貴州省兩株山羊源羊種布魯菌MLST分析

李沛麗，李世軍，劉　英，王　月，周敬祝，唐光鵬，王定明，周碧君

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貴州省兩株山羊源羊種布魯菌MLST分析

李沛麗1，李世軍2，劉英2，王月2，周敬祝2，唐光鵬2，王定明2，周碧君1

目的了解貴州省2010年分離自山羊的兩株羊種布魯菌的等位基因序列型(Sequence type, ST)及遺傳學(xué)特征，為動(dòng)物間和人間布病疫情的預(yù)防和控制提供科學(xué)依據(jù)。方法應(yīng)用布魯菌屬特異性PCR(BCSP31-PCR)和種/型特異性PCR(AMOS-PCR)對(duì)2010年分離自山羊的兩株布魯菌進(jìn)行鑒定，采用多位點(diǎn)序列分型(Multiple locus sequence typing, MLST)技術(shù)對(duì)兩株布魯菌菌株的7個(gè)管家基因、1個(gè)外膜蛋白基因及1個(gè)基因間區(qū)的序列進(jìn)行測定，將各個(gè)基因的序列與參考菌株的等位基因型進(jìn)行比對(duì)，確定其等位基因譜及序列型(STs)，分析與兩株菌ST型與各種型布魯菌代表菌株的遺傳進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果來自貴州省山羊的兩株布魯菌株經(jīng)BCSP31-PCR鑒定為布魯菌屬細(xì)菌，AMOS-PCR將其鑒定為羊種布魯菌。MLST分析顯示，兩株菌的9個(gè)等位基因序列型為ST8型，與同屬羊種布魯菌的ST7、ST9～ST12、ST34和ST35遺傳關(guān)系最近。結(jié)論貴州省2010年分離的2株布魯菌分離株均為ST8型布魯菌，與同屬羊種布魯菌的ST型遺傳關(guān)系最近，結(jié)果為貴州省人間和動(dòng)物間布病疫情的預(yù)防和控制提供了科學(xué)依據(jù)。

山羊；布魯菌； PCR；MLST；遺傳特征

Supported by the grant from the Science and Technology Projects for Social Development in Guizhou Province (No. Guizhou science co-word SY[2013]3049), the Project of Special Fund for the Cultivation of Outstanding Youth Talents of Science and Technology in Guizhou Province (No. Guizhou Science Renhezi[2015]09), and the Found for the Research Team of Natural Foci and Vector-borne Infectious Disease Control and Prevention (No. RCJD1401)

布魯菌病(Brucellosis)(以下簡稱布病)是由布魯菌屬(Brucella)的細(xì)菌侵入機(jī)體引起世界性、多宿主感染的人獸共患病。本病歷史悠久，分布廣泛，于1860年發(fā)現(xiàn)于地中海的馬耳他島，故又稱為馬耳他熱、地中海熱[1]。早在20世紀(jì)50年代，布魯菌即為美軍成功研發(fā)的第一個(gè)細(xì)菌戰(zhàn)武器，因此也是生物反恐的一個(gè)重要潛在對(duì)象[2]。布病危害嚴(yán)重，家畜罹患布病，懷孕母畜常流產(chǎn)，公畜發(fā)生睪丸炎和附睪炎引起不育，病畜分泌物(如乳汁等)及臟器帶菌，并發(fā)生關(guān)節(jié)炎、淋巴結(jié)炎和滑液囊炎等引起痛疼，嚴(yán)重影響家畜的生產(chǎn)力和動(dòng)物性產(chǎn)品的生物安全，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失[3]。對(duì)人而言，布病并不同于一般的疾病，布魯菌侵入機(jī)體引起變態(tài)反應(yīng)性全身病變，急性期可以治愈，但不易被確診，常被拖延為慢性期，慢性期布病患者可有肝、脾及睪丸腫大，關(guān)節(jié)和脊柱強(qiáng)直，肌腱攣縮變硬等，很難治愈，患腦炎和心肌炎可致命，嚴(yán)重影響人類健康[4]。

貴州省于2010年首次從患病動(dòng)物(山羊)分離出羊種布魯菌，從病原學(xué)角度證實(shí)了布病在貴州省動(dòng)物的存在[5]，隨后人間布病疫情在貴州省迅速擴(kuò)散，散發(fā)和暴發(fā)疫情時(shí)有發(fā)生，防控形勢非常嚴(yán)峻[6-8]。了解動(dòng)物布病病原特點(diǎn)和流行特征是動(dòng)物間和人間布病防控的基礎(chǔ)，本項(xiàng)研究采用基于布魯菌屬外膜蛋白31基因的PCR(BCSP31-PCR)和基于插入序列IS711的牛、羊、綿羊附睪和豬種布魯菌特異的PCR(AMOS-PCR)技術(shù)對(duì)2010年分離自山羊的兩株布魯菌進(jìn)行屬和種(型)鑒定，采用多位點(diǎn)序列分型(Multiple locus sequence typing, MLST)技術(shù)對(duì)2株布魯菌菌株的7個(gè)管家基因、1個(gè)外膜蛋白基因及1個(gè)基因間區(qū)的序列進(jìn)行測定[9-11]，將各個(gè)等位基因的序列與參考菌株的等位基因型進(jìn)行比對(duì)，確定其等位基因譜型及菌株序列型(STs)，分析其與布魯菌不同ST型的遺傳進(jìn)化關(guān)系，為貴州省動(dòng)物間和人間布病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑布魯菌培養(yǎng)基采用進(jìn)口布魯菌肉湯(BD公司，貨號(hào)為211088)和布魯菌瓊脂(BD公司，貨號(hào)為211086)成品培養(yǎng)基按照說明書配制。PCR引物由大連寶生物科技有限公司合成。PCR相關(guān)試劑購買于大連寶生物公司。

1.2實(shí)驗(yàn)菌株實(shí)驗(yàn)菌株為分離自貴州省2010年黔南市龍里縣動(dòng)物(山羊)血液并經(jīng)傳統(tǒng)方法鑒定為羊種生物3型布魯菌菌株(命名為LL3和LL4)。陽性對(duì)照菌株為布魯菌疫苗株A19(牛種)、M5(羊種)和S2(豬種)(購自蘭州生物制品研究所)。

1.3DNA提取挑取布魯菌可疑菌落接種于布魯菌瓊脂平板，培養(yǎng)48 h后采用水煮法提取細(xì)菌核酸。

1.4BCSP31-PCR法鑒定布魯菌屬采用布魯菌屬特異性基因BCSP31作為定屬基因，按照參考文獻(xiàn)[12-13]提供的B4和B5引物序列和參數(shù)進(jìn)行布魯菌屬的鑒定。

1.5AMOS-PCR法鑒定布魯菌種/型采用參考文獻(xiàn)[12-13]提供的以布魯菌屬IS711插入序列為基礎(chǔ)建立的AMOS-PCR引物及參數(shù)進(jìn)行布魯菌種/型的鑒定。

1.6MLST分析采用參考文獻(xiàn)[9-11]提供的布魯菌7個(gè)管家基因(dnaK、gyrB、trpE、aroA、cobQ、gap、glk)、1個(gè)外膜蛋白基因(omp25)和1個(gè)基因間區(qū)int-hyp作為MLST的靶標(biāo)基因，選取的靶標(biāo)基因、引物、序列及擴(kuò)增長度見表1。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸l min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物委托北京天一輝生物科技公司進(jìn)行雙向測序。采用DNAStar軟件包分析整理和編輯序列，使序列長度范圍與文獻(xiàn)中給出的序列一致。將測定序列分別與相應(yīng)基因的等位基因型的序列進(jìn)行比較，明確序列是否與某個(gè)等位基因型的序列一致，如果一致，則定義為某個(gè)等位基因型，否則定義為一個(gè)新的等位基因型。利用MLST在線工具對(duì)序列的等位基因型、進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行分析，確定分離菌株的ST型及與文獻(xiàn)[8-10]報(bào)道的36個(gè)ST型菌株(見表2)間的進(jìn)化關(guān)系。

2　結(jié)　果

2.1BCSP31-PCR鑒定BCSP31-PCR方法對(duì)分離株和對(duì)照菌株核酸進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示兩株分離菌株及陽性對(duì)照菌株核酸均擴(kuò)增出布魯菌屬特異的223 bp的條帶，而陰性對(duì)照無條帶出現(xiàn)。

2.2AMSO-PCR檢測結(jié)果AMOS-PCR方法對(duì)分離株和對(duì)照菌株核酸進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示兩株分離菌株及陽性對(duì)照菌株核酸均擴(kuò)增出羊種布魯菌特異的731 bp的條帶，而陰性對(duì)照無條帶出現(xiàn)。

表1用于擴(kuò)增和測序分析的9對(duì)引物序列Tab.1Primer sequences used for the amplification and sequencing of nine genetic loci

LocusPutativefunctionPrimersequences5'-3'Length/bpLocationgapglyceraldehydes3-phosphatedehydrogenaseYGCCAAGCGCGTCATCGT589AE0172231685083-1685671GCGGYTGGAGAAGCCCCA3'aroA3-phosphoshikimate1-carboxyvinyltransferaseGACCATCGACGTGCCGGG565AE01722329974-30538YCATCAKGCCCATGAATTCglkglucokinaseTATGGAAMAGATCGGCGG475AE017224988660-989134GGGCCTTGTCCTCGAAGGdnaKchaperoneproteinCGTCTGGTCGAATATCTGG470AE0172232066742-2067211GCGTTTCAATGCCGAGCGAgyrBDNAgyraseBsubunitATGATTTCATCCGATCAGGT469AE017223142378-141910CTGTGCCGTTGCATTGTCtrpEanthranilatesynthaseGCGCGCMTGGTATGGCG486AE0172231538194-1537709CKCSCCGCCATAGGCTTCcobQcobyricacidsynthaseGCGGGTTTCAAATGCTTGGA422AE0172231289341-1288920GGCGTCAATCATGCCAGComp2525kDaouter-membraneproteinATGCGCACTCTTAAGTCTC490AE017223710041-710530GCCSAGGATGTTGTCCGTint-hypupstreamandextreme5'ofhypotheticalprotein(BruAb1_1395)CAACTACTCTGTTGACCCGA430AE0172231372708-1372279GCAGCATCATAGCGACGGA

2.3MLST分析結(jié)果MLST分析顯示，兩株布魯菌dnaK、gyrB、trpE、aroA、cobQ、gap、glk、omp25和int-hyp位點(diǎn)的等位基因序列號(hào)分別為3、2、3、2、1、5、3、8和2，聚類分析顯示，兩株菌株等位基因位點(diǎn)序列型別與ST8型相同(表2和圖1)。Split tree分析顯示，至今已發(fā)現(xiàn)的36個(gè)ST型所涵蓋的布魯菌6個(gè)種呈現(xiàn)出相同種的ST型菌株聚類相對(duì)較近，本研究株的兩株分離株與羊種布魯菌ST7、ST9、ST10、ST11、ST12、ST34和ST35遺傳關(guān)系最近，見圖2。

圖1　貴州省兩株山羊來源羊種布魯菌與不同種型布魯菌ST型聚類分析圖Fig.1　Clustering tree of ST of two strains of B. melitensis isolated from goats and different species of Brucella

圖2　貴州省兩株山羊來源羊種布魯菌與不同種型布魯菌ST型Spilt TreeFig.2　Split tree of ST of two strains of B. melitensis isolated from goats and different species of Brucella

表2布魯菌各等位基因譜

Tab.2Allele profiles of Brucella

STgaparoAglkdnaKgyrBtrpEcobQomp25int-hypST1211213111ST2212213111ST3612213111ST4212223111ST5211214111ST65710763711ST73532152102ST8323215382ST9323215392ST103235152102ST113232153102ST123232152102ST13139213431ST14164143521ST15127133523ST16427133523ST17164153524ST18164153525ST19124613521ST20164153564ST21164153554ST22125216541ST23148412521ST24126212521ST25124212521ST26124212671ST27124311521ST282112141111ST292122131111ST30213213111ST31211213812ST32282213111ST332104273911ST343232153122ST353232853122ST36194143521

3　討　論

傳統(tǒng)的分類方法將布魯菌分為羊、牛、豬、犬、綿羊附睪和沙林鼠6個(gè)生物種19個(gè)生物型，即牛種布魯菌B.abortus8個(gè)型；豬種布魯菌B.suis5個(gè)型；羊種布魯菌B.melitensis3個(gè)型；犬種布魯菌B.canis、綿羊附睪種布魯菌B.ovis和沙林鼠種布魯菌B.neotomae各1型。因其生物種、型和菌株的不同，致病力各異，對(duì)人致病力最強(qiáng)的為羊種菌，其次為豬種菌，牛種菌對(duì)人致病力弱。動(dòng)物布病主要由羊種、牛種和豬種菌感染羊、牛和豬等動(dòng)物呈急性或慢性經(jīng)過[4]。因此，了解布病病原學(xué)特征對(duì)布病的有效預(yù)防和控制至關(guān)重要。貴州省分別于2010年首次從患病動(dòng)物(羊)和病人分離出羊種布魯菌[5-6]，此后，布病疫情在貴州省迅速擴(kuò)散，散發(fā)和暴發(fā)疫情時(shí)有發(fā)生[7-8]。本研究將來源于貴州省山羊的兩株菌株采用屬特異性BCSP31-PCR和AMOS-PCR進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示本次分離的可疑細(xì)菌為羊種布魯菌。

傳統(tǒng)血清學(xué)方法鑒定只能將布魯菌鑒定到種(型)，無法對(duì)菌株進(jìn)行溯源分析，一些低分辨率的分子分型方法如PCR產(chǎn)物限制性片段長度低多態(tài)性(PCR-RFIP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD-PCR)和擴(kuò)增片斷長度多態(tài)性分析(AFLP)等在分子流行病學(xué)中應(yīng)用價(jià)值十分局限。由于布魯菌屬種間DNA同源性高達(dá)90%，需要高分辨力的分型方法用來提供疾病傳播模式和分子流行病學(xué)信息，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子分型技術(shù)被廣泛應(yīng)用于傳染病病原菌的溯源。布魯菌分子分型方法如脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)[13]、多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(multilocus variable-Humber tandem repeat analysis, MLVA-16)技術(shù)[14]應(yīng)運(yùn)而生和MLST技術(shù)[10]在細(xì)菌性傳染病的病原鑒定、傳染源追蹤與病原體的溯源等方面發(fā)揮了重要作用。然而，PFGE實(shí)驗(yàn)過程中活菌操作繁多，實(shí)驗(yàn)室感染風(fēng)險(xiǎn)較大，與MLVA-16技術(shù)相比，MLST方法更能反映菌株的遺傳特征，在實(shí)驗(yàn)過程的可操作性及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性之間取得了平衡，在不同的實(shí)驗(yàn)室之間具有良好的可比性[10]。Adrian等[9]2006年采用MLST技術(shù)對(duì)來自不同國家的160株不同種型布魯菌分為27個(gè)ST型，Chen YF等[11]對(duì)來自中國的60株布魯菌進(jìn)行了MLST分析，結(jié)果在Adrian等發(fā)現(xiàn)的27個(gè)ST型的基礎(chǔ)上增加了9個(gè)新的ST型，分別命名為ST28～ST36。因此，本研究中我們采用布魯菌MLST分子分型方法對(duì)2010年分離自貴州省山羊的菌株進(jìn)行分子分型分析并與已發(fā)現(xiàn)的ST型進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果兩株菌株均為ST8型，聚類分析結(jié)果顯示(圖1)，本次分離菌株與同屬羊種布魯菌幾個(gè)ST型聚類處于同一分支，其中與ST8型聚類最近，從遺傳學(xué)水平證實(shí)了兩株布魯菌為羊種布魯菌，這與全國布魯菌病原體種型分布一致[15-16]，同時(shí)與Chen YF以及周曉艷[10-11]等發(fā)現(xiàn)的中國菌株以ST8為優(yōu)勢序列型的結(jié)果一致，提示ST8(表2)序列型可能為貴州省動(dòng)物間和人間布病病原體的優(yōu)勢序列型。流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，本研究中的患者均為養(yǎng)羊戶，所飼養(yǎng)的羊多數(shù)為我省因畜牧業(yè)發(fā)展需求而從外地引進(jìn)羊或是來歷不明的山羊，本研究分析證實(shí)兩株布魯菌序列型與我國其他地區(qū)的具有流行優(yōu)勢的ST8型一致，提示我省動(dòng)物間布魯菌感染為輸入性傳播。

為了進(jìn)一步了解分離株的遺傳學(xué)特征，我們利用Splits tree工具，對(duì)ST型的數(shù)據(jù)進(jìn)行分裂分解分析(Split decomposition analysis)，從圖2中可以看出，ST8與其它幾個(gè)同屬于羊種布魯菌的ST型(ST7～ST11、ST34和ST35)相距較近，它們均由ST12分離而來。與其它種的布魯菌相比，羊種菌的這幾個(gè)ST型是聚集較近，說明羊種布魯菌在基因水平上是高度保守的。

貴州省近年正值畜牧業(yè)大力發(fā)展時(shí)期，羊、牛等種畜大多從國內(nèi)布病高發(fā)的區(qū)域引進(jìn)，在引種的同時(shí)有可能導(dǎo)致布病傳染源輸入貴州省引發(fā)畜間或人間布病流行。2010年首次從山羊分離出羊種布魯菌，從病原學(xué)角度證實(shí)了布病在畜間存在[2]，隨后的2011年相繼在患者血液分離出羊種布魯菌[6]，人間布病疫情迅速擴(kuò)散，疫情中多數(shù)患者均為養(yǎng)羊戶或與羊具有接觸史，且患者分離流行菌株均為羊種布魯菌，本研究結(jié)果顯示2株山羊來源菌株為羊種布魯菌的ST8型，提示ST8型菌株很有可能是引起人間布病疫情的病原菌，然而，人間布病流行菌株序列型是否同為ST8型尚需進(jìn)一步研究。此外，本研究分析的動(dòng)物來源菌株數(shù)量受限，結(jié)果是否具有代表性尚需進(jìn)一步研究。本研究對(duì)貴州省2010年分離自山羊的的兩株布魯菌采用PCR方法和MLST技術(shù)進(jìn)行分析，揭示了菌株序列型為ST8，結(jié)果為貴州省布病的防控提供了科學(xué)依據(jù)，在保護(hù)人群健康和保障畜牧業(yè)發(fā)展方面具有重要意義。

[1] Shang DQ. Brucellosis raging again and the reasons[J]. Chin J Ctrl Endem Dis, 2001, 16(1): 29-34. DOI:10.3969/j.issn.1001-1889.2001.02.016.(in Chinese)

尚德秋. 布魯氏菌病再度肆虐及其原因[J]. 中國地方病防治雜志,2001, 16(1): 29-34.

[2] Pappas G, Panagopoulou P, Christou L, et al.Brucellaas a biological weapon [J]. Cell Mol Life Sci, 2006, 63(19/20): 2229-2236.DOI:10.1007/s00018-006-6311-4.

[3] Seleem MN, Boyle SM, Sriranganathan N. Brucellosis: a re-emerging zoonosis[J]. Vet Microbiol, 2010, 140(3/4): 392-398.DOI:10.1016/j.vetmic.2009.06.021.

[4] Franco MP, Mulder M, Gilman RH, et al. Human brucellosis[J]. Lancet Infect Dis, 2007, 7(12): 775-786. DOI: 10.1016/S1473-3099(07)70286-4.

[5] Li SJ, Wang Y, Chen H, et al. Isolation and identification ofBrucellamelitensisfirstly isolated from goat in Guizhou province[J]. Chin J Zoonoses, 2011, 27(6): 515-518. (in Chinese)

李世軍，王月，陳紅，等. 貴州省首次從山羊分離到布魯氏菌及其種型鑒定[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào),2011, 27(6): 515-518.

[6] Li SJ, Wang Y, WANG DM, et al. Etiologic diagnosis and analysis of the first case of human brucellosis in Guizhou Province[J]. Chin J Endem Dis, 2012, 31 (5): 69-71. DOI:10.3760/cma.j.issn.1000-4955.2013.06.013.(in Chinese)

李世軍，王月，王定明，等.貴州省首例人間布魯氏菌病病例的病原學(xué)診斷與分析[J]. 中國地方病學(xué)雜志,2012, 31 (5) : 69-71.

[7] Liu Y, Wang Y, Ma Q, et al. Etiologic identification and analysis of the human brucellosis in Guizhou Province, China, 2013[J]. Chin J Zoonoses, 2015, 31(1): 45-48. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2015.01010.(in Chinese)

劉英，王月，馬青，等.貴州省2013年人間布魯氏菌病病原體種例鑒定與分析[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào),2015,31(1):45-48.

[8] Li SJ, Wang Y, Wang DM, et al. Identification and genetic characteristics on the bacteria isolate from a case of human brucellosis in Guizhou province[J]. Chin J Epidemiol, 2013, 34(7): 717-720. DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2013.07.013.(in Chinese)

李世軍，王月，王定明，等. 貴州省一起人間布魯氏菌病疫情的菌株鑒定及遺傳特征研究[J].中華流行病學(xué)雜志，2013, 34(7): 717-720.

[9] Whatmore AM, Perrett LL, MacMillan AP. Characterisation of the genetic diversity ofBrucellaby multilocus sequencing[J]. BMC Microbiol, 2007, 20(7): 34.DOI: 10.1186/1471-2180-7-34.

[10] Zhou HY, Chen YF, Cui BY, et al. Multiple sequence typing analysis ofBrucellamelitensisserotype 3 strains[J]. Chin J Zoonoses, 2011, 27(5): 371-375. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2011.05.002.(in Chinese).

周海艷，陳燕芬，崔步云，等. 我國羊種3型布魯氏菌的多位點(diǎn)序列分型研究[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào), 2011, 27(5):371-375.

[11] Chen Y, Ke Y, Wang Y, et al. Changes of predominant species/biovars and sequence types ofBrucellaisolates, Inner Mongolia, China[J]. BMC Infect Dis, 2013, 13: 514. DOI: 10.1186/1471-2334-13-514.

[12] Jiang H, Cui BY, Zhao HY, et al. Use of AMOS-PCR assay for the species identification ofBrucella[J]. Chin J Zoonoses, 2009, 25(2): 107-109. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2009.02.004.(in Chinese)

姜海，崔步云，趙鴻雁,等. AMOS-PCR對(duì)布魯氏菌種型鑒定的應(yīng)用[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2009, 25(2): 107-109.

[13] Cespedes S, Salgado P, Valenzuela P, et al. Characterization of genomic island 3 and genetic variability of Chilean field strains ofBrucellaabortus[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(7): 2461-2469.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2009.07.006.

[14] Her M, Kang SI, Cho DH, et al. Application and evaluation of the MLVA typing assay for theBrucellaabortusstrains isolated in Korea[J]. BMC Microbiol, 2009, 9: 230.

[15] Deng YQ, Wang JX, Lin DH, et al. Molecular identification of theBrucellastrains isolated in Fujian province[J]. Chin J Zoonoses, 2009, 25(7): 636-639.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2015.01.11 (in Chinese)

鄧艷琴，王加熊，林代華,等. 福建省布魯氏菌分離株的分子生物學(xué)鑒定[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào),2009, 25(7): 636-639.

[16] Cui BY.Brucellaepidemic situation and vaccine research in China[J]. Chin J Epidemiol, 2012, 31(4): 355-356. (in Chinese)

崔步云.關(guān)注中國布魯桿菌病疫情發(fā)展和疫苗研究[J].中國地方病學(xué)雜志,2012, 31(4): 355-356.

Multiple locus sequence typing of two strains ofBrucellamelitensisisolated from goats in Guizhou Province

LI Pei-li1, LI Shi-jun2, LIU Ying2,WANG Yue2, ZHOU Jing-zhu2,TANG Guang-peng2,WANG Ding-ming2,ZHOU Bi-jun1

(1.CollegeofAnimalScience,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China;2.GuizhouProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Guiyang550004,China)

In order to understand the allele locus gene sequence type (ST) and the genetic characteristic of twoBrucellamelitensisstrains isolated from goats in Guizhou Province in 2010 and provide scientific basis for the control and prevention of animal and human brucellosis, the two isolates were identified by usingBrucellagenus specific BCSP31-PCR and species-specific AMOS-PCR, and the seven house-keeping genes and one out membrane protein gene and one gene -inter- region sequence of the strains were further analyzed using multiple locus sequence typing (MLST). Each gene sequence was compared with the reference strains to determine the allelic profile and sequence type, and the ST data-based genetic relationship of the two isolates andBrucellastrains representing different species were analyzed. The results showed that the twoBrucellastrains were identified asB.melitensiswith BCSP31-PCR and AMOS-PCR. MLST analysis revealed that the 9 alleles based sequence type of the two strains was ST8, which was genetically closed to the STs (ST7, ST8-ST12, ST34 and ST35) belonging toB.melitensis. The results indicate that the sequence type of the two strains ofB.melitensisisolated from goats in Guizhou Province in 2010 is ST8, close to the STs belonging toB.melitensis.

goats;Brucellamelitensis; PCR; MLST; genetic characteristic

Zhou Bi-jun, Email: as.bjzhou@gzu.edu.cn；Li Shi-jun,Email:zjumedjum@163.com

周碧君，Email：as.bjzhou@gzu.edu.cn；李世軍，Email：zjumedjun@163.com

1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院，貴陽550025；2.貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴陽550004

R378.5

A

1002-2694(2016)06-0547-06

2015-07-28；

2015-11-19

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.06.008

貴州省科技公關(guān)計(jì)劃社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(No.黔科合SY[2013]3049)、貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)對(duì)象專項(xiàng)資金項(xiàng)目(黔科合人字[2015]09號(hào))和貴州省傳染病人才培養(yǎng)基地項(xiàng)目(黔人領(lǐng)發(fā)[2013]15)“自然疫源性和蟲媒傳染病”研究團(tuán)隊(duì)(RCJD1401)經(jīng)費(fèi)聯(lián)合資助