分子印跡技術在三聚氰胺檢測中的應用

王桂華，孫健平（天津桂發(fā)祥十八街麻花食品股份有限公司，天津300221）

分子印跡技術在三聚氰胺檢測中的應用

王桂華，孫健平*
（天津桂發(fā)祥十八街麻花食品股份有限公司，天津300221）

三聚氰胺本是一種化工原料，近些年來一些不法商家卻將其非法添加到乳制品及飼料中，危害了人們的健康。分子印跡技術憑借其獨特的優(yōu)勢成為了食品分析檢測中的研究熱點。介紹分子印跡技術的原理及聚合方法，并綜述通過不同方法制備分子印跡聚合物檢測三聚氰胺的研究進展。

三聚氰胺；分子印跡；制備；檢測；乳制品

三聚氰胺（Melamine，MEL），分子式為C3H6N6，結構式見圖1，俗稱密胺、蛋白精，學名為“2，4，6-三氨-1，3，5-三嗪”，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物。它是一種化工原料，幾乎無味，如若攝入到人體內(nèi)會生成三聚氰酸，三聚氰酸和三聚氰胺可形成大的網(wǎng)狀結構，造成結石，對腎和膀胱造成嚴重的危害，因此不可添加到食品中[1]。眾多周知，食品中蛋白質(zhì)含量的現(xiàn)行國家標準和國際通行測定方法是經(jīng)典的凱氏定氮法，即通過測定樣品的含氮量，反推出其蛋白質(zhì)含量，但實際并不能分析出其化學成分。三聚氰胺的含氮量高達66%，一些不法無良商家便將其非法添加到食品或飼料中，假冒蛋白質(zhì)，從而降低生產(chǎn)成本，極度威脅人們的健康。2008年，多家知名乳品企業(yè)的產(chǎn)品被檢出三聚氰胺，很多嬰兒食用問題奶粉后發(fā)現(xiàn)患有腎結石。一時間，如何有效地快速檢測出食品中的三聚氰胺，成為廣大民眾悉心關注的熱點話題，也引起了有關政府部門的高度重視。

圖1　三聚氰胺結構式Fig.1　Chemicalstructure of MEL

目前，三聚氰胺的檢測方法除了兩個國家標準GB/T 22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》和GB/T 22400-2008《原料乳中三聚氰胺快速檢測液相色譜法》，主要還有氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、微流毛細管液相色譜法、毛細管電泳法等，這些方法通常操作繁瑣，檢測成本偏高，且對從復雜基質(zhì)中分離富集痕量的三聚氰胺提出了較高的要求[2-4]。

分子印跡技術（molecular imprinted technique，MIT），是新興的、生物和化學相交叉的一種分離技術手段，常被形象地描繪為制造識別“分子鑰匙”的“人工鎖”的技術。20世紀40年代，諾貝爾獎獲得者Pualing提出的“抗體形成”理論是MIT的理論基礎。后來，Dickey提出“專一性吸附”概念。1972年Wulff小組首次報道了人工合成分子印跡聚合物（moleular imprintedpolymers，MIPs），成為這個領域形成的一個標志。特別是1993年，瑞典的Mosbach在《Nature》上發(fā)表了一篇有關茶堿的分子印跡聚合物的報道后，人們才愈發(fā)關注到分子印跡技術的獨特優(yōu)勢[5]。MIT可通過空間立體作用和結構匹配性，從分子水平上識別和富集目標分子，具有構效預定性、特異識別性和廣泛實用性的特點，當前已經(jīng)被廣泛應用到生物學、有機合成、環(huán)境分析、臨床醫(yī)學、食品工業(yè)、膜分離和仿生傳感器等范疇[6-7]。

1　分子印跡技術的主要原理

分子印跡技術是為了獲得在空間結構和結合位點上與某一目標分子（或稱之模板分子、印跡分子）完全匹配的聚合物的實驗制備技術。分子印跡過程一般包括以下幾個過程：首先在一定的溶劑中含有適當功能基的功能單體與模板分子通過一定的方式結合形成單體-模板分子復合物；然后功能單體在一定引發(fā)條件下，通過交聯(lián)劑的作用形成共聚物，使功能單體上的功能基在空間排列和空間定向上固定下來，由功能單體所衍生的功能殘基則按與模板互補的方式分布在聚合物中；最后通過一定的方式將模板分子從聚合物上洗脫下來。這樣就在高分子共聚物中留下一個與模板分子在空間結構、尺寸大小、結合位點完全匹配，并含有與模板分子專一結合的功能基的三維空穴。這個三維空穴可以選擇性地重新結合模板分子（或是其結構類似分子），具有高度專一的識別作用[5，8-9]。

模板分子和功能單體能否生成穩(wěn)定的復合物，是獲得高親和性和選擇性MIPs的關鍵因素[10]。根據(jù)功能單體與模板分子之間形成復合物時作用方式的不同，分子印跡過程主要分為共價法（預組裝法）、非共價法（自組裝法）及共價與非共價印跡的雜化體系法。

在共價法印跡過程中，功能單體與模板分子間的作用是靠共價鍵連接，形成的復合物很穩(wěn)定，其結合與解離要涉及鍵的形成和斷裂，所以從該復合物中很難去除模板分子，給分離和富集帶來了難度。而非共價法印跡過程，功能單體與模板分子間通過諸如氫鍵、電荷轉(zhuǎn)移、金屬配位、范德華力等非共價鍵連接，模板分子的結合與釋出速度較快，更接近天然的分子識別過程[11]。共價法與非共價法的雜化體系是將共價印跡輪廓清晰、專一結合性強的長處與非共價印跡快速鍵合目標分子的優(yōu)勢相結合[5-6]。

2　分子印跡聚合物的制備方法及應用

目前，制備分子印跡聚合物常用的方法有本體聚合法、沉淀聚合法、原位聚合法、懸浮聚合法、表面印跡法、電聚合法等。分子印跡聚合物不同于其他如酶與底物、抗原與抗體、受體與激素的生物大分子，其獨特優(yōu)勢有[8-9]：（1）MIPs有一定的剛性，其受體作用位點有很強的物理化學抗性，當去除模板分子后，三維空穴結構穩(wěn)定；（2）印跡位點可接近，可通過修飾MIPs的功能基團來提高其親和力和催化能力；（3）MIPs可重復利用；（4）MIPs對酸堿、熱、離子及溶劑環(huán)境的破壞有很強的抵抗力；（5）MIPs的制備過程無需免疫動物，耗時短且產(chǎn)物有均一的親和力和性質(zhì)。

2.1本體聚合法制備MIPs檢測三聚氰胺

本體聚合是目前制備MIPs最傳統(tǒng)也是最常用的方法。它是在密閉環(huán)境中，將模板分子、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑以一定的比例溶解在相應的溶劑中，將制得的聚合物呈塊狀，后經(jīng)粉粹、研磨、篩分成一定粒徑大小的顆粒。這種方法簡單直接，便于普及，但處理過程費時費力，印跡空穴會在后處理過程中遭到破壞，所得聚合物顆粒均勻性不好，包埋過深脫附。

Curcio[12]利用以三聚氰胺為模板分子、甲基丙烯酸（MAA）為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）為交聯(lián)劑、偶氮二異丁腈（AIBN）作為引發(fā)劑，本體聚合法制備分子印跡聚合物來識別部分水相介質(zhì)中的三聚氰胺。發(fā)現(xiàn)制得的材料在不同水相介質(zhì)中分別對三聚氰胺及其結構類似物2，4，6-三甲氧基-1，3，5-三嗪有特異的選擇吸附性能。最后將制得的分子印跡聚合物從一份食品增補劑和一份凍干肉制品中選擇性提取三聚氰胺成分。Zhang[13]分別通過熱引發(fā)、光引發(fā)的方式本體聚合制備三聚氰胺分子印跡聚合物。不同的聚合方式所得MIPs的物理性能參數(shù)存在些許差異。將兩種聚合物均用作吸附材料裝載固相萃取柱，后連接HPLC測定奶粉中的三聚氰胺，加標回收率分別為92.4%～97.7%和94.6%～99.7%。Zeng[14]使用環(huán)丙氨嗪作為一個虛擬模板分子，在甲醇與水10∶1（mL/mL）的混合溶劑中合成非共價鍵的分子印跡聚合物，并將其首次應用到三聚氰胺的分子印跡固相萃取柱上。因為與環(huán)丙氨嗪結構類似，這個水相兼容的分子印跡聚合物表現(xiàn)出高度的交叉反應性和對三聚氰酸的親和性，能選擇性提取三聚氰胺，對飼料和牛奶樣品的水提物做加標回收，并分析是離子交換作用代替氫鍵成為三聚氰胺在此固相萃取柱上保留的主要因素。

2.2沉淀聚合法制備MIPs檢測三聚氰胺

通常利用沉淀聚合法來制備形狀均一的微球狀MIPs。最終生成的MIPs由于不溶于起初的溶劑體系而以微球形式沉淀出來。微球粒徑的大小可通過溶劑的選擇及使用量來調(diào)節(jié)[11]。沉淀聚合常被認為是一種特殊的本體聚合方式[15]。

Nor Azah Yusof[16]以三聚氰胺為模板分子、N-乙烯基咔唑（9VC）為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）為交聯(lián)劑、過氧化苯甲酰為引發(fā)劑，沉淀聚合法制備三聚氰胺MIPs，并通過傅里葉變換紅外分析（FTIR）、熱重量分析（TGA）、掃描電鏡觀察印跡聚合物的特征參數(shù)，并將其應用到固相萃取柱上，后連接超高效液相色譜的方法測定三聚氰胺。此MIPs最大吸附量為53.01 mg/g。Zhang[17]采用沉淀聚合法，以三聚氰胺為模板分子、甲基丙烯酸（MAA）為功能單體、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）為交聯(lián)劑，溶解在乙腈溶劑中。并用含10%乙酸的甲醇溶液連續(xù)提取來釋放模板分子。當交聯(lián)劑添加至7.48 mmol時可生成形貌完好的微球，印跡分子的最大吸附量是68.36μmol/g，在結合識別過程中印跡聚合物對三聚氰胺表現(xiàn)出特異的親和力。結合位點的解離常數(shù)Kd=0.761。牛計偉[18]以三聚氰胺為模板分子，對致孔劑種類、模板分子與功能單體的配比以及交聯(lián)劑的添加量進行優(yōu)化，以最佳條件制得對三聚氰胺有特異性識別能力和有高吸附量的MIPs，并將其作固相萃取吸附劑，連接高效液相色譜測定奶粉中的痕量三聚氰胺。萃取回收率為85.1%～99.7%，方法的加標回收率為89.7%～100.6%，RSD不高于3.1%，與國標GB/T 22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》所用的萃取柱相比，所得印跡復合物萃取柱的凈化富集效果更佳。

2.3原位聚合法制備MIPs檢測三聚氰胺

原位聚合是在色譜柱或是毛細管柱內(nèi)直接聚合生成連續(xù)棒狀MIPs。此過程只需洗滌，無需研磨篩分，簡單直接，但柱效偏低。一般通過原位聚合制成分子印跡整體柱應用于固相萃取柱或是高效液色譜柱，完成樣品的富集、濃縮及分析。

Zhao[19]基于分子印跡整體聚合物加上高效液相色譜體系，報道了一個新的方法同時測定環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺。他以2，4-二氨基-6-十一烷基-三嗪（DAUTA）為虛擬模板分子，甲基丙烯酸（MAA）為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）為交聯(lián)劑、偶氮二異丁腈（AIBN）作為引發(fā)劑原位聚合印跡聚合物。因為DAUTA在氯仿中良好的溶解性，模板分子與功能單體間形成氫鍵作用，致使制得的印跡整體柱內(nèi)生成了高度特異性空穴。在甲醇溶劑的作用下，環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺很好地被保留在印跡整體柱上。用此法來純化和濃縮牛奶樣品中的這兩種物質(zhì)，開發(fā)了連續(xù)的脫附程序?？稍诘挽`敏度的HPLC-UV體系中，對僅有0.3 mL的牛奶樣品完成分析，三聚氰胺和環(huán)丙氨嗪的檢測限分別僅為0.12、0.05μg/mL。李志偉[20]以三聚氰胺做模板分子、甲基丙烯酸（MAA）為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）為交聯(lián)劑、偶氮二異丁腈（AIBN）作為引發(fā)劑，以甲苯及十二醇為致孔劑在色譜柱內(nèi)原位聚合三聚氰胺分子印跡整體柱，以其做固定相，以體積分數(shù)10%甲醇溶液-體積分數(shù)0.1%的乙酸溶液（5∶95，mL/mL）為流動相，在紫外檢測波長240 nm下測定奶制品中三聚氰胺。結果顯示，三聚氰胺的線性范圍是1.0μg/mL～100.0μg/mL，線性相關系數(shù)為0.998 7。加樣回收率為87.0%～100.5%，RSD小于5.0% （n＝6）。張紅武[21]對制備的分子印跡整體柱分別用脈沖洗脫法和前沿色譜法快速篩選三聚氰胺的洗脫劑且測定出整體柱的吸附容量。結果表明，制得的分子印跡整體柱能很強地吸附三聚氰胺。

2.4懸浮聚合法制備MIPs檢測三聚氰胺

這是制備MIPs微球最常用的方法之一。通常采用水或高極性有機溶劑作為連續(xù)相，而高極性的溶劑會干擾模板分子與功能單體間的作用，這時，人們把氟化的表面活性劑及其它含氟的表面活性聚合物作為穩(wěn)定劑，制得穩(wěn)定的溶有功能單體、交聯(lián)劑、模板分子和致孔劑的乳液液滴[22]。

Wang[23]以三聚氰胺做模板分子、甲基丙烯酸（MAA）為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）為交聯(lián)劑、偶氮二異丁腈（AIBN）作為引發(fā)劑，懸浮聚合三聚氰胺MIPs微球，并對其進行表征。實驗證明制得的MIPs微球?qū)θ矍璋氛宫F(xiàn)出高度吸附能力、快速再鍵合動力特性和高度選擇性。通過Scatchard分析表明，在MIPs微球上至少有一種結合位點，它的解離常數(shù)和最大吸附量分別為37.59 g/L、30.85μmol/g。將該MIPs裝載到固相萃取柱上，對牛奶樣品加標回收，證實該提取方法有著良好的精確度和準確度。Li[24]將環(huán)丙氨嗪做虛擬模板分子、甲基丙烯酸（MAA）為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）為交聯(lián)劑、乙腈為致孔劑懸浮聚合三聚氰胺MIPs微球。此MIPs微球在乙腈中表現(xiàn)出對三聚氰胺杰出的親和力，其最大吸附量為53.20 nmol/mg，解離常數(shù)為90.45μmol/L。優(yōu)化分子印跡固相萃取條件，將其與氣相質(zhì)譜結合，建立了一個測定牛奶和飼料中三聚氰胺的新方法。

2.5表面印跡法制備MIPs檢測三聚氰胺

這種方法制得的MIPs顆粒均勻、比表面積較大，且識別位點被建立在載體表面，有利于識別和釋出模板分子，解決了傳統(tǒng)方法將模板分子包埋過深不易洗脫的劣勢，尤其適用于印跡生物大分子。表面印跡法更多采用硅基材質(zhì)如硅膠為基質(zhì)材料，合成表面印跡材料。

Cheng[25]用表面印跡技術在硅膠表面合成分子印跡包覆層實現(xiàn)對三聚氰胺的高度選擇性分離。通過性能測試發(fā)現(xiàn)，表面印跡MIPs不僅對目標分子三聚氰胺有出色的選擇性，還由于它將識別位點合成在硅膠表面的緣故，相比本體聚合法制得的MIPs，展現(xiàn)出了更好的吸附能力。并將此硅膠表面MIPs作為固相萃取柱填料測定牛奶樣品中三聚氰胺含量，樣品的加標回收率在75.6%～96.8%的范圍且RSD低于10%，適于從復雜基質(zhì)中濃縮純化三聚氰胺，且重復使用五次后穩(wěn)定性佳，此固相萃取連接高效液相分析方法再現(xiàn)性理想。Xu[26]則建立了一種新型表面印跡體系，即在聚丙烯纖維表面以三聚氰胺為模板分子、甲基丙烯酸（MAA）為功能單體、乙二醇二縮水甘油醚（EGGE）為交聯(lián)劑制備MIPs。纖維表面MIPs表現(xiàn)出對三聚氰胺高度的親和性且最大吸附量為15.5 mg/g，用Langmuir模型表征了它的吸附等溫線。因為其印跡位點在表面，纖維表面MIPs比傳統(tǒng)方法制成的顆粒MIPs對三聚氰胺吸附有著更好的動力學表現(xiàn)力。并揭示纖維表面印跡材料吸附三聚氰胺是一個羧基與含N基團間靜電作用與氫鍵作用的協(xié)同效應所致。

磁性MIPs可被認為是表面分子印跡在磁性基質(zhì)顆粒（如Fe3O4）上的技術延伸。這種新型含磁性架構的磁性MIPs不僅能特異性識別分子，還有更好的生物兼容性和靶向性，在外加磁場作用下實現(xiàn)定向移動和快速分離[27-29]。

2.6電聚合法制備MIPs檢測三聚氰胺

電聚合法通常用制備的電化學傳感器分子印跡薄膜修飾電極，使合成的聚合物薄膜電極可高度專一地識別目標分子。它將電化學分析與分子印跡技術有機的融合在一起，是新型的高靈敏度傳感器檢測技術[30]。

趙東霞[31]用電聚合法，制備了基于分子印跡聚合膜的電化學傳感器，將它用于測定食品中三聚氰胺。作者以三聚氰胺作模板分子，循環(huán)伏安法在金電極表面與功能單體2-巰基苯并咪唑（2-MBI）發(fā)生電聚合，洗脫模板分子后制得對三聚氰胺分子有專一選擇性的印跡膜傳感器。該電極不受樣品中精氨酸、組氨酸和葡萄糖對測定的干擾，以K3Fe（CN）6為氧化還原探針分子，實現(xiàn)了對三聚氰胺的快速有效檢測。所修飾的電極對三聚氰胺測定的線性范圍為1.0×10-8mol/L～ 5.0×10-5mol/L，檢測限為3.0×10-9mol/L。分析其分子識別的驅(qū)動力為π-π的相互作用。劉雅婷[32]以三聚氰胺為模板分子，通過電位循環(huán)掃描的方式將對氨基苯甲酸（pABA）電聚合到玻碳電極（GCE）上制得對氨基苯甲酸分子印跡聚合物薄膜并對其進行表征。研究優(yōu)化了對氨基苯甲酸分子印跡聚合物性能的幾個重要參數(shù)后，確定了最佳試驗條件，此時鐵氰化物的氧化電流相對變化量與三聚氰胺的濃度呈線性關系，在4.0μmol/L～0.45 mmol/L范圍內(nèi)呈線性相關，線性相關系數(shù)r為0.999 2。檢出限為0.36μmol/L（S/N=3）。并將該傳感器用于液態(tài)奶中三聚氰胺的檢測。傳感器檢測結果的RSD為2.42%～4.38%，回收率為95.6%～ 105.2%，具有較高的選擇性，靈敏度和可重復性。同時作者制備了沒食子酸-鄰苯二胺共聚物修飾的三聚氰胺分子印跡電極，考察分子印跡聚合物與三聚氰胺之間的相互作用，建立了以沒食子酸和鄰苯二胺為混合功能單體的分子印跡傳感器測定三聚氰胺的方法。最佳實驗條件下，三聚氰胺的線性范圍為10.0 nmol/L～ 0.1μmol/L和10.0μmol/L～100.0μmol/L，檢出限為1.6 nmol/L（S/N=3），并將其用于乳制品中三聚氰胺的檢測，傳感器檢測結果的RSD為1.42%～3.38%，回收率為96.7%～110.0%，此混合功能單體共聚物修飾的分子印跡電極響應時間短，使用方便。

3　展望

現(xiàn)如今，食品安全成為了老百姓悉心關注的熱點問題。如何快速準確地檢測出食品中諸如三聚氰胺的非法添加物也是當下的研究重點?；诜肿佑≯E技術獨具的優(yōu)勢，其與相關先進儀器的串聯(lián)使用可顯著提高檢測效率，降低檢測成本。同時，將分子印跡技術與其他學科交叉融合也可大大拓展現(xiàn)有分子印跡方法的應用領域，為日常的檢測工作帶來方便。

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Application of Molecular Imprinting Technology in Melamine Determination

WANG Gui-hua，SUN Jian-ping*
（Tianjin Guifaxiang 18th StreetMuahua Food Co.，LTD.，Tianjin 300221，China）

Melamine is essentially a kind ofchemical industry material.In recentyears，some illegalbusinessmens added itto milk products and feed illegally，endangering person's health.Molecular imprinting technology with its unique advantages had become a research focus in food analysis and detection.The principle of molecular imprinting technique and polymerization methods were introduced，and the determinations through differentmethods for preparation ofmolecularly imprinted polymer were reviewed.

melamine；molecular imprinting；preparation；determination；milk product

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.048

王桂華（1980—），女（漢），助理工程師，學士，研究方向：食品質(zhì)量安全。

2015-10-09