急性腦梗死患者外周血單個核細(xì)胞KLF2 mRNA水平與TOAST分型的關(guān)系

鄒成林　陳維鈞　方璟　孫曉順　趙亞洲　涂軍

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急性腦梗死患者外周血單個核細(xì)胞KLF2 mRNA水平與TOAST分型的關(guān)系

鄒成林陳維鈞方璟孫曉順趙亞洲涂軍

目的 研究急性腦梗死(ACI)患者外周血單個核細(xì)胞KLF2 mRNA水平變化,分析其與血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)濃度及急性卒中治療低分子肝素試驗(TOAST)病因分型的相關(guān)性,初步探討KLF2在ACI損傷中的作用機(jī)制。方法分別應(yīng)用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定45例ACI患者(ACI組)及45例健康體檢者(對照組)的外周血單個核細(xì)胞KLF2 mRNA表達(dá)水平及血清TNF-α濃度,并按照TOAST病因分型標(biāo)準(zhǔn)將ACI組患者分為大動脈粥樣硬化型(large artery atherosclerosis,LAA)20例、小動脈閉塞型(small artery occlusion,SAO)25例。分析各組KLF2 mRNA水平的差異,以及KLF2 mRNA水平與TNF-α濃度及TOAST病因分型的相關(guān)性。對ACI患者進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分(NIHSS),并比較不同程度神經(jīng)功能缺損的KLF2 mRNA水平。結(jié)果ACI組外周血單個核細(xì)胞KLF2 mRNA水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),并且KLF2 mRNA表達(dá)水平與血清TNF-α濃度之間存在相關(guān)性(r=-0.594,P<0.05)。LAA型KLF2 mRNA水平低于SAO型和對照組,SAO型KLF2 mRNA表達(dá)水平低于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ACI組外周血單個核細(xì)胞KLF2 mRNA水平與NIHSS評分存在相關(guān)關(guān)系(r=-0.487,P<0.05)。結(jié)論ACI患者外周血單個核細(xì)胞KLF2 mRNA水平降低,LAA型患者和神經(jīng)功能缺損患者降低更顯著。KLF2 mRNA與血清TNF-α濃度呈負(fù)相關(guān),KLF2可能通過介導(dǎo)ACI的炎癥反應(yīng)在其發(fā)病中產(chǎn)生作用。

急性腦梗死; KLF2; TOAST分型

急性腦梗死(acute cerebral infarction,ACI)是由于血管壁局部病變導(dǎo)致血管痙攣、狹窄或閉塞引起的局部腦組織缺血、缺氧而引起的細(xì)胞死亡,其常見原因是動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)。目前認(rèn)為AS是一種炎癥性疾病,近年研究發(fā)現(xiàn)Küppel樣轉(zhuǎn)錄因子2(KLF2)具有防止血栓形成、抗炎、穩(wěn)定血管內(nèi)皮等作用,在抗AS方面具有重要的作用[1]。本研究應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定ACI患者外周血單個核細(xì)胞KLF2 mRNA水平變化,同時用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)濃度,分析KLF2 mRNA水平與血清TNF-α濃度、急性卒中治療低分子肝素試驗(TOAST)分型、神經(jīng)功能缺損程度相關(guān)性,初步探討KLF2在ACI損傷中的可能作用。

1　對象與方法

1.1研究對象來自我院神經(jīng)內(nèi)科2012年3月至2013年3月治療的ACI患者45例(ACI組),其中男24例,女21例,年齡60～75歲,平均(62.6±10.8)歲。均簽訂知情同意書。所有患者均按照1995年全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會議通過的腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)[2],并且經(jīng)頭部CT或MRI證實,均為首次發(fā)病,發(fā)病72 h內(nèi)入院,既往無卒中病史,排除感染、惡性腫瘤、創(chuàng)傷等影響檢測指標(biāo)的患者。另選取同期我院體檢中心45例健康體檢者作為對照組,其中男20例,女25例,年齡58～72歲,平均(61.5±11.4)歲。按TOAST病因分型標(biāo)準(zhǔn)[3],結(jié)合臨床資料及影像學(xué)檢查,將ACI組分為大動脈粥樣硬化型(large artery atherosclerosis,LAA)20例、小動脈閉塞型(small artery occlusion,SAO)25例。

1.2方法

1.2.1主要試劑及儀器:ELISA檢測試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司),淋巴細(xì)胞分離液(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所),全血RNA提取試劑盒(美國OMEGA公司),TRIzol RNA試劑(TIANGEN公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(promega公司),東勝PCR儀,2000型凝膠成像分析系統(tǒng),引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。KLF2引物系列:上游5’-GCACACTTGCAGCTACAC-3’,下游5’-AGGCTTCTCACCTGTGTG-3’,預(yù)期目的片段141 bp。GAPDH上游5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’,下游5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’,預(yù)期目的片段87 bp。

1.2.2血液生化指標(biāo)檢測:ACI組住院次日清晨、對照組當(dāng)日清晨抽取空腹肘前靜脈血7 ml,其中2 ml置于EDTA-K2抗凝管中,檢測空腹血糖(FBG)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C),余5 ml用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個核細(xì)胞,置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3RT-PCR檢測KLF2 mRNA表達(dá):將分離出的單個核細(xì)胞用TRIzol RNA分離液一步提取總RNA，OD260/OD280應(yīng)在1.8～2.0，取一部分RNA于42 ℃下用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA，然后加入KLF2及GAPDH引物進(jìn)行PCR，熱循環(huán)條件為94℃預(yù)變性5 min，94 ℃熱變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。取5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用2000型凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以目的條帶與GAPDH條帶OD值的比值(ODR)表示KLF2 mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.4臨床神經(jīng)功能缺損程度評分:按照美國國立衛(wèi)生院神經(jīng)功能缺損評分(NIHSS)系統(tǒng)對ACI患者進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評估,其中0～1分為正常,2～4分為輕度神經(jīng)功能缺損,5～14分為中度神經(jīng)功能缺損,≥15分為重度神經(jīng)功能缺損。

2　結(jié)果

2.1ACI組與對照組一般資料比較2組患者的年齡、性別、高血壓病史、糖尿病病史以及FBG、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　ACI組與對照組一般臨床資料比較(n=45)

2.2ACI組與對照組KLF2 mRNA表達(dá)水平的比較ACI組患者外周血單個核細(xì)胞KLF2 mRNA表達(dá)水平低于對照組,TNF-α濃度高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ACI組外周血單個核細(xì)胞KLF2 mRNA表達(dá)水平與血清TNF-α濃度之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.594,P<0.05)。見表2。

2.3TOAST分型各亞型與對照組KLF2 mRNA表達(dá)水平的比較不同TOAST分型的KLF2 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義,進(jìn)一步兩兩比較的結(jié)果顯示LAA型KLF2 mRNA水平低于SAO型和對照組,SAO型KLF2 mRNA表達(dá)水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。不同TOAST分型血清TNF-α濃度比較顯示,LAA型及SAO型高于對照組,LAA型高于SAO型,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

組別KLF2mRNATNF-α(μg/L)對照組0.78±0.042.03±0.21ACI組0.33±0.103.64±0.23t28.4332.93P<0.01<0.01

組別KLF2mRNATNF-α(μg/L)LAA型(n=20)0.24±0.03*△3.83±0.10*△SAO型(n=25)0.42±0.04*3.44±0.18*對照組(n=45)0.78±0.042.03±0.21F1685.43892.15P<0.01<0.01

注:與對照組比較,*P<0.05;與SAO型比較,△P<0.05

2.4ACI患者臨床神經(jīng)功能缺損情況與KLF2 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析以NIHSS評分來反映患者的神經(jīng)功能缺損程度。不同程度神經(jīng)功能缺損各組NIHSS評分、KLF2 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)Pearson相關(guān)分析,ACI組外周血單個核細(xì)胞KLF2 mRNA水平與NIHSS評分存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.487,P<0.05),即病情越重,外周血單個核細(xì)胞KLF2 mRNA水平越低。見表4。

神經(jīng)功能缺損程度NIHSS評分(分)KLF2mRNA輕型(n=10)2.60±0.700.43±0.04中型(n=18)8.61±2.640.23±0.01*重型(n=17)17.82±2.450.16±0.03*△F153.05303.10P<0.01<0.01

注:與輕型比較,*P<0.05；與中型比較，△P<0.05

3　討論

Küppel樣轉(zhuǎn)錄因子(KLF)是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)域的核轉(zhuǎn)錄因子,它們對不同基因啟動子的GT盒具有不同的親和力,作為轉(zhuǎn)錄激活子,或作為轉(zhuǎn)錄抑制子調(diào)控特定基因的表達(dá)。KLF2為KLF家族中的成員,其與AS密切相關(guān),在AS病變的多種細(xì)胞中參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控各種因子。在AS小鼠模型中,當(dāng)KLF2被敲除后其AS程度加重,斑塊面積增大,提示KLF2在AS中具有保護(hù)作用[4]。有研究表明,與正常對照組相比,冠心病組單核細(xì)胞內(nèi)的KLF2 mRNA表達(dá)降低[5]。ACI是一個極其復(fù)雜的病理生理過程,病因復(fù)雜多樣,主要病因為AS[6]。因此本研究旨在探索KLF2在ACI過程中可能的作用。目前關(guān)于ACI與 KLF2關(guān)系的臨床研究較少,本研究發(fā)現(xiàn),ACI組的KLF2 mRNA水平低于對照組,說明KLF2在ACI發(fā)病過程中發(fā)揮一定的作用,但具體通過何種途徑發(fā)揮作用尚不清楚。

動物實驗研究發(fā)現(xiàn),KLF2通過調(diào)節(jié)血腦屏障發(fā)揮腦保護(hù)作用,KLF2基因缺失小鼠缺血面積大,血腦屏障損傷嚴(yán)重,相反,KLF2基因過表達(dá)小鼠缺血面積小,血腦屏障損傷小[7]。本研究發(fā)現(xiàn),ACI組TNF-α濃度較對照組增高,且外周血單個核細(xì)胞KLF2 mRNA表達(dá)水平與血清TNF-α濃度之間呈負(fù)相關(guān)。不同TOAST分型血清TNF-α濃度比較顯示,LAA型及SAO型高于對照組,LAA型高于SAO型(P<0.05)?？紤]KLF2可能參與腦缺血病理過程中對炎癥因子的調(diào)控。Mahabeleshwar等[8]研究發(fā)現(xiàn)KLF2通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)及低氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá),從而抑制炎癥及氧化應(yīng)激對細(xì)胞的損害。在內(nèi)皮細(xì)胞中炎癥因子TNF-α通過NF-κB抑制KLF2轉(zhuǎn)錄激活劑肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2(MEF2)可下調(diào)KLF2的表達(dá)[9]。

本研究采用TOAST分型標(biāo)準(zhǔn),旨在觀察不同分型ACI患者外周血單個核細(xì)胞KLF2 mRNA水平是否有差異。研究顯示,LAA型KLF2 mRNA水平低于SAO型和對照組,SAO型KLF2 mRNA表達(dá)水平低于對照組。提示KLF2在不同病因ACI的發(fā)病機(jī)制中權(quán)重不同?？紤]LAA型卒中多由于大動脈堵塞所致,病灶大,AS斑塊處的細(xì)胞凋亡和免疫炎癥反應(yīng)重,SAO型卒中主要是由于長期高血壓、糖尿病等損傷導(dǎo)致的深穿支病變或彌漫性腦小動脈病變所致,梗死灶小[10]。

本研究進(jìn)一步探討了疾病嚴(yán)重程度,即NIHSS評分與患者外周血中單個核細(xì)胞KLF2 mRNA水平的關(guān)系。對2者進(jìn)行相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn),ACI組外周血中KLF2 mRNA水平與NIHSS評分呈負(fù)相關(guān)。ACI患者神經(jīng)功能損傷越重,外周血單個核細(xì)胞中KLF2 mRNA水平越低。

綜上所述,ACI患者外周血單個核細(xì)胞KLF2 mRNA水平下降,且與血清TNF-α濃度、TOAST分型、神經(jīng)功能缺損程度相關(guān),ACI患者KLF2 mRNA水平越低,神經(jīng)受損越嚴(yán)重。外周血單個核細(xì)胞KLF2 mRNA水平在腦梗死發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用,其可能通過介導(dǎo)ACI的炎癥反應(yīng)在腦梗死發(fā)病中有一定的作用,但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Study on the expression of KLF2 mRNA IN peripheral blood mononuclear cells in patients with acute ischemic infarction and its relationship with TOAST subtypes

ZOUCheng-lin,CHENWei-jun,FANGJing,SUNXiao-shun,ZHAOYa-zhou,TUJun.

DepartmentofInternalMedicine,theSecondPeople’sHospitalofJingzhou,Jingzhou434000,China

ObjectiveTo observe the level of KLF2 mRNA in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) in patients with acute cerebral infarction(ACI), and to analyze the relationship of KLF2 mRNA with the serum level of TNF-α and TOAST subtypes.MethodsForty-five patients with ACI (ACI group) were admitted in our hospital, and other forty-five healthy subjects were chosen as control group. ACI group was divided into large artery atherosclerosis (LAA) group(20 cases) and small artery occlusion (SAO) group (25 cases) according to TOAST classification criteria. The level of KLF2 mRNA was compared among the groups. The correlation of KLF2 mRNA level with the serum level of TNF-α or neurologic impairment (NIHSS) scores was analyzed.ResultsThe level of KLF2 mRNA in ACI group was significantly lower than that of control group (P<0.05). The level of KLF2 mRNA in LAA type was significantly lower than that of SAO type and control group(P<0.05). The level of KLF2 mRNA in SAO type was lower than that of control group(P<0.05). The level of KLF2 mRNA was correlated with the serum level of TNF-α(r=-0.594,P<0.05) and NIHSS score(r=0.487,P<0.05), respectively.ConclusionsThe level of KLF2 mRNA in PBMCs of ACI patients is decreased, especially in the patients with LAA or with severe neurological dysfunction. The level of KLF2 mRNA is negatively correlated with the serum level of TNF-α, which might play a role in the pathogenesis of ACI through exerting inflammation injury.

acute cerebral infarction; KLF2; TOAST classification

434000湖北省荊州市，荊州市第二人民醫(yī)院內(nèi)一科

R 743.33

Adoi:10.3969/j.issn.1003-9198.2016.01.015

2015-03-11)