腦轉移腫瘤細胞及其微環(huán)境

鐘文 胡成平

在惡性腫瘤的自然病程中，約有20%-40%的患者會出現腦轉移病灶[1]。而腦轉移病灶最常見的來源是肺癌（40%-50%），其次是乳腺癌（15%-20%）、皮膚癌（主要是黑色素瘤）占5%-10%以及消化道惡性腫瘤（4%-6%）[2,3]。近年來由于越來越多的新的治療方法尤其是精準治療的興起，腫瘤患者生存期及生活質量都得到了很大的提高，但由于中樞神經系統（central nervous system, CNS）解剖及生理上的特殊性，各種治療手段難以達到理想的效果，腦轉移病灶因而被稱為惡性腫瘤最后的“庇護所”[2]。未經治療的腦轉移的患者的中位生存期為1個月-2個月，經過治療的也僅有6個月左右[4]。目前針對腦轉移病灶主要治療手段是放療、全身性化療及手術，靶向藥物的廣泛應用也一定程度改善了腦轉移患者的預后[5]。然而，惡性腫瘤腦轉移患者總體預后仍是難以令人滿意的。

腫瘤細胞的轉移是惡性腫瘤最為重要的特征之一，轉移過程中所涉及細胞內及細胞之間分子機制是十分復雜的，不僅包括腫瘤細胞發(fā)生上皮間質轉化、循環(huán)腫瘤細胞在血管中存活、腫瘤細胞休眠、腫瘤細胞異質性及其干性等變化，還伴隨著腫瘤細胞與基質細胞的相互作用、腫瘤相關血管形成等一系列與腫瘤微環(huán)境相關事件[6]?！胺N子-土壤”假說即某種特定的腫瘤細胞只有在合適的腫瘤微環(huán)境中才能存活，很好地解釋了腫瘤特異性轉移的發(fā)生、發(fā)展[7]。CNS轉移病灶相對于其他部位的轉移病灶有其獨特性，故明確腦轉移腫瘤細胞生物學特性及其與轉移灶微環(huán)境之間相互作用對于腫瘤腦轉移的防治具有重大的意義。

1 轉移至中樞神經系統的腫瘤細胞生物學特性

在腫瘤轉移的過程中，腫瘤細胞為適應遠處轉移灶的微環(huán)境，會發(fā)生一系列的生物學特性上的變化[8]，Valastyan等[6]將此過程歸納為以下五種模式：①腫瘤細胞直接轉移形成遠處轉移灶，不發(fā)生改變；②腫瘤細胞轉移至遠處器官，部分地適應微環(huán)境，再產生某些變化以更好適應；③腫瘤原發(fā)灶包含多種隨機突變（包括具有轉移特性的突變）的亞克隆細胞，直接轉移至遠處器官并形成轉移灶；④腫瘤細胞在轉移灶已經形成的情況下，原發(fā)病灶部分腫瘤細胞可以出現某些改變并進入該轉移灶；⑤在癌變過程的早期，部分異型性細胞（quasi-normal cell）可定植在遠處器官，并產生突變，再增殖形成轉移灶。不論這一過程是發(fā)生于腫瘤發(fā)生早期、原發(fā)灶內、轉移灶內或是轉移過程中，目的都是為更好適應遠處器官的微環(huán)境。這種改變可以表現在DNA水平或表觀遺傳水平上，從而影響腫瘤細胞的表型變化[9,10]。我們將從腦轉移腫瘤基因改變、翻譯后修飾及代謝特點等方面闡釋腦轉移腫瘤細胞生物學特性。

1.1 腦轉移病灶中腫瘤細胞基因改變 Brastianos等[8]檢測了86例的腦轉移病灶及其相匹配的原發(fā)灶的病灶基因組點突變及基因拷貝數變異（copy number variations, CNV），通過計算各自的腫瘤-細胞分數（cancer cell fraction, CCF），即通過檢測點突變附近的基因拷貝數來估計細胞之間的同源性），描繪出腫瘤細胞的進化樹，結果發(fā)現，盡管腦轉移病灶與原發(fā)灶的腫瘤細胞來源于同一祖先，兩者卻分屬于不同的亞克隆。同時，他們還發(fā)現，顱內多發(fā)病灶的腫瘤細胞亞克隆之間是同源的。其他的一系列相關研究（部分重要基因改變見表1）也證實腦轉移病灶中基因組與原發(fā)灶之間存在諸如單核苷酸變異（single nucleotide variation,SNV）、CNV、缺失、擴增等的基因型方面的變化，這些基因組的改變主要涉及多條細胞信號通路的活化、細胞凋亡及細胞的粘附等功能（表1），并部分解釋了腫瘤腦轉移形成機制[11-20]。

1.2 腦轉移病灶在表觀遺傳學上的改變

1.2.1 甲基化 Park等[9]對比了黑色素瘤、肺癌、胃癌等多種細胞株在裸鼠腦轉移與皮下腫瘤模型中腫瘤細胞全基因組甲基化水平，他們發(fā)現腦轉移模型中TCF4、PURB、ONECUT2、ESRRG、NFIB及MEF2C等一系列轉錄因子的甲基化水平有明顯的差異，尤其是TCF4這一神經發(fā)育相關的轉錄因子改變最為明顯，正是由于這些改變引起腦轉移病灶的腫瘤細胞出現獨特的基因表達譜。Marzese等[21]同樣也觀察到人黑色素瘤腦轉移病灶與顱外病灶有甲基化水平不一致性，如編碼多種基因的轉錄子成分HOX家族成員中HOXD9基因啟動子區(qū)間甲基化水平明顯增高，引起神經發(fā)育相關基因的改變。而在乳腺癌腦轉移病灶中GALNT9、CCDC8及BNC1等基因的甲基化水平則明顯較原發(fā)灶增高，而體外沉默上述基因可增強腫瘤細胞的侵襲能力[18]。因此，CNS中腫瘤細胞甲基化水平的改變，可能是引起腫瘤表型發(fā)生改變原因之一，但究竟是何種因素導致腫瘤細胞的甲基化水平改變的原因尚未完全明確[9]。

1.2.2 miRNA miRNA是長度約19 bp-25 bp的小分子非編碼RNA，他們能與mRNA結合后，降解或抑制相應的mRNA，從而影響基因表達，近年來大量的研究已經證實了miRNA是轉錄后影響蛋白質表達關鍵因素之一。Zhao等[22]通過比較肺癌患者原發(fā)病灶與腦轉移病灶miRNA水平，篩選出一組下調miRNA如miR-145、miR-214、miR-9及miR-1471等，在其中，他們發(fā)現以miR-145下調水平最為明顯，而miR-145的下調能促進肺癌A549及SPC-A1細胞株增殖。既往研究[23,24]表明，miR-145可通過參與c-Myc、EGFR、NUDT1表達調節(jié)，影響肺癌細胞的增殖與侵襲。miR-145家族中另一成員miR-145-5p也在肺癌腦轉移患者中明顯下調，因此提高了下游EGFR、OCT-4、MUC-1、c-MYC、TPD52的表達水平，而miR-145-5p下調是由于啟動區(qū)間甲基化所致[25]。miR-200家族的miR-141-3p及miR-200b-3p在腦轉移病灶中也較原發(fā)灶明顯上調，進而下調ZEB2表達，影響腫瘤細胞的增殖、侵襲能力[26]。

1.3 腦轉移病灶中的腫瘤細胞獲得神經細胞特性 Park等[9]發(fā)現肺癌、黑色素瘤、結腸癌的腦轉移動物模型中的腫瘤細胞表型上呈現了某些神經元細胞的特性，即谷氨酸信號通路蛋白及神經遞質復合物蛋白如SNAP25、SNAP91及BSN等蛋白水平明顯增高。同樣的，在人乳腺癌腦轉移病灶中也發(fā)現γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）源的蛋白如GABA受體、GABA轉氨酶等表達增高，從而使得腫瘤細胞能在CNS中利用GABA進行各種代謝活動[27]。而Nygaard等[28]則發(fā)現，在黑色素瘤腦轉移患者及動物模型中，谷氨酸相關信號通路信號蛋白GRIA2、GRM4及BSN表達增高，促進了腫瘤細胞的生長。此外，還有研究[29]表明CNS中的纖溶酶可誘導腫瘤細胞凋亡，而乳腺癌及肺癌細胞株可高表達neuroserpin這一種神經元特征表達的纖溶酶原激活物抑制劑，從而逃避纖溶酶促凋亡的作用。這種轉變可能基于高氯的腦組織間液對非神經元細胞具有損傷作用[30]，再加上中樞神經充足的神經營養(yǎng)因子、谷氨酸等物質[31-33]，腫瘤細胞獲得某些神經元特性可能更適合于中樞系統微環(huán)境的生存。

1.4 腦轉移病灶中的腫瘤細胞代謝特點 CNS血供豐富，血流量占全身總量的1/5，因此，其供養(yǎng)、供能也較為充足。由于血腦屏障（Blood Brain Barrier, BBB）的存在，CNS間質葡萄糖較血液濃度低，但亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸等支鏈氨基酸及谷氨酸含量豐富[32,33]。

表1 腦轉移病灶中腫瘤細胞基因改變Tab 1 Gene profile changes in brain metastases

相對于腫瘤腦轉移侵襲、增殖特性，人們對CNS中腫瘤細胞的代謝特點的所知甚少。Chen等[34]對比了腦轉移模型與骨轉移模型中的腫瘤細胞能量代謝相關蛋白表達的水平，他們發(fā)現，不同于常見的腫瘤細胞較多的依賴無氧代謝，CNS中的腫瘤細胞三羧酸循環(huán)-氧化磷酸化活躍，并伴有腫瘤細胞磷酸戊糖途徑的活化，并可借此機制介導了腫瘤細胞對某些抗代謝化療藥物如D-2-脫氧葡萄糖的耐藥。Chen等[35]則發(fā)現具有CNS轉移特性的乳腺癌細胞對低糖耐受能力較其母代細胞更強，并表達了更多的谷氨酸脫氫酶、酮酸脫氫酶以利用環(huán)境中的谷氨酸及支鏈氨基酸。

脂質代謝方面，Chen等[34]發(fā)現腦轉移模型中動物模型中的脂肪酸β氧化相關酶譜較骨轉移表達升高，而人的乳腺癌腦轉移組織芯片顯示，乙酰輔酶A氧化酶-1及脂肪酸合成酶表達水平較其他部位轉移灶高，提示腦轉移病灶中脂質合成及分解代謝均較活躍[36]。

由于研究范圍較大，輻射距離較長，整段天際線所包含的構成要素數量及形式過多。因此以道路分隔及既有街區(qū)為基礎，將整段天際線較為均勻地劃分為7段樣本，每段長度約500～700m。一方面控制樣本尺度以便于受訪人在之后的調查問卷中進行評價判斷，另一方面增加樣本數量為后續(xù)天際線評價定量化、規(guī)律化的探討提供了基礎。

2 腫瘤中樞神經系統微環(huán)境

腦轉移病灶微環(huán)境相對于其他組織有著其獨特性：①具有BBB、血腦脊液屏障，起到生物屏障作用；②缺乏淋巴細胞、巨噬細胞等免疫細胞，小膠質細胞充當了重要的免疫反應角色[37]；③缺乏成纖維細胞等間葉組織，而富含星形膠質細胞及少突膠質細胞；④高表達CXCL-12[38]、neuroserpin[29]、neutropin[31]等CNS特異性的分子。至于顱內微環(huán)境對于腫瘤腦轉移病灶扮演何種角色目前仍存在爭論[39]，既往研究[40-42]表明，從腦轉移模型中分離的腫瘤細胞或與體外CNS微環(huán)境共培養(yǎng)獲得的腫瘤細胞均較原細胞株有更強增殖、侵襲及轉移能力，但另有研究[29]則顯示星形膠質細胞可分泌纖溶酶原激活物促使腫瘤細胞的凋亡，不利于腫瘤細胞的生長。下面，我們將從構成CNS微環(huán)境各成分及其與腫瘤細胞相互作用來探討顱內微環(huán)境對腫瘤細胞的作用。

2.1 星形膠質細胞 星形膠質細胞（astrocyte, AST）是CNS中除神經元外最為豐富的細胞。AST在受到刺激情況便可激活，形態(tài)上變得肥大，并伴隨著AST活化特異性標志膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）表達增高。AST具有支持神經細胞、營養(yǎng)神經組織、維持CNS穩(wěn)態(tài)、構成血腦屏障等功能，并能在神經系統受到損傷后起到修復作用。作為CNS微環(huán)境最為重要的組分，AST在腫瘤腦轉移病灶形成中起到重要的作用[43]。

AST活化后可分泌多種細胞因子影響腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移能力。有研究發(fā)現AST可通過分泌基質金屬蛋白酶2（matrix metalloprotein 2, MMP2）及MMP9，清除腫瘤細胞表面及周圍基質成分，促進腫瘤細胞的侵襲及轉移能力[44]，MMP是調節(jié)腫瘤微環(huán)境最為重要的蛋白酶之一，除了發(fā)揮蛋白酶的降解基質、促進侵襲功能之外，MMP2及MMP9可通過激活轉化生長因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）調控細胞生長，通過VEGF調節(jié)血管生成等功能[45]，相關的臨床資料[46]也表明MMP2表達陽性的腦原位或轉移腫瘤的患者的生存期更短。在黑色素瘤腦轉移的研究中發(fā)現，AST可在黑色素瘤細胞刺激下產生白介素3（interleukin-3, IL-3）、CD40L、CXCL12及IFN-γ等多種細胞因子，其中IL-23則刺激腫瘤細胞產生MMP-2，從而促進腫瘤細胞增殖[41]。腫瘤細胞與AST通過細胞因子網絡相互作用機制是非常復雜的，有研究表明，CNS中的腫瘤細胞可分泌巨噬細胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）、IL-8及纖溶酶原激活物抑制因子1（plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1）激活AST，激活的AST又可分泌IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）及IL-1β促進腫瘤細胞的增長，但IL-6R表達卻有所下調[47]，這與Sierra的結果[48]有部分差異。然而，AST除促進腫瘤細胞生長之外，也有研究證實AST對部分的腫瘤細胞的生長可起到抑制作用，主要機制在于CNS中的纖溶酶使得AST細胞膜上的FasL脫落形成分泌型的FasL引發(fā)腫瘤細胞凋亡[29]。

最新的一項研究[49]表明，AST產生外泌體與腫瘤細胞融合后，外泌體內含的的miRNA（主要是miR-19a）可使得腫瘤細胞發(fā)生PTEN低表達丟失，進一步活化PI3K/AKT/mTOR通路，促使腫瘤細胞分泌趨化因子2（chemokine ligand 2, CCL2），募集IBA-1表達的髓性細胞，從而促使腫瘤增殖，這一過程特異地發(fā)生在CNS中，腫瘤細胞與腫瘤相關成纖維細胞（cancer associated fibroblast, CAF）共培養(yǎng)并未出現此現象。這項發(fā)現意義在于可以很好地解釋腦轉移細胞往往都會出現特異性的PTEN的低表達，從而引起PI3K/AKT/mTOR信號通路過度活化這一現象[8,16,49,50]。外泌體是細胞外直徑約40 nm-100 nm的小囊泡，可由腫瘤細胞、神經細胞、淋巴細胞及腫瘤細胞等細胞產生，廣泛存在于多種組織間液中，其囊泡內含有蛋白質、miRNA、mRNA、脂質等多種細胞成分，作為細胞外的膜性結構可參與細胞之間信號傳遞，在腫瘤血管形成、轉移等過程中起到了重要作用[51,52]。外泌體及其內涵物可以作為腫瘤細胞與其微環(huán)境相互作用的途徑，進而影響腫瘤細胞的生長，這一發(fā)現為腦轉移病灶提供一個新穎的治療靶點，引發(fā)了眾多關注，外泌體及微囊泡也成為近期腫瘤領域研究熱點之一[53,54]。

AST還具有保護腫瘤細胞免受化療藥物細胞毒作用的功能。這種保護機制可能是基于AST與腫瘤細胞的直接接觸及間隙連接通信（gap joint communication, GJC）起作用的，但成纖維細胞卻不能起到類似的作用[55,56]。AST與黑色素細胞瘤細胞接觸后，細胞間的接合素43（connexin 43）的GJC作用可使黑色素瘤細胞免于化療藥物誘導的細胞凋亡[55]。此外，AST與腫瘤細胞的直接接觸可促使腫瘤細胞分泌IL-6及IL-8，使得AST產生內皮素1（endothelin 1, ET1），ET1與腫瘤細胞的內皮素受體（endothelin receptor, ETR）結合之后可激活AKT及MAPK通路影響下游BCL2L1、TWIST1及GSTA5表達使得細胞免受化療藥物的影響[56-58]。類似的，Murphy等[59]則在發(fā)現connexin 43可通過活化AKT/AMPK/mTOR信號通路誘導惡性膠質瘤對替莫唑胺耐藥。但也有研究[60]表明，睪丸癌細胞之間卻能通過connexin 43之間的信號通路增強化療藥物的細胞毒作用，推測GJC可以傳遞某些小分子物質誘導腫瘤細胞凋亡。由此可見，腫瘤細胞與微環(huán)境、腫瘤細胞與腫瘤細胞之間特定的GJC信號分子可以影響腫瘤細胞在CNS等微環(huán)境下對化療敏感程度，阻斷或活化GJC之間的信號傳導，對于增強化療藥物效果可能有一定的臨床意義。

AST作為微環(huán)境的一個關鍵因素，可與腫瘤細胞相互作用后通過分泌細胞因子網絡、直接接觸及外泌體等多種途徑影響腦轉移的腫瘤細胞生物學行為，兩者之間作用網絡復雜，部分機制尚未完全明確，需得到進一步的闡釋[53,59]。

2.2 小膠質細胞/巨噬細胞 正常的CNS缺乏淋巴細胞、巨噬細胞等常見的免疫細胞及相應的淋巴管道，小膠質細胞在CNS免疫反應中扮演了重要的角色。小膠質細胞屬于單核-巨噬細胞系統，激活后甚至難以從形態(tài)學及分子標志上來和循環(huán)中的巨噬細胞相區(qū)分，而異種共生的動物實驗表明，轉移瘤模型中的小膠質細胞/巨噬細胞多來源于循環(huán)中的單核巨噬細胞，顱內原有的小膠質細胞僅占少數[61]。因此，有部分文獻將CNS中激活的小膠質細胞直接稱之為小膠質細胞/巨噬細胞[62,63]。

免疫系統在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中有著重要的地位。腫瘤中的巨噬細胞主要可分成兩型，即M1及M2型，其中M2型單核巨噬細胞表面抗原為CD163及CD204，通過分泌Arginase、IL-10、脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）、干擾素γ（interferon-γ, IFN-γ）及轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）等細胞因子促進腫瘤生長，而M1型則高表達誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS），并分泌IL-1、IL-12、NO、TNF-α，具有殺傷腫瘤細胞作用[63,64]。Wei等[63]回顧了小膠質細胞/巨噬細胞在膠質瘤中的作用，小膠質細胞/巨噬細胞在其中的作用傾向于M2表型，并可與膠質瘤細胞相互作用，促進膠質瘤細胞侵襲及血管生成，但其抑瘤作用僅表現在協同CD8+T細胞、ADCC及少量的M1表型的細胞毒作用這幾個方面。小膠質細胞/巨噬細胞作為CNS中免疫功能最為重要的一環(huán)，明確腦轉移腫瘤中小膠質細胞/巨噬細胞分化類型及其產生機制對明確CNS中免疫系統與腫瘤細胞之間關系有著重要的意義。

體外研究表明，LPS可激活小膠質細胞，促使其向M1型分化，并分泌NO及TNF-α等細胞因子殺傷腫瘤細胞[61,65]，然而，低濃度的小膠質細胞培養(yǎng)上清液卻具有促腫瘤生長作用[65]，實際上，在肺癌腦轉移的病理組織中，盡管腫瘤及周圍高表達iNOS，但TNF-α表達量卻較低，圍繞腫瘤組織的主要是一層厚的IBA-1陽性小膠質細胞/巨噬細胞，這表明在腦轉移病灶的不同部位，小膠質細胞有著不同的分化及功能[65]，這一功能的差異取決于小膠質細胞/巨噬細胞本身受到微環(huán)境的刺激[63]。除了典型的M1及M2分化之外，有研究發(fā)現乳腺癌細胞刺激下的小膠質細胞可通過非經典的Wnt通路活化通路，促進乳腺癌細胞侵襲及生長[66]。證據還來自于Rietk?tter等[67]的實驗，他們發(fā)現不同于外周血中的單核/巨噬細胞，小膠質細胞促進腫瘤生長、侵襲作用并不依賴CSF-1的激活作用。

小膠質細胞/巨噬細胞在腦轉移病灶中表型變化及相關機制仍有較多空白，以小膠質細胞/巨噬細胞為靶點在治療腫瘤中遠沒有當下熱門的免疫治療取得的成果明顯。雖有體外實驗表明用唑來膦酸可促使CNS中小膠質細胞/巨噬細胞發(fā)生表型變化發(fā)揮抑制腫瘤侵襲作用[68]，同時也有臨床資料證明唑來膦酸可以減少乳腺癌患者復發(fā)風險[69]，但對于腫瘤腦轉移患者目前尚缺乏相關足夠的臨床證據，需要通過進一步的臨床試驗證實拮抗小膠質細胞/巨噬細胞治療腫瘤腦轉移的效果。

2.3 腦轉移瘤微血管 腫瘤生長離不開充足的血供，微血管在腫瘤細胞轉移機制及生長方面起到重要的作用。腦轉移動物模型病理結果顯示腫瘤細胞多分布在微血管的周圍75 μm左右，距離微血管100 μm的腫瘤細胞多無法生存，Kienast等[70]通過熒光示蹤法追溯腦轉移模型中所有腫瘤細胞的命運，結果發(fā)現與血管分離的腫瘤細胞無一例外都走向死亡，Fidler等[43,71]還發(fā)現腦轉移腫瘤微血管具有平均血管密度（mean vessel density, MVD）低，但管腔多異常擴張不完整的特點。

VEGF是血管形成的關鍵因子，早前的實驗[72]已經證明了在腦轉移病灶形成過程中，VEGF是必要而非充分的因素。且有研究[73]表明腦轉移病灶VEGF水平較原發(fā)灶高，且與微血管密度（microvessel density, MVD）成正相關。除促血管生成之外，VEGF還可以激活腦轉移過程中一部分休眠的細胞，促使其增殖形成微轉移灶[70]。回顧性分析[74,75]表明使用貝伐珠單抗可以有效地降低肺癌患者腦轉移病灶的形成，且并不增高CNS出血風險。然而需要引起注意的是血管形成還受其他因子調控，肺癌腦轉移動物實驗表明，盡管通過抑制VEGFR可以拮抗VEGF塑造血管的能力，但由于堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）的高表達，腫瘤負荷并沒有減輕[71]。

2.4 BBB BBB是腫瘤細胞形成腦轉移病灶首先接觸的一個結構，由毛細血管內皮細胞及之間的緊密連接、基膜、AST的樹突構成。生理情況下，BBB具有維持CNS穩(wěn)態(tài)的功能，對藥物、毒素、離子等物質具有隔離作用。BBB完整性的維持關鍵是BBB的緊密連接，其緊密連接由跨膜蛋白及周圍蛋白構成，跨膜蛋白由封閉蛋白（occludin）、聯接黏附分子（junctional adhesion molecules, JAMs）及緊密連接蛋白claudin（BBB上主要為claudin-5）組成，構成細胞之間的相互連接；周圍蛋白則分布在緊密連接的兩側，包括閉鎖小帶（zonula occluden, ZO）及絲狀肌動蛋白結合蛋白（afadin）等蛋白，可維持BBB穩(wěn)定性[76]。動物實驗[71,77]表明，多種腫瘤細胞株均能順利通過BBB，且發(fā)現直徑大于0.25 mm的腫瘤腦轉移病灶內部的BBB的完整性受到了不同程度的破壞。腫瘤細胞穿過BBB之間是形成腦轉移病灶的第一步，但目前具體機制尚未完全明確。既往Bos等[78]通過比較腦轉移病灶與原細胞基因表達差異篩選發(fā)現環(huán)氧合酶（cyclooxygenase-2, COX2）、α2,6-唾液酸轉移酶（α2,6-sialyltransferase, ST6GALNAC5）及EGF可介導乳腺癌細胞穿過BBB，并推測ST6GALNAC5可以通過促使內皮細胞表面唾液酸化而特異性地介導了腦轉移，在結腸癌的患者中，ST6GALNAC5的rs1736858的SNP與腦轉移風險高度相關[79]。而腫瘤細胞產生的COX2則可以誘導產生前列腺素，從而促進腫瘤細胞高表達MMP1，降解BBB上的Claudin及ZO-1[80]。但Lee等[81]則認為COX2主要來源并非腫瘤細胞，而為BBB的內皮細胞。神經肽物質P（neuropeptide substance, SP）也可通過改變ZO-1及claudin-5的分布及位置促使腫瘤細胞穿過BBB。體外研究則表明，小細胞肺癌細胞可分泌胎盤生長因子（placental growth factor, PLGF）與VEGFR-1受體結合后，活化ROCKERK1/2通路，促使occludin磷酸化而改變BBB的緊密連接，最終易化小細胞肺癌細胞穿過BBB[82]。

細胞分泌的囊泡內容物也可介導腫瘤細胞破壞BBB。有研究[83]表明，乳腺癌細胞能夠直接通過外泌體中的miRNA-105下調緊密連接中的ZO-1破壞BBB的完整性，促使腫瘤細胞向顱內轉移，但也有研究則表明BBB的破壞并不僅僅在于緊密連接中的ZO-1蛋白，Tominaga等發(fā)現，乳腺癌細胞能分泌的小囊泡（extracellular vesicles, EV），大小約100 nm，包括外泌體及其他的囊泡）中可特定的被BBB內皮細胞攝取，EV中的miRNA181c可抑制BBB內皮細胞上的磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1, PDPK1）的表達，而PDPK1下調可使肌動蛋白素（cofilin）磷酸化水平下降并激活cofilin，從而引起肌動蛋白（actin）構象改變，破壞了BBB的緊密連接，促使乳腺癌細胞穿過BBB[84]?？紤]到腫瘤細胞穿過BBB機制的多樣性及其脆弱性，BBB或許并不能作為一個好的抵抗腫瘤入侵CNS及治療的靶點。此外，既往腫瘤細胞穿透BBB的機制研究主要集中在乳腺癌中，而關于肺癌的研究相對較少，各種腫瘤細胞是否存在不同的機制值得進一步探討。

而BBB另一成分血管內皮細胞在與CNS轉移的腫瘤細胞相互作用主要表現在腫瘤轉移過程中的細胞間粘附，在NSCLC細胞腦轉移的早期，腫瘤細胞能與內皮細胞通過VLA-4/VCAM-1、ALCAM/ALCAM及LFA-1/ICAM-1粘附，而這些早期粘附分子可作為預防腦轉移形成的靶點[85]。而另有研究[86]則表明腦轉移腫瘤NSCLC細胞高表達CD15，并與TNF-α激活的內皮細胞CD62E相互作用，介導腫瘤細胞粘附微血管。此外，腫瘤細胞與內皮細胞相互作用還可促進腫瘤侵襲及腫瘤血管生成，即腫瘤細胞JAK-STAT通路激活后可分泌VEGF，與VEGFR2結合后激活血管內皮的JAK-STAT通路，MMP-9分泌增多，增強腫瘤細胞的侵襲能力[87]。

BBB更重要的一點在于它是影響藥物治療腦轉移病灶主要的因素。BBB上的內皮細胞豐富表達p-糖蛋白（p-glycoprotein, p-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein, BCRP）等ATP結合轉運蛋白[ATP-binding cassette (ABC) efflux transporters, ABCG]，ABCG是一類依賴ATP的分子轉運體，能將其底物逆濃度梯度轉運。目前常用的化療或靶向藥物大多是ABCG家族中某一個或幾個的蛋白作用底物，造成CNS病灶藥物常常難以達到有效的治療濃度[2]。以靶向藥物厄洛替尼為例，在p-gp及BCRP敲除的小鼠中腦組織AUC可達（49.6±3.95）μg/g?h，而野生型的小鼠腦組織AUC僅僅為（11.0±1.35）μg/g?h，遠低于血漿的（80.2±3.5）μg/g?h[88]。為突破BBB的限制，可采用聯合放療、增大藥物劑量及使用ABCG抑制劑等方式，提高藥物在CNS中的分布情況以達到良好的治療效果[2]。

2.5 腦轉移轉移瘤微環(huán)境的其他細胞成分 其他細胞成分如少突膠質細胞、循環(huán)的免疫細胞及CNS間質成分與腫瘤細胞相互作用研究較少。有研究[89,90]表明，將NK細胞種植到乳腺癌或膠質瘤動物模型中，可抑制膠質瘤細胞及HER陽性的乳腺癌細胞生長，但在動物乳腺癌腦轉移模型中卻發(fā)現CD11b陽性的髓樣細胞聚集并形成早期腫瘤轉移的“土壤”，進一步釋放炎癥因子S100A8 及S100A9，誘導腫瘤細胞趨化[91]。甚至在人腫瘤CNS中可見腫瘤相關成纖維細胞（cancer associated fibroblast, CAF），進一步的研究[92]表明CAF可促進腫瘤細胞侵襲。

腦轉移腫瘤細胞生物學特性的變化及腫瘤細胞與其微環(huán)境相互作用可能可以解釋腫瘤細胞這顆“種子”如何在顱內“土壤”中定植、生長這一相對低效的轉移過程[93]，然而，顱腦微環(huán)境在腦轉移病灶中的腫瘤細胞生物學行為改變中扮演了“篩選”還是“誘導”的角色尚不明確。有研究將肺癌、黑色素瘤與星形膠質細胞共培養(yǎng)后檢測全基因組甲基化水平，同樣部分復制出腦轉移動物模型中甲基化情況的改變，提示星形膠質細胞可以使腫瘤細胞發(fā)生甲基化水平變化[9]。而McDermott R則提出這樣一種模式，星形膠質細胞、小膠質細胞等CNS微環(huán)境組分與腫瘤細胞相互作用下可產生某些細胞因子，從而改變腫瘤細胞的miRNA水平，進而影響相應靶基因的表達[94]。

總之，惡性腫瘤腦轉移問題一直是腫瘤醫(yī)生關注的熱點問題?！胺N子-土壤”模型的提出為解決腦轉移病灶生長提供了一個大的框架。腫瘤細胞與星形膠質細胞、小膠質細胞、微血管、血腦屏障等結構相互作用及腫瘤細胞在中樞神經系統產生的適應性變化，有助于我們發(fā)現新的治療靶點。