蘭州百合植物內(nèi)生及根際土放線菌最適分離培養(yǎng)基的篩選研究

李增政，常永芳，林　滕，周　琴，李　濤

(西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730124)

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蘭州百合植物內(nèi)生及根際土放線菌最適分離培養(yǎng)基的篩選研究

李增政，常永芳，林滕，周琴，李濤

(西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730124)

以蘭州百合的鱗莖、根及根際土為實驗材料，對其植物內(nèi)生和根際土放線菌在不同的培養(yǎng)基上進行分離培養(yǎng).根據(jù)不同培養(yǎng)基中所得放線菌菌落數(shù)量與種類，應用統(tǒng)計學方法，來選擇出最適植物內(nèi)生以及根際土放線菌生長的最適培養(yǎng)基.方法：對蘭州百合鱗莖及根部表面消毒處理后，采用組織懸液法將原液涂布于添加抑菌劑的腐殖酸培養(yǎng)基、寡營養(yǎng)培養(yǎng)基、改良的高氏Ⅰ號等10種不同的培養(yǎng)基上.對根際土壤采用120 ℃預處理1 h，然后將處理后的根際土樣作10-1、10-2、10-3梯度稀釋并分別涂布于添加抑菌劑的SCA培養(yǎng)基、HVA培養(yǎng)基、葡萄糖—天冬氨酸瓊脂培養(yǎng)基等7種不同的培養(yǎng)基上.置于23 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計每個培養(yǎng)基上放線菌菌落數(shù)量及種類.結(jié)果：不同培養(yǎng)基分離蘭州百合植物內(nèi)生及根際土放線菌，其數(shù)量和種類有很大差異.其中，最適于百合鱗莖、根部內(nèi)生及根際土放線菌生長的培養(yǎng)基分別為IMA-2瓊脂培養(yǎng)基(共109株)、腐殖酸培養(yǎng)基(共662株)和改良高氏Ⅰ號培養(yǎng)基(共112株).

蘭州百合；植物內(nèi)生；根際土；放線菌；培養(yǎng)基

0　引言

蘭州百合(Lilium davidii)為百合科百合屬中能形成鱗莖的栽培種群，在我國主要采收其鱗莖作為食用或藥用.我國是野生百合資源分布最廣的國家，分布二十幾個省份以及自治區(qū),也是百合種植開發(fā)利用最早的國家.蘭州百合品質(zhì)出眾，其所含蛋白質(zhì)含量較高，是其他根莖蔬菜的2～5倍，并含有人體所需要的八種氨基酸.還含有多種維生素，其中維生素(核黃素)含量高(0.4 mg/g)，為一般蔬菜含量的10倍，與蛋類、豆類、動物肝臟中的含量相近.此外，甘肅省新醫(yī)藥研究所劉國權(quán)教授對蘭州百合成分藥理實驗分析，結(jié)果認為：蘭州百合豐富的鋅元素可調(diào)節(jié)人體機理平衡，增強人體免疫力，對肝癌、肺癌等病都有一定的抑制作用.

現(xiàn)代醫(yī)學發(fā)現(xiàn)，百合提取物對小白鼠肉癌S-180，子宮頸癌u-14有抑制作用；所含有的秋水仙堿對癌細胞的有絲分裂有抑制功能，能使其停止在中期.近年來蘭州百合不斷地應用于美容方面，具有排毒解毒的功效.

本實驗通過采用組織懸液法處理蘭州百合的鱗莖、根，120 ℃1 h處理蘭州百合根際土，然后分別接種于改良高氏I號、腐殖酸培養(yǎng)基、幾丁質(zhì)培養(yǎng)基等10種植物內(nèi)生放線菌培養(yǎng)基和SCA、甘油—精氨酸培養(yǎng)基、HVA等7種土壤放線菌培養(yǎng)基進行分離培養(yǎng)，并統(tǒng)計不同培養(yǎng)基中所得放線菌菌落數(shù)量與種類.應用統(tǒng)計學方法，根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，來選擇出最適植物內(nèi)生以及根際土放線菌生長的最適培養(yǎng)基，對未來快速分離蘭州百合鱗莖和根內(nèi)生放線菌以及根際土放線菌起著重要作用.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品

2014年3月8日采自于蘭州市二十里鋪海家?guī)X鄉(xiāng)百合種植地的3年生蘭州百合及其根際土.

1.1.2主要試劑

0.1% Tween-20溶液，75% 乙醇溶液，2%的次氯酸鈉溶液，10%的碳酸氫鈉溶液，生理鹽水，大量高溫滅菌蒸餾水.

1.1.3主要藥品

瓊脂粉、可溶性淀粉、精氨酸、甘油、腐殖酸、甘露糖、酪素、核黃素、硫胺素、維生素B6、煙酸、肌醇、泛酸；磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸銅、硫酸亞鐵、硫酸錳、氯化鉀、氯化鈉、氯化鈣；重鉻酸鉀、制霉菌素、放線菌酮、萘啶酮酸等.

1.1.4主要器材及儀器

9 cm培養(yǎng)皿、剪刀，鑷子，酒精燈，酒精棉球，移液槍，槍頭(藍色、黃色)、研缽、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、pH計、蒸汽滅菌鍋、搖床培養(yǎng)箱等.

1.2實驗方法

1.2.1培養(yǎng)基的配制

表1植物內(nèi)生放線菌培養(yǎng)基配方

1.2.2蘭州百合鱗莖及根消毒處理

將采集的百合樣品用自來水沖洗去掉表面的泥沙，用濾紙吸干表面的水分，對樣品進行適當?shù)男藜簦蛊澉[莖與根分開,然后在無菌超凈臺中進行處理.首先將百合組織鱗莖及根分別用濃度為0.1%的Tween-20 浸泡5分鐘，無菌水沖洗干凈.75%的酒精浸泡5分鐘，無菌水潤洗3次將表面的酒精沖洗干凈.2%的次氯酸鈉消毒5分鐘，無菌水沖洗3次.10%的碳酸氫鈉漂洗5分鐘，無菌水潤洗3次，但要留下最后一次清洗百合鱗莖及根的無菌水，裝于小燒杯中，待用.

表2蘭州百合根際土放線菌培養(yǎng)基配方

1.2.3蘭州百合根際土采樣及預處理

1.2.3.1土樣采集與前期處理

采用五點采樣法，選取五個點采樣，使用鏟子慢慢將蘭州百合從土壤中鏟出，在此過程當中不要傷及根部.然后輕輕地抖掉根部多余的土壤，之后用刷子刷取粘附于根系表面的土壤，收集于采樣瓶中，之后置于無菌工作臺無菌風下吹20 d.

1.2.3.2土樣預處理

將無菌風吹過的土樣進行120 ℃1 h預處理, 然后將處理后的根際土樣作10-1、10-2、10-3梯度稀釋.之后將處理后的土樣加入無菌玻璃珠，至于搖床200 rpm，20 ℃處理30 min.

1.2.4放線菌的分離

本實驗中抑菌劑統(tǒng)一為：重鉻酸鉀(50 μg/mL)，萘啶酮酸(20 μg/mL),放線菌酮(50 μg/mL)，制霉菌素(50 μg/mL).

將抑菌劑加入已滅完菌的培養(yǎng)基中(10 uL/mL，即每毫升培養(yǎng)基加入10 uL抑菌劑)，然后倒平板.

將表面消毒處理后的百合根、鱗莖用無菌濾紙吸干表面水分后，采用組織懸液法進行百合內(nèi)生放線菌的分離.然后將處理后百合根、鱗莖的組織懸液分別涂布于十種培養(yǎng)基上.

組織懸液法就是向裝有消毒后的百合鱗莖和根的研缽中分別加入10 mL生理鹽水，進行研磨.靜置10 min，吸取上清液200 μL于培養(yǎng)基上，涂布均勻.另外，將樣品表面消毒留下的最后一次清洗百合鱗莖及根的無菌水分別吸取200 uL，分別涂布于改良高氏I號培養(yǎng)基上涂布均勻，作為空白對照.并將處理后的根際土樣分別涂布于七種培養(yǎng)基上.

1.2.5放線菌的培養(yǎng)

將涂布后的平板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為23 ℃，時間為30 d，然后觀察并計數(shù).

2　結(jié)果

2.1蘭州百合表面消毒

本實驗將最后一次清洗植物表面的無菌水涂布到改良高氏I號培養(yǎng)基上，經(jīng)過30 d的培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)平板上無菌生長，表明百合根和鱗莖表面無外源菌存在，培養(yǎng)基上生長的菌為百合根與鱗莖的內(nèi)生菌.

2.1.1不同培養(yǎng)基分離百合根部內(nèi)生放線菌

圖1　不同培養(yǎng)基分離根內(nèi)生放線菌的數(shù)量

圖2　不同培養(yǎng)基分離根內(nèi)放線菌種類

圖1、圖2為10種不同培養(yǎng)基上百合根內(nèi)生放線菌的生長情況.從圖中可見，經(jīng)組織懸液法處理從腐殖酸維生素培養(yǎng)基(E3)分離放線菌的數(shù)量最多，共662株，5種不同菌株.E8、E2、E1分離放線菌數(shù)量分別為187株、150株、51株，菌株種類分別為7種、2種、15種；E7、E9、E10無放線菌生長.

2.1.2不同培養(yǎng)基分離百合鱗莖內(nèi)生放線菌

圖3　不同培養(yǎng)基分離鱗莖內(nèi)生放線菌數(shù)量

圖4　不同培養(yǎng)基分離鱗莖內(nèi)生放線菌的種類

圖3、圖4為百合鱗莖內(nèi)生放線菌的生長情況.由圖可知采用組織懸液法從9種培養(yǎng)基上均分離到內(nèi)生放線菌.E9分離內(nèi)生放線菌的數(shù)量最多，共109株；E4分離內(nèi)生放線菌的種類最多，共10種.而E10沒有分離出任何百合內(nèi)生放線菌.

2.1.3不同培養(yǎng)基分離百合根部及鱗莖內(nèi)生放線菌

圖5、圖6為百合鱗莖、根內(nèi)生放線菌數(shù)量及種類的比較.從數(shù)量上來看，大部分培養(yǎng)基根內(nèi)生放線菌的數(shù)量及種類大于鱗莖內(nèi)生放線菌.從E3培養(yǎng)基分離到的百合根內(nèi)生放線菌數(shù)量最多，共662株；E1培養(yǎng)基分離百合根內(nèi)生放線菌的種類最多，共15種.E9分離百合鱗莖內(nèi)生放線菌數(shù)量最多，共109株；E4分離百合鱗莖內(nèi)生放線菌種類最多，共10種.E10無放線菌生長，不適合百合內(nèi)生放線菌的分離.

2.2分離到的放線菌數(shù)量

圖5　鱗莖及根不同培養(yǎng)基生長放線菌的數(shù)量

圖6　鱗莖及根不同培養(yǎng)基生長放線菌的種類

圖7　不同培養(yǎng)基上菌的數(shù)目

實驗從根際土中共獲得354株菌落形態(tài)不同的放線菌，每種培養(yǎng)基上所生長的放線菌也各有差異.在圖7中放線菌種類數(shù)由低到高為1<7<2<5<6<4<3，可得出3號培養(yǎng)基相對于其他培養(yǎng)基更適于根際土放線菌的生長.

3　結(jié)論

由統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，蘭州百合內(nèi)生放線菌無論是在數(shù)量上還是種類上都要優(yōu)于百合根際土中放線菌.其中，最適蘭州百合根際土放線菌生長的培養(yǎng)基為改良高氏Ⅰ號培養(yǎng)基.

在百合根中，從腐殖酸維生素培養(yǎng)基(E3)分離放線菌數(shù)量最多，共662株.寡營養(yǎng)培養(yǎng)基(E1)分離放線菌種類最多，共15種.百合鱗莖中的IMA-2瓊脂粉培養(yǎng)基(E9)分離百合鱗莖內(nèi)生放線菌數(shù)量最多，共109株.棉子糖-精氨酸培養(yǎng)基(E4)分離內(nèi)生放線菌種類最多，共10種.燕麥片培養(yǎng)基(E10)沒有分離出內(nèi)生放線菌，可能該培養(yǎng)基不適合百合內(nèi)生放線菌的分離.因此，最適于百合鱗莖、根部內(nèi)生放線菌生長的培養(yǎng)基分別為IMA-2瓊脂培養(yǎng)基、腐殖酸培養(yǎng)基.

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2015-12-10

李增政(1995—)，男，云南省臨滄市人.

S682.29；Q948.1

A

1009-2102(2016)01-0038-07