、祛瘀生新等理論，提出活血化瘀通絡(luò)、祛瘀生新的糖尿病并發(fā)周圍神經(jīng)病變治療原則而研制［10］。木丹顆粒中的延胡索具有辛溫活血、理氣止痛之功效；沒藥、蘇木、丹參、紅花、雞血藤具有活血化瘀之功效；赤芍、三七具有活血止痛之功效；丹參具有活血養(yǎng)血、祛瘀生新之功效；川芎具有行氣活血之功效［11］。諸藥合用達(dá)到了活血通絡(luò)、祛瘀生新之功效。臨床上長期使用已經(jīng)表明，木丹顆粒對糖尿病周圍神經(jīng)病變具有十分顯著的治療效果。本研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)木丹顆粒對糖尿病的血糖水平?jīng)]有影響，這表明木丹顆粒沒有降血糖的作用；同時(shí)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)木丹顆?？梢燥@著的降低糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡、減緩或減輕糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)病理損傷的程度，表明木丹顆粒對糖尿病大鼠的背根神經(jīng)節(jié)具有十分顯著的保護(hù)作用，這也可以推斷木丹顆粒對糖尿病并發(fā)的周圍神經(jīng)病變具有保護(hù)作用。

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The Effects of MuDan Granules on Neuron Apoptosis of Dorsal Root Ganglion of STZ-induced Diabetic Rats

LI Yingying，YU Shijia
The First Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China

Objective：To explore the effects of MuDan granules on neuron apoptosis of dorsal root ganglion of STZ-induceddiabeticrats.Methods：Fiftyratswererandomizedintonormalcontrolgroup（n=11），themodelgroup（n=13），mecobalamin tablets group（n=13）and MuDan granules group（n=13），diabetic model was induced and replicated，normal control group and the model group accepted intragastric administration of physiological saline，mecobalamin tablets group and MuDan granules group received intragastric administration of mecobalamin tablets and MuDan granules respectively，the changes of blood glucose，cellular apoptosis positive percentage of dorsal root ganglion and the morphology of dorsal root ganglion were observed in the rats of different groups.Results：The level of blood glucose in the model group after medication was higher than that before medication obviously（P＜0.05），there was on obvious changes in the comparison between before and after medication in mecobalamin tablets group and MuDan granules group（P＞0.05）；the model group，mecobalamin tablets group and MuDan granules group were less than normal control group in cellular apoptosis positive percentage of dorsal root ganglion after medication（P＜0.05）；MuDan granules group and mecobalamin tablets group were less than the model group in cellular apoptosis positive percentage of dorsal root ganglion after medication（P＜0.05）；although morphological structure of dorsal root ganglion of the rats in Mu－Dan granules group and mecobalamin tablets group appeared the injury similar to that of the model group，the degrees of injury were less than these of the model group（P＜0.05）.Conclusion：MuDan granules could fight against neuron apoptosis of dorsal root ganglion of STZ-induced diabetic rats.

MuDan granules；diabetes mellitus；dorsal root ganglion；neuron apoptosis

R285.5

A

1004-6852（2016）06-0016-03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號：81072912）

李瑩瑩（1976—），女，副主任醫(yī)師。研究方向：糖尿病慢性并發(fā)癥的中西醫(yī)結(jié)合治療。