自體積液癌細(xì)胞培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)對(duì)晚期肺腺癌化療的臨床應(yīng)用價(jià)值

陳良 楊順芳 蔣錦琪 張穎 馮輝 曹杰 葛歆悅 謝文暉

隨著肺癌研究的不斷深入，針對(duì)肺癌的新技術(shù)、新藥物的運(yùn)用取得了長足進(jìn)步，然而依然沒有一項(xiàng)新技術(shù)、一種新藥物能完全取代化學(xué)治療，化療依然是中晚期肺癌的常規(guī)治療手段。然而，肺癌的異質(zhì)性、多態(tài)性、耐藥性必然要求治療的個(gè)體性，因此如何選擇最佳化療方案、實(shí)現(xiàn)肺癌化療的個(gè)體化以及效果的最大化仍是臨床值得進(jìn)一步探索的課題。本研究嘗試從晚期肺腺癌患者的胸腔或心包積液提取癌細(xì)胞，在自體積液中培養(yǎng)并進(jìn)行化療敏感性試驗(yàn)（簡稱藥敏試驗(yàn)），以指導(dǎo)化療方案的選擇，通過臨床化療效果評(píng)判該方法對(duì)晚期肺腺癌化療的指導(dǎo)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集我科2010年4月-2013年3月收治的肺癌患者50例（表1），其中男性24例，女性26例，年齡54歲-66歲。結(jié)合影像學(xué)和病理學(xué)確診為原發(fā)性肺腺癌，均合并胸腔積液和/或心包積液，積液細(xì)胞學(xué)檢查明確腺癌細(xì)胞的存在，其中部分患者同時(shí)合并骨、腦、肺等遠(yuǎn)處臟器的轉(zhuǎn)移，按國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control, UICC）第7版分期[1]均為IV期病例。所有患者都具有影像學(xué)可評(píng)估的靶病灶，且其主要臟器功能正常，積液引流后全身情況良好，功能狀態(tài)評(píng)分（Zubrod-ECOG-WHO score, ZPS）≤2分，無化療禁忌癥，均能耐受全身化療，且既往無放療和/或化療病史。所有患者在整個(gè)生命期內(nèi)均無靶向藥物應(yīng)用史。隨訪截止日期至2016年3月31日。

1.2 病例分組 所有病例在治療前均通過胸腔/心包閉式引流術(shù)將積液完全引盡，胸腔內(nèi)注入沙培林（注射用A群鏈球菌）行胸膜粘連術(shù)，心包內(nèi)注入卡鉑行局部化療。積液控制后10 d-14 d進(jìn)行全身化療。

入選患者中有40例在胸腔/心包積液引流時(shí)于無菌條件下留取積液300 mL-500 mL，分離腫瘤細(xì)胞后于自體（xeno-free）積液中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。其中25例（62.5%）成功獲取腫瘤細(xì)胞并能培養(yǎng)擴(kuò)增至目標(biāo)數(shù)量（見下文1.3節(jié)），入選藥敏組（chemo-sensitivity group, CSG）進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇最佳化療方案進(jìn)行全身化療；其余15例未能有效培養(yǎng)出目標(biāo)數(shù)量腫瘤細(xì)胞以及10例未行細(xì)胞培養(yǎng)的患者列為對(duì)照組（control group,CG），直接進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性化療。

1.3 癌細(xì)胞培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)方法 參照以往方法[2-5]，將采集的新鮮積液加肝素鈉（10 U/mL）抗凝，并加入青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）和慶大霉素（5 U/mL）抗菌，隨機(jī)將部分積液移入10個(gè)25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5%CO2德國賀利氏BB16二氧化碳孵養(yǎng)箱內(nèi)孵育。剩余積液作為培養(yǎng)基于孵箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?4 h后，取培養(yǎng)瓶、棄上清液、保留瓶底貼壁細(xì)胞，加入備用積液的上清液平均培養(yǎng)11 d，見貼壁細(xì)胞總數(shù)在30×104-40×104，取培養(yǎng)瓶、棄上清，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液（Gibco,Carlsbad），以吸管吹打后移入15 mL離心管離心，棄上清，加入RPMI-1640培養(yǎng)液12 mL，吹打均勻后按 3×103-5×103個(gè)細(xì)胞/0.1 mL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板[6]。

孵育24 h后，按各化療藥物的人體峰藥濃度設(shè)高、中、低濃度藥物組（以峰藥濃度為高濃度組，依次稀釋10倍為中、低濃度組）和癌細(xì)胞對(duì)照組，每組3復(fù)孔。所用化療藥物選用目前臨床常用方案，包括培美曲塞（pemetrexed, PEM）、吉西他濱（gemcitabine, GEM）、長春瑞濱（vinorelbine, NVB）、多西他賽（docetaxel,DOC）、紫杉醇（taxol, TXL）、異環(huán)磷酰胺（ifosfamide,IFO）、順鉑（cisplatin, DDP）和卡鉑（carboplatin,CBP）。加藥設(shè)組后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，調(diào)整液體體積為0.1 mL/孔，加入CCK-8反應(yīng)液（Dojindo, Kumamoto）0.01 mL/孔。孵育1 h后以酶標(biāo)儀450 nm波長檢測吸光度（optical density, OD）值[7]，藥物組OD值取3復(fù)孔平均值，計(jì)算癌細(xì)胞相對(duì)抑制率（inhibition rate, IR）=（對(duì)照組OD值-藥物組OD值）/對(duì)照組OD值×100%[8]。IR＞30%判為敏感，70%＞IR≥50%為中度敏感，IR≥70%為高度敏感。

1.4 化療方案及療效評(píng)價(jià) 所有患者均采用以鉑類為基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)二聯(lián)化療方案，每2個(gè)周期評(píng)判化療效果，但為了便于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，前4周期化療無論效果如何均保持方案不變（化療前均需簽署知情同意書）。4個(gè)周期后，療效判為有效者繼續(xù)鞏固化療，至疾病進(jìn)展時(shí)按經(jīng)驗(yàn)選擇二線乃至三線方案化療；療效穩(wěn)定者共化療6個(gè)周期后進(jìn)行隨訪觀察；而療效判為進(jìn)展者則直接按經(jīng)驗(yàn)選擇二線乃至三線方案化療。當(dāng)化療的臨床獲益消失或患者無法繼續(xù)耐受化療時(shí)則終止化療而隨訪。其中，藥敏組患者以藥敏試驗(yàn)中癌細(xì)胞相對(duì)抑制率最高者為優(yōu)選標(biāo)準(zhǔn)，PEM、GEM、NVB、DOC、TXL和IFO中取其一，DDP和CBP取其一；對(duì)照組以經(jīng)驗(yàn)方案化療。

療效評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)包括：客觀緩解率（objective response rate, ORR）和疾病控制率（disease control rate, DCR）：以4個(gè)周期化療后胸部X線計(jì)算機(jī)體層攝影（computed tomography, CT）檢查為參考，按2009年實(shí)體瘤療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors,RECIST）1.1版[9]對(duì)照靶病灶變化，根據(jù)病灶的最大長徑的總和計(jì)算，判為：①完全緩解（complete response,CR）：所有靶病灶全部消失；②部分緩解（partial response, PR）：所有靶病灶的最大長徑總和減少30%以上；③病變進(jìn)展（progressive disease, PD）：觀察期間與最小值相比最大長徑的總和增加20%以上或出現(xiàn)新病灶；④穩(wěn)定（stable disease, SD）：既不能滿足PR又不能滿足PD的病變。ORR=CR+PR；DCR=CR+PR+SD。無進(jìn)展生存期（progression-free survival, PFS）：從治療開始至腫瘤發(fā)生惡化或死亡的時(shí)間。總生存期（overall survival,OS）：治療開始至死亡或末次隨訪的時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS 8.1軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。兩組治療總緩解率和疾病控制率的比較采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法，生存期比較采用Log-rank檢驗(yàn)，均以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌細(xì)胞培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏組患者的原代腺癌細(xì)胞于自體積液中獲得良好生長和擴(kuò)增（圖1示其中一例自體胸腔積液培養(yǎng)的原代肺腺癌細(xì)胞），符合藥敏試驗(yàn)要求。

所用化療藥物在體外對(duì)自體積液培養(yǎng)的癌細(xì)胞的抑制率見表2。各藥物的平均抑制率隨藥物濃度的增加而增高；除中、低濃度的PEM對(duì)細(xì)胞的平均抑制率低于30%，其余藥物在不同濃度下的抑制率均＞30%；在中濃度時(shí)，除了PEM和GEM，其余藥物的抑制率均＞50%；而在高濃度時(shí)，除了PEM，其余藥物的抑制率均＞50%；所有藥物的平均抑制率均未超過70%。

在非鉑類藥物中，對(duì)平均抑制率由高到低排列，低濃度時(shí)依次為DOC、NVB、GEM、TXL、IFO和PEM，中濃度時(shí)依次為DOC、TXL、NVB、GEM、IFO和PEM，而高濃度時(shí)則為IFO、DOC、TXL、NVB、GEM和PEM；鉑類中，中、低濃度時(shí)DDP的平均抑制率略高于CBP，而高濃度時(shí)DDP與CBP相仿。然而就單個(gè)病例，各藥物的抑制率高低與總?cè)巳旱钠骄种坡实呐判虿⒎峭耆恢隆?/p>

2.2 化療效果及生存情況分析 所有50例患者均順利完成4個(gè)以上周期的全身化療，4個(gè)周期化療后的臨床療效及所有患者的生存情況見表1。兩組患者中均無CR病例，藥敏組25例患者中PR 17例（68.0%）、SD 5例（20.0%），ORR 68.0%，DCR 88.0%；對(duì)照組PR 9例（36.0%）、SD 7例（28.0%），ORR 36.0%，DCR 64.0%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)χ2檢驗(yàn)，分別進(jìn)行兩組ORR和DCR比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

至隨訪截止，藥敏組死亡21例，對(duì)照組死亡22例，均為腫瘤相關(guān)性死亡。對(duì)兩組患者生存情況進(jìn)行Kaplan-Meier法分析，藥敏組PFS為0個(gè)月-24個(gè)月，平均10.0個(gè)月，OS為6.1個(gè)月-71.2個(gè)月，平均30.2個(gè)月；對(duì)照組PFS為0個(gè)月-21個(gè)月，平均5.8個(gè)月，OS為5.8個(gè)月-44.8個(gè)月，平均21.2個(gè)月。經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，分別比較兩組PFS和OS，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

2.3 化療毒副反應(yīng) 兩組患者化療期間常見毒副反應(yīng)包括乏力、食欲減退、嘔吐、外周血白細(xì)胞下降、貧血、血小板減低、靜脈炎等，其發(fā)生率及嚴(yán)重程度因所用藥物不同而有所差異，經(jīng)對(duì)癥治療后患者均能較好耐受，無一例因毒副反應(yīng)而終止化療或調(diào)整化療劑量。

3 討論

時(shí)至今日，中晚期肺癌尤其合并胸腔或心包積液患者的預(yù)后依然不佳。雖然分子靶向藥物的研發(fā)和應(yīng)用為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的預(yù)后、生存質(zhì)量的改善作出了里程碑式的貢獻(xiàn)，然而由于患者個(gè)體差異的存在、基因突變位點(diǎn)的不同，以及當(dāng)前對(duì)于腫瘤相關(guān)突變基因的檢測能力有限而無法完全獲取所有的靶點(diǎn)信息，導(dǎo)致靶向藥物的獲益人群和獲益時(shí)間均十分有限。因此，雖然化療的效果有限且存在一定的毒副作用，但其依然是現(xiàn)階段多數(shù)中晚期肺癌患者延長生命時(shí)間的重要手段。

表1 50例肺腺癌患者的臨床特征、治療效果和生存時(shí)間Tab 1 Clinical characteristics, therapeutic effects and survival time of 50 patients with lung adenocarcinoma

圖1 一例57歲女性肺腺癌患者自體胸腔積液培養(yǎng)7 d的癌細(xì)胞相差顯微鏡圖（×40）Fig 1 The autologous carcinomatous cells derived from malignant pleural effusion in a 57 yr female with late-stage lung adenocarcinoma under the contrast phase microsope (×40)

目前針對(duì)NSCLC化療方案的選擇較大依賴于臨床醫(yī)師的治療經(jīng)驗(yàn)，缺乏個(gè)體化選擇標(biāo)準(zhǔn)，因此不可避免存在一定的盲目性，故而無法實(shí)現(xiàn)腫瘤化療的最佳效益，導(dǎo)致化療“瓶頸”的出現(xiàn)。而癌細(xì)胞藥敏試驗(yàn)為化療方案的選擇開辟了新的方向。Iwahashi等[10]報(bào)道了64例行胃大部切除術(shù)的胃癌患者在藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)下進(jìn)行全身化療后的5年生存率比經(jīng)驗(yàn)化療有明顯提高。Lau等[11]發(fā)現(xiàn)在藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)下化療的乳腺癌患者比經(jīng)驗(yàn)性化療者得到了更高的臨床緩解率（10/24vs0/12），腫瘤面積的縮小率亦有提高（75%vs26%）。國內(nèi)聶磊等[12]也通過藥敏試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)24例肝細(xì)胞癌患者的肝動(dòng)脈和門靜脈區(qū)域化療，與對(duì)照組相比，緩解率（50.0%vs20.0%）、疾病控制率（70.8%vs35.0%）及疾病進(jìn)展時(shí)間[（4.7 ±2.9）個(gè)月vs（2.6±1.3）個(gè)月]均有明顯優(yōu)勢(shì)。而對(duì)于肺癌，Kawamura等[13]曾通過膠滴腫瘤藥敏檢測技術(shù)對(duì)49例NSCLC患者行藥敏試驗(yàn)，其中22例存在敏感藥物而進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)下的全身化療，其臨床緩解率為72.7%、中位生存期為15個(gè)月；而另11例試驗(yàn)不敏感者進(jìn)行了經(jīng)驗(yàn)性化療，其緩解率為0、中位生存期僅為6個(gè)月。

表2 各化療藥物對(duì)肺腺癌細(xì)胞的抑制率（%, Mean±SD）Tab 2 Inhibitory rates of chemotherapy drugs for lung adenocarcinoma cells (%, Mean±SD)

圖2 兩組患者總生存期曲線（Kaplan-Meier），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023,4）Fig 2 Kaplan-Meier curves of overall survival probabilities for patients with advanced lung adenocarcinoma, there was significant difference between the two groups (P=0.023,4).

然而，現(xiàn)有研究中藥敏試驗(yàn)所采用的腫瘤細(xì)胞幾乎均來源于手術(shù)切取或細(xì)針穿刺所得的腫瘤組織，通過酶解或鋼網(wǎng)濾過等方法而獲得，在胎牛血清等特定培養(yǎng)液中培養(yǎng)，繼而采用四氮唑藍(lán)（MTT）、ATP生物熒光法（ATP-TCA）等[14]方法進(jìn)行抗癌藥物敏感性測定。由于腫瘤細(xì)胞來源于實(shí)體組織塊，離體后卻在非自身來源的培養(yǎng)液中生長，其離體和在體生長環(huán)境、營養(yǎng)來源存在極大差異，導(dǎo)致腫瘤離體后的生長方式、生物學(xué)特性發(fā)生了一定程度的改變，離體細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性與體內(nèi)腫瘤對(duì)化療的反應(yīng)性并非完全一致，從而喪失了藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)臨床化療的優(yōu)越性。Wu等[8]通過對(duì)353例胃癌患者進(jìn)行對(duì)照性研究，其中157例按MTT法藥敏試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)化療、196例按經(jīng)驗(yàn)方案化療，最終發(fā)現(xiàn)藥敏組的5年生存率為47.5%、經(jīng)驗(yàn)組為45.1%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能就有以上原因存在。

晚期肺癌易發(fā)生胸膜腔或心包腔轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致胸腔和/或心包積液的生成，而胸腔/心包積液正是肺癌細(xì)胞的最好來源，其獲取途徑安全、便利。同時(shí)積液又是肺癌細(xì)胞的天然培養(yǎng)基，癌細(xì)胞離體后在自體積液環(huán)境中培養(yǎng)能最大程度的模擬體內(nèi)環(huán)境，從而保持與體內(nèi)相同的生長方式和生物學(xué)特性以及對(duì)藥物的敏感性。因此，胸腔/心包積液來源并于自體積液培養(yǎng)下的癌細(xì)胞藥敏試驗(yàn)結(jié)果在一定程度上能更好地反映在體腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性，從而能更好地指導(dǎo)臨床化療方案的選擇和患者的個(gè)體化治療，提高治療效果，最終使中晚期肺癌患者能更多的從化療中獲益。

本研究以肺腺癌患者為研究對(duì)象，是因?yàn)槠湫厍?心包積液中較其他類型肺癌更容易獲取轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞，從而提高細(xì)胞培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)的成功率。通過研究發(fā)現(xiàn)，藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)下全身化療的ORR和DCR分別為68.0%和88.0%，明顯優(yōu)于對(duì)照組的36.0%和64.0%；進(jìn)而，藥敏組的PFS和OS平均分別為10.0個(gè)月和30.2個(gè)月，亦明顯長于對(duì)照組5.8個(gè)月和21.2個(gè)月。且兩組化療的毒副反應(yīng)均輕微、可控，其發(fā)生率及嚴(yán)重程度主要與不同藥物的自身特性相關(guān)。因此，自體積液癌細(xì)胞培養(yǎng)后的藥敏試驗(yàn)對(duì)晚期肺腺癌化療方案的選擇具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

然而，通過試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，目前常用化療藥物對(duì)肺癌細(xì)胞的體外抑制率總體不高，平均抑制率均未超過70%，從而可以解釋藥敏組患者全身化療的效果雖然優(yōu)于對(duì)照組但總體療效依然并不理想的原因。因此，期待更大樣本對(duì)照研究的開展和更安全有效抗腫瘤藥物的研發(fā)以進(jìn)一步提高中晚期肺癌患者個(gè)體化治療的效果，實(shí)現(xiàn)最大限度地延長生命時(shí)間、提高生命質(zhì)量。