不同抗稻曲病水稻品種的RGA分析

唐善軍，高杜娟，陳友德，李友榮，薛 丹，陳新華

不同抗稻曲病水稻品種的RGA分析

唐善軍1，高杜娟1，陳友德1，李友榮1，薛 丹1，陳新華2

（1.湖南省水稻研究所，湖南 長沙 410125；2.安仁縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，湖南 安仁 423600）

利用抗病基因同源序列的原理對34份水稻品系進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明：引物XLRR for/XLRR rev和Pto-kin1/Pto-kin2擴(kuò)增的RGA序列具有豐富的多態(tài)性。供試材料的抗性鑒定表明，34份參試材料對稻曲病的抗性表現(xiàn)出明顯差異，病穗率范圍為0%～35.4%，抗性從抗到高感。聚類分析結(jié)果表明，在遺傳相似系數(shù)為0.73時(shí)，34個(gè)水稻品種可分為5類，但與水稻材料的抗感水平?jīng)]有明顯的對應(yīng)關(guān)系。

抗病基因同源序列；稻曲??；抗性；遺傳多樣性

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.07.001

稻曲病是由綠核菌屬稻綠核菌［Ustilaginoidea virens（Cooke.）Takah］引起的真菌病害，為害水稻穗部，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量和品質(zhì)，而且隨著大穗型雜交水稻的大面積推廣，稻曲病的發(fā)生正日趨嚴(yán)重。因此，發(fā)掘抗稻曲病種質(zhì)、選育抗病品種是當(dāng)前水稻安全生產(chǎn)亟待解決的問題。由于稻曲病菌生活史復(fù)雜以及人工接種方法的可重復(fù)性差，因此目前為止，該病的侵染循環(huán)、發(fā)病規(guī)律及其與寄主的互作方面都不完全清楚，這也導(dǎo)致現(xiàn)有的有關(guān)稻曲病的抗性評價(jià)方法受環(huán)境條件的影響較大。

以抗病基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用PCR技術(shù)，擴(kuò)增抗性基因同源序列（Resistance gene analogue，RGA），是一條快速鑒定候選抗病基因和評價(jià)抗病種質(zhì)資源的途徑。稻種資源的白葉枯病抗性可以通過RGA分析將抗病品種和感病品種明顯區(qū)分開來，姬廣海等［1］研究用2對RGA引物區(qū)分了云南抗白葉枯病稻種，Zhao等［2］發(fā)現(xiàn)RGA片段與野生稻抗白葉枯病基因連鎖，Chen等［3］利用RGA標(biāo)記發(fā)現(xiàn)多個(gè)與抗白葉枯病連鎖的候選基因。但研究發(fā)現(xiàn)，RGA標(biāo)記對區(qū)分稻種資源的稻瘟病抗性并不明確。例如：孫雁等［4］和陳于敏等［5］發(fā)現(xiàn)按RGA標(biāo)記劃分的類群與抗瘟性基本一致；但任鄄勝等［6］和劉二明等［7］用抗瘟性和RGA標(biāo)記進(jìn)行聚類，發(fā)現(xiàn)類與類之間沒有明顯的抗性對應(yīng)關(guān)系。這可能與標(biāo)記選擇和所選稻種群體有關(guān)。研究利用抗性基因同源序列分析研究不同抗性品種中抗稻曲病相關(guān)的基因片段及其多態(tài)性，探索抗性基因同源序列和抗性表型之間的相關(guān)性，以期為稻種資源的稻曲病抗性鑒定提供分子水平依據(jù)，以期為稻曲病抗性鑒定和抗病育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 水稻材料及稻曲病抗性鑒定

參試的34個(gè)水稻品系是經(jīng)過多年鑒定抗性穩(wěn)定的材料，均為秈稻類型。試驗(yàn)安排在農(nóng)業(yè)部安仁有害生物防治重點(diǎn)野外科學(xué)觀測試驗(yàn)站（湖南省水稻研究所安仁基地）進(jìn)行。試驗(yàn)所用稻曲病圃于2009年建立，常年發(fā)病較重，積累了大量菌源。病圃內(nèi)比普通水稻生產(chǎn)偏施氮肥，其他肥水管理同大田生產(chǎn)，全生育期內(nèi)不施殺菌劑，具體病圃管理和栽培方式參見李友榮等［8］的方法。根據(jù)供試材料的抽穗期，安排兩次噴霧分生孢子和菌絲混合液，供試的稻曲病菌菌株為當(dāng)?shù)胤蛛x的優(yōu)勢菌。

1.2 抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

參考農(nóng)業(yè)部行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科技專項(xiàng)“稻曲病控制技術(shù)的研究”項(xiàng)目組按病穗率進(jìn)行品種抗性評價(jià)的方法［9］，制定了稻曲病抗性分級標(biāo)準(zhǔn)，見表1。

表1　水稻稻曲病抗性分級標(biāo)準(zhǔn)

1.3 DNA提取

取20粒飽滿的水稻種子置于墊有濾紙的發(fā)芽盒中，發(fā)芽盒的長、寬、高分別是12 cm×12 cm×5 cm，在盒內(nèi)加入適量的蒸餾水，蓋上發(fā)芽盒蓋，置于28 ℃的人工氣候箱催芽，在第7天取種子的根和芽提取DNA，濃度大于100 ng/μL。水稻基因組提取方法按Zheng等［10］方法稍作修改進(jìn)行。

1.4 供試引物

共選擇5對引物從水稻總DNA中擴(kuò)增抗病基因同源序列，序列信息見表2。

表2　抗病基因同源序列引物

1.5 PCR擴(kuò)增、電泳和銀染

水稻基因組DNA，反應(yīng)體系中模板濃度10 μg/ mL。PCR反應(yīng)體系：2×PCR Master（含染料）12.5 μL，模板0.5 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，無菌水補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增效果，采用2‰～3‰硝酸銀染色。

1.6 聚類分析

以“1”和“0”分別表示抗病基因同源序列擴(kuò)增片段的有和無，使用NTSYS軟件中的非加權(quán)成對分組平均法程序進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建RGA差異相似性樹型圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試水稻的稻曲病抗性表型

前期對水稻稻曲病不同病情指標(biāo)間關(guān)系研究表明，對大量水稻品種或資源進(jìn)行抗性評價(jià)時(shí)，以病穗率作為調(diào)查指標(biāo)，可真實(shí)準(zhǔn)確反映其抗性水平［11］。

通過連續(xù)兩年自然誘發(fā)輔助人工接種，以發(fā)病更重結(jié)果確定抗性和病級，如表3所示：不同水稻品系對稻曲病表現(xiàn)不同抗性，病穗率范圍為0%～35.4%，無免疫高抗品系，按病穗率分級標(biāo)準(zhǔn)可分為5類：抗病品系為C6、C10、C11、C12、C17和C18等6個(gè)；中抗的有C1、C13和C28；中感的有C2、C4、C7、C8、C21、C22、C27和C30等8個(gè)；感病的有C3、C5、C9、C14、C23、C26、C29、C31、C32和 C34 等10個(gè)；高感的有C15、C16、C19、C20、C24、C25和C33等7個(gè)。

表3　34個(gè)水稻品系的稻曲病抗性鑒定結(jié)果

2.2 不同抗稻曲病水平的水稻品系的遺傳多態(tài)性

所用5對抗病基因同源序列引物擴(kuò)增出多條譜帶，其中XLRR-for/XLRR-rev和Pto-kin1/Pto-kin2的多態(tài)性譜帶較豐富。根據(jù)擴(kuò)增譜帶越多，抗病基因同源序列越豐富，抗病可能性越高的原則，將這兩對引物的結(jié)果置于一起進(jìn)行聚類分析。

通過軟件聚類分析，獲得遺傳相似樹狀圖（圖1）。從圖1的聚類結(jié)果可以看出，當(dāng)以遺傳相似系數(shù)0.47來劃分時(shí)，可以將這34個(gè)水稻品系劃分為2個(gè)RGA類群。相似系數(shù)0.6時(shí)，可劃分為3個(gè)類群，C4單獨(dú)成為一群。相似系數(shù)0.73時(shí)，可劃分為5個(gè)類群。

2.3 水稻抗稻曲病表型與抗性基因同源序列相似性關(guān)系

圖1　供試品系 RGA指紋聚類圖

參試的34個(gè)水稻材料按病穗率分類與RGA聚類，類與類之間沒有對應(yīng)關(guān)系。但按RGA分為兩個(gè)類群時(shí)，抗稻曲病表型為抗病和中抗品系C1、C6、C10、C11、C12、C13、C17和C18可以聚為一類。按RGA分為5個(gè)類群時(shí)，高感的C16、C19、C20、C24、C25和C33可以聚為一類。研究所用的材料均為秈稻品種，在遺傳上相似性較高，另一方面所選5 對RGA引物僅有2對多態(tài)性較高，但仍然可以在一定程度上將同樣抗感表現(xiàn)的水稻聚類，說明利用抗病基因同源序列對水稻稻曲病抗性鑒定是可行的。

3 討 論

目前，國內(nèi)外對稻曲病抗病性遺傳的研究相對較少，徐建龍等［12］利用近等基因系檢測到2個(gè)與抗病性相關(guān)的QTL，李余生等［13］利用重組自交系群體檢測到多個(gè)與抗病基因相關(guān)的QTL。造成抗病遺傳方面研究較少的原因是多方面的，一是稻曲病的侵染循環(huán)不清楚，其初侵染源、侵染部位和侵染時(shí)期都存在爭議；二是無高效穩(wěn)定的接種稻曲病體系，目前普遍采用的病原菌菌絲-孢子混合液注射接種，雖然可以高度誘發(fā)病害，但溫濕度等環(huán)境因子以及品種生育期的影響都會導(dǎo)致發(fā)病不穩(wěn)定，無法準(zhǔn)確判斷品種抗性，而且注射接種由于病原菌毒性等問題會導(dǎo)致稻穗畸形和抽穗困難［14］；三是由于稻曲病分級標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，致使無公認(rèn)的抗病品種。因此，合理而準(zhǔn)確的抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是篩選抗病種質(zhì)資源的重要基礎(chǔ)，也是尋找和發(fā)現(xiàn)抗病基因、進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新和抗病育種的先決條件。

研究中所用的水稻品系是經(jīng)過多年病圃篩選和人工接種得到的抗性比較穩(wěn)定的材料，期望通過抗病基因同源序列克隆的方法找到與稻曲病抗性基因相關(guān)的片段，為快速評價(jià)水稻品種稻曲病抗性提供分子水平的支撐，解決目前無穩(wěn)定接種體系的難題。從研究結(jié)果來看，所選的5對引物都不能有效的將抗感品種區(qū)分開來，其中引物S1/AS3、S1-inv/AS3-inv和LM637/ LM638根據(jù)抗病基因NBS-LRR（核苷酸結(jié)合位點(diǎn)和富亮氨酸重復(fù)的胞內(nèi)受體蛋白）保守區(qū)域設(shè)計(jì)，主要參與抗性表達(dá)，這是植物抗病基因中數(shù)量最多的一類，其“進(jìn)化”程度很高，抗病性是目前被發(fā)現(xiàn)的唯一功能。XLRR-for/XLRR-rev根據(jù)LRR保守序列設(shè)計(jì)，主要參與蛋白質(zhì)間的互作，Pto-kin1/Pto-kin2根據(jù)Pto基因編碼蛋白激酶序列設(shè)計(jì)。研究發(fā)現(xiàn)根據(jù)以上這些不同類型的抗病基因同源序列都不能將水稻品種按不同稻曲病抗性區(qū)分開來，這與盧代華等［15］利用SSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳分析發(fā)現(xiàn)所用標(biāo)記不能對品種稻曲病抗性進(jìn)行有效劃分的結(jié)果類似，說明水稻抗稻曲病抗性基因可能是一類與已克隆抗性基因結(jié)構(gòu)和功能不同的基因。

抗病品種是防治稻曲病最經(jīng)濟(jì)安全有效的方式，發(fā)掘并利用抗病基因是其首要任務(wù)，下一步可嘗試采用其他多種分子標(biāo)記，以篩選出對稻曲病抗性鑒定和抗病育種更加適合的分子標(biāo)記。

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（責(zé)任編輯：肖 亮）

RGA Analysis of Rice Lines with Different Resistance to Ustilaginoidea virens

TANG Shan-jun1，GAO Du-juan1，CHEN You-de1，LI You-rong1，XUE Dan1，CHEN Xin-hua2
（1. Hunan Rice Research Institute， Changsha 410125， PRC； 2. Anren Agricultural Science Institute， Anren 424600， PRC）

Thirty-four rice lines’ genetic diversity was analyzed by using resistance gene analogue （RGA） principle. The results showed that abundant RGA polymorphism was observed by using primers XLRR for/XLRR rev and Pto-kin1/Pto-kin2. And there was significant different in the resistance to rice false smut among tested lines with the diseased panicle rate range of 0-35.4% and the resistance to rice false smut in the range of resistance to highly susceptibility. The clustering analysis result showed that thirty-four rice lines could be divided into 5 groups at the genetic similar coefficient 0.73， however their resistant levels couldn’t be distinguished from RGA analysis. Key words： RGA； rice false smut； resistance； genetic diversity

S511

A

1006-060X（2016）07-0001-03

2016-05-05

湖南省農(nóng)業(yè)支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015NK3046）；湖南省水稻品種區(qū)試項(xiàng)目（2010-2015）

唐善軍（1986-），男，湖南東安縣人，助理研究員，主要從事水稻病害和育種研究。