免疫組化法檢測EML4-ALK融合突變價值的meta分析

劉暢 蔡璐 鐘殿勝 王競

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）和K-ras作為最早被研究的治療靶點，已經(jīng)涌現(xiàn)出許多針對這些靶點的制劑，并已進(jìn)入臨床，取得較好的臨床效果[1-3]。隨著研究的不斷深入，繼上述靶點之后，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中又出現(xiàn)一新型靶點基因，即棘皮動物微管相關(guān)蛋白4-間變性淋巴瘤激酶（echinoderm microtubule-associated protein 4-anaplastic lymphatic tumor kinase,EML4-ALK）融合基因。EML4-ALK是在NSCLC患者腫瘤標(biāo)本中由Soda等[4]于2007年首次發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步探索表明，該基因是由2號染色體短臂內(nèi)轉(zhuǎn)位inv(2)(p21p23)的EML4與ALK融合而成[5-7]。

針對ALK的抑制劑克唑替尼已通過美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration,FDA）批準(zhǔn)應(yīng)用于肺癌患者的III期臨床研究中[8]，Shaw等[9]在第47屆美國臨床腫瘤學(xué)會（American Society of Clinical Oncology,ASCO）大會上對其研究的報告表示克唑替尼可明顯提高患者的生存率。探索和建立能夠準(zhǔn)確快速檢測出NSCLC患者EML4-ALK融合突變的方法，將有助于篩選出適合ALK-TKI治療的優(yōu)勢人群，為肺癌患者的個體化靶向治療提供依據(jù)。

免疫組化法（immunohistochemistry,IHC）操作簡便，是實驗室最普遍適用的蛋白質(zhì)的篩查與診斷方法[10]。該方法可以在不損傷細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征的前提條件下，通過檢測腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性抗原的表達(dá)，從而與正常組織相鑒別，以確定有無ALK融合基因的表達(dá)[11,12]。另外IHC法還可以同時將正常組織與病理組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行鑒別，實現(xiàn)快速篩選的過程[13]。已有研究[14,15]發(fā)現(xiàn)應(yīng)用IHC法對EML4-ALK融合基因突變進(jìn)行檢測的結(jié)果，經(jīng)熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization,FISH）和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR）法驗證后，其結(jié)果具有高度的一致性。本文通過診斷試驗meta分析的方法，比較特異性抗體免疫組化法與“金標(biāo)準(zhǔn)”FISH法的敏感度、特異度，以明確特異性抗體IHC作為篩查方法的可行性及臨床應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 篩選文獻(xiàn)資料 按照以下檢索詞通過英文數(shù)據(jù)庫pubmed檢索所有符合的文獻(xiàn)。檢索的關(guān)鍵詞為：EML4-ALK、immunohistochemistry、NSCLC、FISH。中文檢索通過中國期刊全文數(shù)據(jù)庫，檢索關(guān)鍵詞：肺癌、EML4-ALK、免疫組化。末次檢索日期為2015年2月25日。

1.2 文獻(xiàn)資料納入標(biāo)準(zhǔn) 使用兔單克隆抗體D5F3（VENTANA）檢測EML4-ALK融合基因存在情況，同時應(yīng)用檢測金標(biāo)準(zhǔn)FISH法比較其敏感度和特異度的文獻(xiàn)。①研究對象采用FISH法為金標(biāo)準(zhǔn)，被檢測者所患肺癌的病理類型需要在文獻(xiàn)中注明；②可以在文章中根據(jù)已提供的數(shù)據(jù)計算出各個研究案例的真陽性、假陽性、真陰性、假陰性或者文章中已明確計算出上述各個數(shù)值；③參加研究的各個組中的案例數(shù)均應(yīng)超過20；④研究類型為含有兔單克隆抗體D5F3（VENTANA）檢測對NSCLC患者EML4-ALK融合基因檢測價值的回顧性或前瞻性研究；⑤文獻(xiàn)中EML4-ALK融合基因的檢測通過可以進(jìn)行評價的具有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的免疫組化方法及標(biāo)準(zhǔn)（IHC陽性定義：5%以上腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)著色定義為陽性，F(xiàn)ISH法標(biāo)本由NSCLC患者的經(jīng)福爾馬林固定和石蠟包埋標(biāo)本獲得）。

1.3 文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn) 具有以下之一標(biāo)準(zhǔn)者排除該項研究。①文獻(xiàn)中未規(guī)定統(tǒng)一判定標(biāo)準(zhǔn)的免疫組化法檢測EML4-ALK融合基因；②反復(fù)模型實驗中，文獻(xiàn)中的樣本量偏小或者發(fā)表時間較早也應(yīng)排除；③IHC與除此之外的另一些檢驗方法（如RT-PCR法）比較，而無FISH對照的文獻(xiàn)，主要因為RT-PCR法雖為臨床上較為常見的檢測手段，雖敏感度較高，但仍無法檢測出未知的突變，并且對于RNA的質(zhì)量有較高的要求，臨床上的組織標(biāo)本大多數(shù)是經(jīng)過福爾馬林的固定、蠟塊包埋處理后，RNA易大面積解體，導(dǎo)致其靈敏度的減低，此外很難避免的是由于擴增所致的假陽性結(jié)果，這些對于免疫組化法的陰性預(yù)測值（negative predictive value,NPV）、陽性預(yù)測值（positive predictive value,PPV）的結(jié)果統(tǒng)計均會造成一定的干擾；④綜述、社論、摘要、評論。

1.4 異質(zhì)性分析 根據(jù)受試者工作特征曲線 （receiver operating characteristic curve,ROC）平面上由各個研究的精準(zhǔn)估測量所繪制出的圖像是否與“肩臂”狀的典型分布相一致，從而對由閾值效應(yīng)所導(dǎo)致的異質(zhì)性對各個研究對象逐一分析；通過Q檢驗對由非閾值效應(yīng)所導(dǎo)致的異質(zhì)性在各個研究對象逐一鑒定，之后依據(jù)異質(zhì)性的分析結(jié)果來篩選出適宜的統(tǒng)計學(xué)試驗?zāi)Ｐ停酝瓿上乱徊降膍eta分析。

1.5Meta分析Meta分析對比特異性抗體IHC法與FISH比較的特異度、敏感度，對此方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行評價判定。整理并綜合各個試驗方法的最初數(shù)據(jù)（真陰性、真陽性、假陰性、假陽性的例數(shù)），使用DerSimonian Laird隨機效應(yīng)模型計算兔單克隆抗體D5F3（VENTANA）免疫組織化學(xué)方法的特異度和敏感度的平均值，以及95%置信區(qū)間（confidence interval,CI）和各自比值。將SROC曲線通過Mose's constant線性模型進(jìn)行擬合，通過Q統(tǒng)計量、診斷比值比（diagnositic odds ratio,DOR）以及曲線下面積（aera under curve,AUC）對NSCLC患者IHC法檢測EML4-ALK融合基因存在情況的準(zhǔn)確度進(jìn)行評價。將曲線的X軸定義為此次meta分析中所錄入的各個研究對象的（1-特異度），Y軸定義為敏感度，從而勾畫出SROC曲線，通過直接視覺感官對診斷實驗的準(zhǔn)確性進(jìn)行評估，曲線下所圍成的面積越大，曲線越接近于左上角，則具有較高的診斷準(zhǔn)確性。本文統(tǒng)計用軟件為Meta-Disc 1.4，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢索結(jié)果及納入文獻(xiàn) 依照所列出的檢索關(guān)鍵詞進(jìn)行初級檢索，共找到59篇文獻(xiàn)。排除摘要和閱讀文題16篇，初步納入所需文獻(xiàn)43篇。深入閱讀全文，將不符合錄入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)排除共25篇，排除具有重復(fù)內(nèi)容的文獻(xiàn)共2篇，排除所需初始數(shù)據(jù)不能完全獲取的文獻(xiàn)共5篇，最終共有11篇文獻(xiàn)符合納入標(biāo)準(zhǔn)，如圖1。

2.2 納入研究的基本特征和質(zhì)量評價 本論文共納入11項研究，EML4-ALK融合基因免疫組化累計病例3,234例，各研究IHC法特異度、敏感度及例數(shù)參見表1。

2.3 異質(zhì)性檢驗 效應(yīng)量將DOR作為參照標(biāo)準(zhǔn)，分析特異性抗體D5F3免疫組化與熒光標(biāo)記法FISH的異質(zhì)性，Q檢驗顯示Cochran-Q為16.5，P＞0.05，I2為39.4%，ALK抗體免疫組化研究間不存在異質(zhì)性，本文分析選用隨機效應(yīng)模型。

2.4Meta分析 應(yīng)用特異性抗體IHC法的特異性、敏感度和似然比。圖2所示為EML4-ALK特異性抗體對NSCLC診斷敏感度的森林圖。ALK抗體鑒別NSCLC患者EML4-ALK融合基因的平均敏感度為0.99（95%CI:0.96-1.00）。圖3所示為EML4-ALK特異性抗體對NSCLC診斷特異度的森林圖。ALK抗體鑒別EML4-ALK融合基因的平均特異度為0.95（95%CI:0.94-0.96）。圖4所示為陽性似然比（positive likelihood ratio,PLR）為50.64（95%CI:8.77-292.61）。圖5所示為EML4-ALK特異性抗體對NSCLC診斷EML4-ALK融合基因的陰性似然比（negative likelihood ratio,NLR）為0.06（95%CI:0.03-0.12）。圖6所示為EML4-ALK特異性抗體對NSCLC診斷EML4-ALK融合基因的DOR為1,135.00（95%CI:337.10-3,821.46）。圖7所示為EML4-ALK特異性抗體對NSCLC診斷EML4-ALK融合基因的SROC曲線。其AUC為0.992,3（SEAUC=0.003,2），Q*統(tǒng)計量為0.964,4（SEQ*=0.008,7）。

2.5 異質(zhì)性分析 由EML4-ALK特異性抗體的SROC曲線可見，各研究對應(yīng)的點散在分布，呈“肩臂”狀外觀，分別計算（1-特異性）對數(shù)與靈敏度對數(shù)的Spearman相關(guān)系數(shù)ρ，EML4-ALK特異性抗體的ρ值為-0.126，P＞0.05，顯示無閾值效應(yīng)存在。

圖1 文獻(xiàn)選擇流程圖Fig 1 Flow chart for study selection

圖2 EML4-ALK抗體敏感度森林圖Fig 2 The forest plots of EML4-ALK antibody sensitivity ；EML4-ALK ：echinoderm microtubule-associated protein 4-anaplastic lymphatic tumor kinase.

圖3 EML4-ALK抗體特異度森林圖Fig 3 The forest plot of EML4-ALK antibody specificity

表1 納入文獻(xiàn)的樣本數(shù)及免疫組化方法的敏感度及特異度Tab 1 Samples of included studies and the sensitivity and specificity by IHC

圖5 EML4-ALK抗體NLR森林圖Fig 5 The forest plot of EML4-ALK antibody negative likelihood ratio (NLR)

圖6 EML4-ALK抗體DOR森林圖Fig 6 The forest plot of EML4-ALK antibody diagnositic odds ratio (DOR)

綜上所述，EML4-ALK特異性抗體免疫組化法檢測EML4-ALK融合基因，該方法靈敏度高，特異度較高，可靠易行，免疫組化法在對融合基因的篩檢方面具有高度的可行性，可作為臨床上一種有應(yīng)用價值的檢測手段。

3 討論

圖7 EML4-ALK抗體的SROC曲線Fig 7 The summary receiver operating characteristic curve (SROC) curve of EML4-ALK antibody

本文通過meta分析對錄入的11項研究進(jìn)行整合，根據(jù)SROC曲線的擬合及診斷效應(yīng)量的合并，將ALK特異性抗體免疫組化法與免疫熒光原位雜交法對EML4-ALK融合基因的診斷效能進(jìn)行比較。結(jié)果顯示ALK特異性抗體鑒別NSCLC患者EML4-ALK的平均特異度為0.95（95%CI:0.94-0.96），平均敏感度為0.99（95%CI:0.96-1.00）。綜合分析結(jié)果提示免疫組化法具有較高的敏感性與特異性，參考相關(guān)文獻(xiàn)[26,27]報道，不同研究的特異性和敏感性多波動在80%-100%和90%-100%。本文結(jié)論與相關(guān)文獻(xiàn)相符。

通常情況下可以認(rèn)為，當(dāng)滿足NLR＜0.1或PLR＞10時，大體上能夠明確或者除外某項診斷[28]。本研究得出的ALK特異性抗體診斷EML4-ALK融合基因的NLR為0.06（95%CI:0.03-0.12），PLR為50.64（95%CI:8.77-292.61），這一結(jié)果顯示免疫組化結(jié)果不論呈現(xiàn)為陰性或陽性，均可作為一種輔助手段，指導(dǎo)臨床醫(yī)師對某項疾病做出判斷，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

DOR是對診斷試驗的分析結(jié)果和某種疾病關(guān)聯(lián)度的一種反映指標(biāo)。當(dāng)其值在1以下時，提示正常人可能比陽性患者通過診斷性試驗判定為陽性的概率更大；當(dāng)其值等于1時，提示正常人和陽性患者無法經(jīng)診斷性試驗被區(qū)分；當(dāng)其值在1以上時，表示此診斷性試驗的鑒別效果隨數(shù)值的增大而更好[29]。本研究中ALK特異性抗體診斷EML4-ALK融合基因的DOR為1,135.00（95%CI:337.10-3,821.46），表明診斷性試驗的鑒別診斷結(jié)果良好。

本研究將符合錄入標(biāo)準(zhǔn)的11篇文獻(xiàn)所記錄的完整數(shù)據(jù)，計算整合NLR、PLR、DOR、特異度和敏感度，描繪SROC曲線，SROC曲線又稱作綜合受試者工作特征曲線，無異質(zhì)性的干擾，能夠整合特異度和靈敏度的分析結(jié)果[30]。從整體上對診斷試驗的準(zhǔn)確度進(jìn)行評定，該曲線的X坐標(biāo)軸為1-特異度，Y坐標(biāo)軸為靈敏度，理論依據(jù)為使FRO與TRP之間的非線性關(guān)系經(jīng)過FRP、TRP的Logit變換后轉(zhuǎn)換成為一種線性關(guān)系，采用最小乘法對各項參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，得出評估診斷性試驗準(zhǔn)確程度的統(tǒng)計結(jié)果，同時列出SROC曲線回歸方程。分析本研究的SROC曲線表明，ALK特異性抗體的AUC為0.992,3，Q*統(tǒng)計量為0.964,4，曲線接近左上角，曲線下所圍成的面積范圍大，表明上述特異性抗體免疫組化法鑒別EML4-ALK融合突變的準(zhǔn)確度較高。本研究所錄入的個體對象間不存在異質(zhì)性，表明研究間的變異僅由于抽樣誤差造成，無需進(jìn)一步做meta回歸，即探索異質(zhì)性來源的可能因素。

本文meta分析的不足：①錄入的研究對象具有局限性：通過盲法測查以及盲法評判特異性抗體免疫組化法的診斷性試驗，從而盡可能降低診斷的傾向性，然而大部分文獻(xiàn)報道未標(biāo)明檢測方法是否應(yīng)用了盲法，有可能會出現(xiàn)檢測結(jié)果發(fā)生偏倚；②Meta分析具有局限性：篩選獲得的文獻(xiàn)尚不全面。數(shù)據(jù)庫的檢索范圍僅限于已公開發(fā)表的文獻(xiàn)報道，一些未發(fā)表的文章無法獲取，如會議論文，對于一些灰色文獻(xiàn)存在漏檢的可能性；檢索文獻(xiàn)的語言類型僅限于英文和中文，除此之外的其他語言類型可能會被漏檢；③納入本meta分析的樣本量較少，需要更進(jìn)一步的大樣本量來驗證結(jié)論。

綜上所述，特異性抗體免疫組化法檢測EML4-ALK融合基因突變的診斷準(zhǔn)確度高，操作簡便，具有一定的臨床應(yīng)用前景，且隨著特異性抗體的發(fā)展，IHC將有可能成為NSCLC患者EML4-ALK融合基因突變檢測的常規(guī)篩查程序，可首選作為一種簡單標(biāo)準(zhǔn)的NSCLC患者快速檢測方法。