TRIM24介導(dǎo)肺癌細胞吉非替尼耐藥機制探討

李海英 王慶苓 包海軍 張恒 莊瑩

在過去的30年里我國肺癌的發(fā)生率逐步上升，與其他國家一樣其死亡率已經(jīng)居惡性腫瘤之首，手術(shù)是治愈非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）的有效方法，但只有約30%的NSCLC患者擁有手術(shù)機會，而放化療治療NSCLC的疾病緩解率分別只有25%-35%和15%-20%[1]。近年來以表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）為靶點的腫瘤分子靶向治療的研究成為了腫瘤治療研究的熱點，其中以吉非替尼和厄洛替尼為代表[2]，然而大多數(shù)患者并不能從這一療法中獲益，究其原因是這些患者最終都表現(xiàn)為對抗EGFR療法產(chǎn)生耐藥，包括原發(fā)性和繼發(fā)性耐藥。因此，探究提高EGFR靶向治療敏感性的分子機制以及干預(yù)耐藥的靶點在NSCLC的臨床靶向治療中具有重要的臨床意義。

TRIM24是三重基序蛋白家族中的一員，最初命名為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1α（transcription intermediary factor 1α,TIF1α），是維甲酸信號通路的共調(diào)節(jié)因子[3-5]。TRIM24異常表達可能通過多種分子機制促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。早期研究[6-8]證實TRIM24通過染色體異位形成致癌性融合蛋白從而促進急性早幼粒細胞白血病、乳頭狀甲狀腺癌及骨髓增生異常綜合征等腫瘤的發(fā)生發(fā)展。TRIM24在正常的胚胎干細胞中存在大量的細胞核表達狀態(tài)，隨著分化和器官形成而逐漸減少，僅僅在少數(shù)器官中殘存如生殖器[9,10]，最近研究證實從乳腺導(dǎo)管上皮細胞到乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中TRIM24的表達逐漸增多，且隨著TRIM24表達的增加，臨床預(yù)后越差[11]，TRIM24能促進P53泛素化降解，因此可作為一個治療靶點以恢復(fù)P53的腫瘤抑制功能來治療腫瘤[12]。TRIM24能夠通過與雌激素受體結(jié)合而激活雌激素受體依賴性蛋白從而促進腫瘤細胞的增殖及腫瘤的發(fā)展[13,14]。但TRIM24是如何促進肺癌發(fā)生發(fā)展這一分子機制尚不清楚，TRIM24是否與臨床肺癌化療耐藥相關(guān)更未見報道。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 人肺癌細胞系A(chǔ)549購自American Type Culture Collection（Manassas,VA,USA）。細胞培養(yǎng)用DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco，胎牛血清購自碧云天。ShRNA-TRIM24（M-005387-03-0005）和陰性對照ShRNA#1（D-001810-01-20）購自Dharmacon，轉(zhuǎn)染試劑購自Qiagen。RNA提取試劑，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Realtime PCR試劑盒及PCR引物合成購自Takara。P-BAD、BAD、Bcl-xL、Bcl-2、p-AKT、AKT、P85、PIK3CA和PTEN單克隆抗體購自CST；TRIM24單克隆抗體購自proteintech；β-actin抗體購自Santa Cruz；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠及山羊抗兔IgG購自Santa Cruz。BCA法蛋白定量試劑盒購自碧云天，裂解液及超敏發(fā)光試劑盒購自Pierce。流式凋亡檢測試劑盒購自BD。

1.2 細胞培養(yǎng) 肺癌細胞系A(chǔ)549使用含有10%的小牛血清DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，每兩天換一次液，并用0.25%的胰蛋白酶進行消化傳代。取對數(shù)生長的細胞，分為三組：亂序?qū)φ战M（ShCON）、ShTRIM24組和ShTRIM24+Gifitinib組。每次實驗同一個處理因素設(shè)兩個復(fù)孔，重復(fù)3次實驗。

1.3 實時定量PCR 細胞提取總RNA后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR Green法，進行Real-time PCR擴增，總體積20 μL。擴增過程如下：95 °C，30 s；95 °C，5 s；60°C，30 s，40個循環(huán)。β-actin作為內(nèi)參?；蛳鄬Ρ磉_水平計算方式如下：ΔCt=Ctgene-Ctreference，增加倍數(shù)用2-ΔΔCt方法計算。每次試驗均做3個重復(fù)孔。

1.4 MTT法檢測細胞增殖實驗 將單個細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μL含1,500個細胞，培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL的CCK8試劑（Dojindo,Gaithersburg,MD）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出后450 nm波長下測定各孔光吸收值，以不含細胞的等體積培養(yǎng)基作對照，連續(xù)測量5天，根據(jù)數(shù)值繪制細胞生長曲線。

1.5 細胞凋亡檢測 細胞分為三組亂序?qū)φ战M（ShCON）、ShTRIM24組和ShTRIM24+Gifitinib組，使用PBS清洗兩次，0.25%胰蛋白酶消化，用培養(yǎng)基終止消化后，將細胞收集到EP管中，1,000 rpm 4 °C離心5 min后，去上清。用PBS洗兩遍后每個樣本中加400 μL緩沖液，吹打成單細胞懸液，后避光加入FITC/Annexin V 10 μL和PI 5 μL染色20 min后上機檢測。

1.6 Western blot法檢測蛋白表達 收集細胞并加入裂解液充分裂解，低溫高速離心（4 °C,12,000 rpm/min,30 min），提取上清為總蛋白。每個泳道加入總蛋白60 μg，12%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)?。?0 V,120 min）到PVDF上。5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h?？筆-BAD、BAD、Bcl-xL、Bcl-2、p-AKT、AKT、P85、PIK3CA、PTEN、TRIM24和β-actin（1:1,000）4 °C孵育過夜。分別與對應(yīng)的二抗（1:2,000）室溫孵育2 h，ECL顯色，結(jié)果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀采集。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用Mean±SD表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌細胞對EGFR-TKI藥物的敏感性與TRIM24的表達水平相關(guān) 應(yīng)用MTT和流式細胞儀檢測肺癌細胞系A(chǔ)549中干擾內(nèi)源性TRIM24及干擾TRIM24后加入吉非替尼后細胞增殖和凋亡的變化，結(jié)果顯示：在A549細胞中干擾TRIM24后細胞增殖減弱，而干擾TRIM24同時加入吉非替尼（1 μmol/L）后細胞增殖明顯減弱（P＜0.05），因此TRIM24可以提高吉非替尼對腫瘤增殖能力的抑制率（圖1A）。在A549細胞中干擾TRIM24后細胞凋亡增加（ShCONvsShTRIM24：2.72±0.32vs5.27±0.40,P＜0.05），而干擾TRIM24同時加入吉非替尼組凋亡明顯增加（ShTRIM24vsShTRIM24+Gifitinib:5.27±0.40vs7.19±0.33,P＜0.05），因此TRIM24增加了吉非替尼誘導(dǎo)的凋亡水平（圖1B）。

圖1 肺癌細胞對EGFR-TKI藥物的敏感性與TRIM24的表達水平相關(guān)。A：在A549細胞中干擾TRIM24抑制細胞增殖，而干擾TRIM24同時加入吉非替尼（1 μmol/L）后對腫瘤增殖能力抑制更為明顯；B、C：凋亡檢測結(jié)果顯示，A549細胞中干擾TRIM24增加了細胞凋亡水平，而干擾TRIM24同時加入吉非替尼誘導(dǎo)的細胞凋亡更為明顯。*：P＜0.05。Fig 1 The sensitivity of lung cancer cells to EGFR -TKI drug associated with the expression level of TRIM24.A：Tranfection of ShTRIM24 can improve the inhibition of cell proliferation,and ShTRIM24 with Gefitinib can reduce cell proliferation obviously in A549 cell；B,C：Tranfection of ShTRIM24 can improve the cell apoptosis and ShTRIM24 with Gefitinib can improve the cell apoptosis obviously in A549 cell.EGFR-TKI：epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor.*：P＜0.05.

2.2 TRIM24在肺癌細胞系A(chǔ)549和PC9中對凋亡相關(guān)蛋白的影響 在肺癌細胞系A(chǔ)549中干擾TRIM24后收集細胞，提取總蛋白，用Western blot方法檢測TRIM24及凋亡相關(guān)蛋白P-BAD、BAD、Bcl-xL、Bcl-2等蛋白表達，干擾TRIM24后P-BAD表達明顯降低，而BCL-2的表達略微降低，而干擾TRIM24同時加入吉非替尼后P-BAD和BCL-2降低更為明顯（圖2）。

2.3 TRIM24在肺癌細胞系A(chǔ)549和PC9中對AKT信號通路的影響 在肺癌細胞系A(chǔ)549中干擾內(nèi)源性TRIM24的表達引起AKT活性降低，p-AKT表達降低，而干擾TRIM24同時加入吉非替尼后AKT活性明顯降低，p-AKT表達明顯下降，而總的AKT沒有明顯的變化（圖3）。

2.4 TRIM24在肺癌細胞系A(chǔ)549和PC9中對AKT信號通路相關(guān)因子的影響 應(yīng)用實時定量PCR和Western blot方法檢測在肺癌細胞系中TRIM24對AKT信號通路相關(guān)蛋白的影響，結(jié)果顯示：在A549細胞中干擾內(nèi)源性TRIM24后引起AKT信號通路蛋白PIK3CA的mRNA及蛋白水平均下降，而干擾TRIM24同時加入吉非替尼后PIK3CA的mRNA及蛋白水平均下降更為明顯，而P85和PTEN沒有明顯變化（圖4）。

圖2 敲除TRIM24及同時加入吉非替尼引起凋亡相關(guān)蛋白的變化。敲除肺癌A549細胞中內(nèi)源性TRIM24后凋亡相關(guān)基因p-BAD表達下調(diào)，BCL-2略微下調(diào)，而干擾TRIM24同時加入吉非替尼后凋亡相關(guān)基因p-BAD、BCL-2的表達降低更為明顯。Fig 2 The expression of protein related apoptosis with tranfection of ShTRIM24 and ShTRIM24 with Gifitinib.In the Western blot outcome：The expression of p-BAD and BCL-2 is reduced with tranfection of ShTRIM24,and decreased obviously with tranfection of ShTRIM24 and Gifitinib in A549 cell,total AKT have no change in the cells.

圖3 敲除TRIM24及同時加入吉非替尼引起AKT信號通路活性的變化。Western blot結(jié)果顯示：敲除肺癌A549細胞中內(nèi)源性TRIM24后p-AKT表達下調(diào)，而干擾TRIM24同時加入吉非替尼后p-AKT下降更為明顯，總的AKT沒有明顯變化。Fig 3 The change of AKT signal pathway with tranfection of ShTRIM24 and ShTRIM24 with Gifitinib.In the In the Western blot outcome：The expression of p-AKT is reduced with tranfection of ShTRIM24,and decreased obviously with tranfection of ShTRIM24 and Gifitinib in A549 cell,total AKT have no change in the cells.

3 討論

以往研究[12]報道TRIM24 mRNA水平和蛋白水平在乳腺癌中過表達，且與雌激素受體（estrogen receptor,ER）和孕激素受體（progesterone receptor,PR）密切相關(guān)，是乳腺癌的一個不良預(yù)后指標。但TRIM24是如何促進肺癌發(fā)生發(fā)展這一分子機制尚不清楚，TRIM24是否與臨床肺癌化療耐藥相關(guān)更未見報道。我們的前期研究結(jié)果[15]證實肺癌中的研究證實TRIM24的表達與肺癌的p-TNM分期和分化程度密切相關(guān)，且與細胞增殖因子Ki-67和周期相關(guān)蛋白CyclinD1、p-Rb密切相關(guān)，這一切表明TRIM24在肺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。之前研究報道在乳腺癌細胞中TRIM24能夠促進P53泛素化，從而負性調(diào)控P53蛋白的含量[12]，我們前期的研究結(jié)果證實在肺癌細胞中干擾內(nèi)源性TRIM24后G1期細胞增多，而S期和G2/M期細胞減少，即干擾內(nèi)源性TRIM24后阻滯細胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)化，同時促進了細胞凋亡[15]。同時這次實驗發(fā)現(xiàn)在吉非替尼作用下，在A549細胞中使用ShRNA干擾TRIM24可以提高吉非替尼對腫瘤增殖能力的抑制率，增加吉非替尼誘導(dǎo)細胞凋亡水平，同時引起凋亡相關(guān)蛋白的變化。上述結(jié)果強烈提示我們：TRIM24過表達能夠影響肺癌細胞凋亡及相關(guān)基因的變化，能夠影響肺癌細胞產(chǎn)生對EGFR-TKI的耐藥性，但是TRIM24是如何導(dǎo)致凋亡變化，以及TRIM24又是如何介導(dǎo)肺癌細胞產(chǎn)生吉非替尼耐藥的分子機制等，目前尚不清楚。近期有許多的研究報道[16-18]指出：EGFR非依賴性的PI3K-AKT通路持續(xù)激活在EGFR-TKI的耐藥中發(fā)揮了重要作用，AKT信號通路可以通過多種途徑抑制凋亡促進細胞存活。因此我們應(yīng)用實時定量PCR及Western blot方法檢測了AKT的活性及AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達，研究發(fā)現(xiàn)在A549細胞中干擾內(nèi)源性TRIM24的表達引起AKT活性及通路相關(guān)蛋白PIK3CA降低，而干擾TRIM24同時加入吉非替尼后AKT活性及通路相關(guān)蛋白PIK3CA降低更為明顯，因此TRIM24可能通過與PIK3CA結(jié)合激活A(yù)KT信號通路，從而調(diào)控肺癌細胞對吉非替尼的耐藥，更詳細具體的分子機制我們將進一步進行探討，這將為肺癌臨床治療提供重要的理論依據(jù)。

圖4 敲除TRIM24及同時加入吉非替尼引起AKT信號通路關(guān)鍵因子的變化。A：mRNA表達改變；B：蛋白表達。敲除肺癌A549細胞中內(nèi)源性TRIM24后AKT信號通路相關(guān)蛋白PIK3CA的mRNA和蛋白均表達下調(diào)，而干擾TRIM24同時加入吉非替尼后PIK3CA的mRNA和蛋白表達降低更為明顯，相關(guān)因子p85和PTEN未見明顯變化。*：P＜0.05。Fig 4 The change of protein related AKT signal path way with tranfection of ShTRIM24 and ShTRIM24 with Gifitinib.A：the expression of mRNA；B：the expression of protein.The expression of PIK3CA is reduce in mRNA and protein with tranfection of ShTRIM24,and decreased obviously with tranfection of ShTRIM24 and Gifitinib in A549 cell,the p85 and PTEN have no change.*：P＜0.05.