糙海參精子的發(fā)生及超微形態(tài)結構

楊學明，吳明燦，張 立，楊 瓊，潘 英，陳福艷

（1.廣西水產科學研究院海水養(yǎng)殖研究室，廣西南寧 530021；2.廣西大學 動物科學技術學院，廣西 南寧 530004）

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糙海參精子的發(fā)生及超微形態(tài)結構

楊學明1，吳明燦2，張 立1，楊 瓊1，潘 英2，陳福艷1

（1.廣西水產科學研究院海水養(yǎng)殖研究室，廣西南寧 530021；2.廣西大學 動物科學技術學院，廣西 南寧 530004）

為了解糙海參（Holothuria scabra）精子發(fā)生的過程及其形態(tài)結構，作者于2013年11月～2014年4月每月采集2頭海南島的野生雄性糙海參，取精巢組織固定后分別制作投射電鏡、掃描電鏡切片和石蠟包埋切片，在電鏡和光鏡下連續(xù)觀察。觀察結果表明，糙海參精子發(fā)生經(jīng)歷了精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精細胞和成熟精子5個階段。精細胞分化過程可分為3個時期，早期：細胞核前端出現(xiàn)前頂體囊；中期：頂體腔內出現(xiàn)圍頂體物質；后期：胞質往尾部方向收縮，形成精子中部。糙海參成熟精子全長約60 μm，由頭部、中部和尾部3部分組成，為典型的鞭毛型精子。精子頭部呈球形，精子核中頂體形態(tài)為“U”型內陷囊狀體，圍頂體物質呈“月牙”形，核染色質凝集成團塊狀。精子中部由一個巨大的線粒體和中心粒復合體融合而成。精子尾部鞭毛橫切面為典型的“9+2”微管結構。本研究可為糙海參的繁殖生物學和人工育苗提供理論參考。

糙海參（Holothuria scabra）；精子發(fā)生；形態(tài)；超微結構

doi：10.11759//hykx20141219001

糙海參（Holothuria scabra）屬棘皮動物門（Echinodermata），海參綱（Holothuroidea），楯手目（Aspidochirotida），海參科（Holothuriidae），海參屬（Holothuria），兩廣地區(qū)稱為“白參”。糙海參屬熱帶-亞熱帶種，在國外廣泛分布于印度-西太平洋海域，在中國主要分布在海南島、西沙群島和廣東中、西部至北部灣較淺的海域［1-2］；糙海參肉厚且肉質軟嫩，具有較高的商業(yè)價值，是全球40余種可食用海參中較重要的經(jīng)濟海參之一。國外早已開發(fā)了該種類的人工育苗和增養(yǎng)殖技術［3］；近年來國內已開展了海南糙海參人工育苗的相關研究，初步掌握了人工育苗技術并且獲得了批量化參苗［4-5］，糙海參有望成為華南沿海新興的海水養(yǎng)殖種類。

動物精子發(fā)生過程與其形態(tài)結構是發(fā)育生物學的重要研究內容之一，也是繁殖生物學的基礎。葉素蘭等［6］認為精子形態(tài)結構的差異不僅是動物分類的依據(jù)，也是分析不同動物類群之間親緣關系的重要依據(jù)。目前國外學者［7-12］對海參綱物種精子超微結構的研究報道較多，國內僅見對仿刺參（Apostichopusjaponicus）［13-14］和 白 肛 海 地 瓜（Acaudina leucoprocta）［15］的精子發(fā)生及其超微結構做了詳細觀察。目前關于糙海參的精子發(fā)生及其超微結構的研究還未見報道。作者通過電鏡及光鏡對糙海參精子發(fā)生及其超微結構進行了觀察和研究，旨在豐富其繁殖生物學資料，為人工繁殖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用雄性野生糙海參，于2013年11月～2014 年4月采自海南省陵水縣新村港（18°22′N～18°47′N，109°45′E～110°08′E）的暫養(yǎng)圍網(wǎng)中。每次采樣時從圍網(wǎng)海底隨機撈取糙海參10頭，活體稱質量、解剖，根據(jù)性腺顏色辨別雌雄（雄性為乳白色，雌性為橙紅色）。隨機取2只雄性個體，用尖嘴鑷摘取精巢組織各1～2 g，立即用3%戊二醛溶液固定，4℃保存，用于制作電鏡樣品；把其余精巢放入Bouin氏液中固定，常溫保存，用于制作光鏡切片，然后分別送廣西醫(yī)科大學電鏡室及醫(yī)學實驗中心制樣。試驗糙海參數(shù)量及規(guī)格見表1。

表1 不同月份采集的雄性糙海參樣本規(guī)格及采樣點水質指標Tab.1 Male Holothuria scabra samples collected at different times and the water quality index at the sampling location

1.2 方法

1.2.1 透射電鏡(TEM)樣品的制備及觀察

將用3%戊二醛4℃固定過夜的樣品，切成1 mm× 2 mm 的長條小塊，用0.1 mol/L磷酸緩沖液充分漂洗3次（每次15 min），再用1%鋨酸固定1.5 h，固定后的組織經(jīng)磷酸緩沖液漂洗后，用乙醇-丙酮逐級脫水，Epon618環(huán)氧樹脂滲透并包埋，接著進行35、45、60℃下聚合，使用徠卡UC7超薄切片機切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，在日立H-7650透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2 掃描電鏡(SEM)樣品的制備及觀察

樣品用3%的戊二醛在4℃下固定2 h后，用0.1 mol/L磷酸緩沖液充分漂洗3次（每次15 min），分別用50%、70%、80%、90%、100%濃度的乙醇梯度脫水，接著用六甲基二硅胺烷置換3次（每次10 min），IB3離子濺射儀噴金鍍膜，最后在捷克TESCAN公司VEGA 3 LMU型掃描電鏡下觀察拍照。

1.2.3 光鏡樣品的制備及觀察

精巢在Bouin氏液中固定24 h后，取出精巢切成厚約0.5 cm的小塊，常規(guī)石蠟包埋，切片厚7 μm，H.E染色，Motic BA410顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.1 精原細胞

在透射及掃描電鏡下，精原細胞緊靠基膜，呈不規(guī)則形或橢圓形（圖1，圖2），長直徑7.8～8.0 μm，短直徑5.2～7.8 μm。細胞緊密排列，細胞質較少，只有隨機分布的少量線粒體；線粒體為圓形，其嵴很少；此時出現(xiàn)一些電子密度較高的物質；細胞核位于細胞中央，呈橢圓形，長直徑5.6～5.8 μm，短直徑3.8～4.8 μm，核膜清晰，核周腔較明顯，染色質較少，附在核內膜或者不均勻地呈絮狀分布在核質中（圖1-1，圖1-2，圖2-1，圖2-2）。

2.2 精母細胞

2.2.1 初級精母細胞

初級精母細胞由精原細胞經(jīng)過有絲分裂轉化而來，位于精原細胞內側，呈橢圓形，大小和精原細胞相當。在其胞質一側分布有許多線粒體，體積不斷增大，數(shù)量變多，嵴漸增多；高爾基體發(fā)育良好，其周圍有許多高爾基小泡；由一層膜包裹的致密小顆粒變多；細胞核位于線粒體集團的對面，一邊靠近褶皺的細胞膜，長直徑5.0～5.7 μm，短直徑2.5～4.3 μm；核內染色質進一步增多，電子密度變大；核周腔明顯，核周腔外膜擴大為不規(guī)則的核膜泡；整個細胞具有一定的極性（圖1-1，圖1-2，圖1-3）。

2.2.2 次級精母細胞

次級精母細胞由初級精母細胞經(jīng)過減數(shù)分裂而成。此期明顯的特征是靠近線粒體集團一端的胞質出現(xiàn)突起（“尾巴”）。次級精母細胞呈卵圓形，長直徑2.6～3.0 μm，短直徑2.6～2.4 μm；細胞核亦呈卵圓形，長直徑2.0～2.2 μm，短直徑1.8～2.0 μm，核內膜明顯，核膜內的染色質增多；線粒體進一步融合，高爾基體和內質網(wǎng)少，電子致密顆粒變大；這時期觀察到“三聯(lián)體”現(xiàn)象，即3個次級精母細胞的胞質未分開而細胞核已分開的現(xiàn)象（圖1-4，圖1-5，圖1-6，圖1-7）。隨著次級精母細胞發(fā)育進行，突起的尾巴邊長（圖2-3，圖2-4）。

圖2 糙海參精子發(fā)生及形態(tài)的超微結構（掃描電鏡）Fig.2 Scanning electron micrographs of spermatogenesis and sperm morphology in sea cucumber，Holothuria scabra2-1，2-2，2-3，2-4.精子發(fā)生的不同階段：Bm.基膜，Sg.精原細胞；Ps.初級精母細胞；Ss.次級精母細胞；S.精子；F.尾部；（余同圖）；2-5.精細胞分化早期：Ac.頂體，H.頭部，Mp.中部；2-6.成熟精子：Ac.頂體2-1，2-2，2-3，and 2-4.different stages of spermatogenesis：Bm.basement membrane，Sg.spermatogonia，Ps.primary spermatocytes，Ss.secondary spermatocyte，S.spermatozoon；F.flagellum（same below）：2-5.early spermatid：Ac.acrosome，H.head，Mp.mid-piece；2-6.spermatozoon：Ac.acrosome

2.3 精細胞分化

精細胞由次級精母細胞第二次減數(shù)分裂形成，體積進一步縮小。根據(jù)細胞形狀、細胞器變化、核染色質凝集程度，可分成3個時期：

2.3.1 早期

細胞進一步縮小，呈梨型。長直徑2.7～2.8 μm，短直徑2.3～2.4 μm；細胞核在細胞前端，核長直徑1.8～2.0 μm，短直徑1.5～1.7 μm；其前面出現(xiàn)呈“U”型的前頂體囊，內含大量電子密度較小的泡狀顆粒；核內充滿顆粒狀的染色質；線粒體往細胞中部的中心粒復合體方向移動，進一步融合形成兩個大型線粒體，周圍有高爾基體消失后留下的空泡，高密度顆粒消失，出現(xiàn)核后窩；尾部變長，直徑約0.25 μm（圖1-8，圖1-9，圖2-5）。

2.3.2 中期

細胞形狀不變，細胞核呈扁圓形，核染色質繼續(xù)凝集。頂體腔中出現(xiàn)圍頂體物質（也稱亞頂體腔）；剩余的胞質進一步往尾部方向收縮；兩個大型線粒體高度發(fā)達，其嵴數(shù)量多，環(huán)繞在中心粒復合體周圍（圖1-10）。

2.3.3 后期

精細胞已經(jīng)分化為成熟的精子。核染色質高度濃縮，成為精子的頭部，剩余胞質進一步往尾部收縮，兩個大型線粒體融合成一個線粒體環(huán)，形成精子的中部；尾部鞭毛最長（圖1-11，圖1-12，圖1-13，圖2-1，圖2-6，圖3）。

2.4 精子結構

2.4.1 掃描電鏡觀察

糙海參精子為鞭毛型，全長約60 μm，可分為3段：頭部、中部和尾部。精子頭部呈扁球形，橫軸長約1.8 μm、縱軸長約1.4 μm。頭部后端為中部，形態(tài)和細胞核類似，長軸1.2 μm，短軸0.6 μm。尾部鞭毛粗細均勻，直徑約為0.3 μm（圖2-6）。

2.4.2 透射電鏡觀察

2.4.2.1 頭部

精子頭部和精細胞分化中期的發(fā)育狀態(tài)一樣，主要包括質膜、頂體、圍頂體物質和細胞核。質膜是一層褶皺、波浪形的薄膜，包裹細胞核上半部分；頂體位于精子的前端。從精子縱切面的方向可以看到頂體陷在細胞核內，呈“U”型結構，電子密度基本相同，頂體前段為突起的乳頭狀，長度為細胞核縱軸長的1/3；圍頂體物質是頂體和細胞核之間一層電子密度較頂體大的物質，越陷向細胞核里面，體積越大，呈“月牙”形；細胞核中出現(xiàn)一個小核泡（圖1-10）。

2.4.2.2 中部

糙海參精子的中部位于頭部與尾部之間，由線粒體和中心粒復合體組成。從橫切面看，可以觀察到一個線粒體圍繞在中心粒復合體周圍；從縱切面看，中心粒復合體由近端中心粒和遠端中心粒相互垂直排列組成。近端中心粒為中空的短圓筒狀結構，由9組三聯(lián)微管排列而成，為“9+0”結構，與細胞核長軸垂直，直徑約0.3 μm。遠端中心粒長度約0.2 μm，偏離中心線延伸出精子的軸絲（圖1-11，圖1-12）。

2.4.2.3 尾部

尾部為精子的運動器官。從橫切面看尾部呈圓形，平均直徑為0.25 μm，外包一層較薄的質膜，內有9對環(huán)軸絲，中間有雙微管，是典型的“9+2”型鞭毛結構（圖1-13）。

以上結果可知，糙海參精子發(fā)生經(jīng)歷了精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精細胞，最終形成成熟精子（圖2-1，圖3）。

3 討論

3.1 糙海參與海參綱其他種類精子結構的比較

精子的形態(tài)主要取決于精子頭部頂體、細胞核的形態(tài)以及圍頂體物質和核后窩結構等。在已報道的文獻中，海參頂體的形態(tài)主要有3種類型：（1）圓球形，如仿刺參、白肛海地瓜［13-15］；（2）圓柱形，如盧氏瓜參（Cucumaria lubrica）［7］；（3）片狀，裴氏瓜參（Cucumaria pseudocurata）［9］。糙海參精子頂體為“U”字型囊狀體，內陷在精子核前端，具有乳頭狀突起，里面含有密度均勻的頂體顆粒物，形態(tài)屬于圓球形。有文獻報道，一些海參精子頂體前端由一層頂體顆粒膜包裹，如紐細錨參（Leptosynapta clarki）［8］和賈氏光參（Cucumaria japonica）［11］，偶爾有側邊消失現(xiàn)象。本研究未觀察到糙海參精子頂體顆粒膜缺失的現(xiàn)象。

圖3 糙海參精子發(fā)生的顯微結構Fig.3 Light microscopic photographs of spermatogenesis in sea cucumber，Holothuria scabra生殖管縱切：Bm.基膜；Sg.精原細胞；Ps.初級精母細胞；Ss.次級精母細胞；S.精子；F.尾巴Longitudinal section of male gonad：Bm.basement membrane；Sg.spermatogonia；Ps.spermatocytes；Ss.secondary spermatocytes；S.spermatozoon；F.flagellum

Tyurin等［12］認為在不同種類海參中，頂體的大小、結構不同，頂體內的物質分布也不同。糙海參精子的頂體密度均勻，圍頂體物質電子密度高于頂體，但低于頂體顆粒膜，與白肛海地瓜［15］一樣具有相同的間隔描述。糙海參與紐細錨參［8］的精子頂體一樣，電子密度呈同心圓排列；但與斯氏海參（Roweia stephensoni）、黑赤星海參（Holothuria cinerascens）［11］等種類的精子頂體中心的電子密度大于周圍電子密度，沒有同心圓排列的狀況有差異。

糙海參精核內物質高度致密，且分布均勻，為球形，偶爾在個別精子中發(fā)現(xiàn)大小不等的核泡結構，但一個精子始終只有一個核泡。在海參綱的其他物種中，白肛海地瓜［15］、紐細錨參［8］和仿刺參［13-14］也有明顯的核泡結構。軟體動物如泥蚶（Tegillarca granosa）［16］、大珠母貝（Pinctada maxima）［17］、櫛孔扇貝（Chlamys farreri）［18］和皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai）［19］等也常見這樣的核泡。另外，糙海參的精子和白肛海地瓜［15］一樣都有核后窩，無核前窩。Popham［20］認為，核前窩的出現(xiàn)可能與頂體軸棒的出現(xiàn)有關，核后窩的發(fā)生與遠端中心粒衛(wèi)星體的出現(xiàn)有關。吳瑩瑩［21］認為，核后窩在精子運動中起到關節(jié)窩的作用，可降低精子尾部運動時對頭部的沖擊。

線粒體是精子運動的能量供應中心，其內膜、嵴分布有許多酶系和運轉載體，在能量轉換中起主要作用。精子尾部的擺動就是依靠線粒體提供的能量。糙海參精子中部由一個大型線粒體和中心粒復合體（含近端與遠端中心粒）構成。線粒體環(huán)繞中心粒復合體，這與白肛海地瓜［15］、艾氏光參（Cucumaria miniata）［10］的結構有所不同，而與仿刺參［13-14］精子中部結構類似。因此竺俊全等［22］認為精子中段線粒體的數(shù)目及排列方式是區(qū)別種、屬的特征之一。比較不同種類海參精子線粒體，可以為分類提供一些重要依據(jù)。

從遠端中心粒長出的軸絲不斷向外延伸，形成了精子的尾部。尾部是精子游動的器官。糙海參精子尾部橫切面為典型的“9+2”結構，一般情況下，內有2條軸絲，各由一層質膜包裹；龐震國等［13-14］發(fā)現(xiàn)仿刺參精子尾部也為“9+2”結構，但具有軸絲共質膜現(xiàn)象，即2條或多條軸絲共有一層質膜。而Atwood等［9］報道裴氏瓜參精子尾部內有3條軸絲，為“9+3”結構。

3.2 胞質細胞器在糙海參精子頂體形成過程中的作用

頂體是凹陷于精子頭部的囊狀細胞器，在保證受精時精子與卵的特異性結合及精子入卵中起著重要作用。因此，精子頂體歷來是生殖學研究的熱點。在水產動物精子頂體形成機理的研究中，有多種不同的觀點，學術界對此還沒有統(tǒng)一的認識。頂體形成大致有兩種途徑：一種是高爾基體形成頂體，如軟體動物瓣鰓類的如青蛤（Cyclina sinensis）［23］、菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）［24］和腹足類的臺灣東風 螺 （Babylonia formosae）［25］、 泥 螺 （Bullacta exarata）［26］等均有觀察到高爾基體囊泡形成頂體的現(xiàn)象，即高爾基體分泌的嗜鋨液泡或囊泡（前頂體顆粒）逐漸形成前頂體囊，且不斷融合遷移到細胞核的前端，最終形成精子頂體。另外一種途徑是由高爾基體、溶酶體、線粒體等細胞器形成的復合體聚集形成頂體，如甲殼動物日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）［27］。本試驗在透射電鏡下觀察到，糙海參從精原細胞開始有密度很高的復合體，這些高密度顆粒分散在胞質中，沒有觀察到像仿刺參［13-14］那樣有一個典型、明顯的前頂體顆粒。當精子發(fā)生到精細胞分化早期階段，在胞質中已經(jīng)看不到這些高密度顆粒，而此時出現(xiàn)前頂體囊，由此推斷這些高密度顆粒的出現(xiàn)和消失極可能與頂體的形成有關。在糙海參初級精母細胞中，觀察到大量的線粒體和典型的高爾基體，到次級精母細胞時，胞質中只有線粒體和少量的高爾基體。高爾基體沒有內質網(wǎng)提供的物質來源，不可能合成前頂體顆粒，所以作者認為，這些高密度顆粒可能是在精母細胞期就已合成好了，后期逐步移動、融合，與高爾基體和線粒體等細胞器一起參與糙海參精子頂體的形成，屬于第二種途徑。當然，精子頂體的形成是一個復雜的過程，對于糙海參精子頂體的形成機理，還需要進一步深入研究。

致謝：感謝廣西大學實驗助理李健、研究生楊磊提供顯微鏡拍照幫助。

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（本文編輯：譚雪靜）

Spermatogenesis and sperm morphology of sea cucumber, Holothuria scabra

YANG Xue-ming1,WU Ming-can2,ZHANG Li1,YANG Qiong1,PAN Ying2, CHEN Fu-yan1

（1.Mariculture Lab of Guangxi Academy of Fishery Sciences，Nanning 530021，China；2.College of Animal Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530004，China）

Dec.19，2014

Holothuria scabra；spermatogenesis；morphology；ultrastructure

The wild sea cucumber，Holothuria scabra，was sampled monthly at Hainan Island from November 2014 to April 2015 to understand spermatogenesis and sperm ultrastructure.The testis were removed and fixed in situ to prepare histological sections.The sections were observed under a scanning electron microscope，a transmission electron microscope，and a light microscope.The results showed that spermatogenesis in H.scabra included five stages of spermatogonium，primary spermatocyte，secondary spermatocyte，spermatid and spermatozoon.Differentiation of spermatids was subdivided into three stages of early spermatid（formation of the proacrosomal vesicle at the front of the nucleus），mid-spermatid（periacrosomal material in the acrosomal cavity），late spermatid（cytoplasm shrinking and formation of flagellum）and spermatozoon.The mature spermatozoon was flagellated，approximately 60 μm long，and consisted of a head，mid-piece and tail.The head was spherical，and the acrosome was a U-shaped cystid.The periacrosomal material space was crescent shaped，and the chromatin in the acrosome was condensed into a nucleus.Large mitochondria and the centriole complex were located in the mid-piece of the spermatozoon，and the flagellum in the tail had the typical“9+ 2”microtubular structure.These results will provide a theoretical reference for reproductive biology and artificial breeding of the sea cucumber.

Q248

A

1000-3096（2016）05-0049-08

2014-12-19；

2015-05-05

國家自然科學基金資助項目（31260636）；廣西自治區(qū)直屬公益性科研院所資助項目（GXIF-2014-008）

［Foundation：National Natural Science Foundation of China，No.31260636；The public welfare scientific research projects directly under Guangxi municipality，GXIF-2014-008］

楊學明（1969-），四川人，副研究員，博士，從事熱帶海參種質遺傳研究，電話：13878831412，E-mail：nnyxming@126.com