刺參4個不同選育品系幼參對低鹽脅迫的耐受及生理生化響應(yīng)

侯西坦，廖梅杰，李 彬，王印庚，張 正，陳貴平，榮小軍，孫金生，范瑞用

（1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，山東 青島 266071；3.青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司，山東 青島 266408）

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刺參4個不同選育品系幼參對低鹽脅迫的耐受及生理生化響應(yīng)

侯西坦1，2，廖梅杰2，李 彬2，王印庚2，張 正2，陳貴平2，榮小軍2，孫金生1，范瑞用3

（1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，山東 青島 266071；3.青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司，山東 青島 266408）

由于黃河口區(qū)域鹽度偏低且不穩(wěn)定，刺參（Apostichopus japonicus）的生長和存活受到嚴(yán)重威脅。為評估4個不同品系（日本刺參F2代RC-F2、抗病刺參F3代KC-F3、多刺刺參F2代DC-F2、青青刺參F1代QQ-F1）的低鹽耐受力及其生理生化響應(yīng)，本實驗以青島野生群體（QW）為對照，通過測定低鹽脅迫下幼參的生長、存活以及非特異性免疫酶活力變化，評價了4個刺參不同選育品系對低鹽的耐受狀況。結(jié)果表明，在鹽度17以下，除了QQ-F1表現(xiàn)為正生長，其他群體均為負(fù)生長。RC-F2、KC-F3、DC-F2、QQ-F1和QW的30天半致死鹽度（LS50-30d）分別為15.02、15.19、16.48、14.26和15.13，QQ-F1顯著低于其他4個群體；鹽度14時，5個群體的半致死時間（ST50）分別為19.84 d、18.43 d、10.11 d、23.54 d 和19.01 d，QQ-F1的ST50顯著長于其他4個群體。在低鹽脅迫時QQ-F1的ACP、AKP、SOD、LZM酶指標(biāo)的下降幅度顯著低于其他4個群體。不同選育群體的低鹽耐受力排序為QQ-F1＞RC-F2＞QW＞KC-F3＞DC-F2，QQ-F1群體表現(xiàn)出良好的低鹽耐受能力，在低鹽度海域或鹽度不穩(wěn)定的海域具有良好的推廣應(yīng)用前景。本實驗研究結(jié)果可為刺參健康養(yǎng)殖、良種性狀評價、選育與推廣等方面提供參考依據(jù)。

刺參（Apostichopus japonicus）；低鹽脅迫；特定生長率；半致死鹽度；半致死時間；非特異性免疫酶

doi：10.11759/hykx 20151030001

刺參，又名仿刺參（Apostichopus japonicus），隸屬 于 棘 皮 動 物 門 （Echinodermata）、 海 參 綱（Holothuroidea）、楯手目（Aspidochirota）、刺參科（Stichopodidae）、仿刺參屬（Apostichopus）［1］，因其具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值而位列“海產(chǎn)八珍”之首。自20世紀(jì)80年代刺參苗種繁育技術(shù)突破以后，刺參增養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，形成了一個以山東、遼寧、河北沿海為主產(chǎn)區(qū)、并以“北參南養(yǎng)”、“東參西養(yǎng)”等模式延伸到閩、浙沿海和黃河口地區(qū)的刺參增養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)群［2］，已形成年產(chǎn)量19.37萬t、養(yǎng)殖面積達21萬ha，產(chǎn)值愈200億元的刺參增養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)［3］。然而，隨著產(chǎn)業(yè)規(guī)模的急劇擴大，養(yǎng)殖刺參出現(xiàn)了生長緩慢、抗逆能力下降等種質(zhì)退化現(xiàn)象，亟需開展具有生長、抗病、耐低鹽等優(yōu)良性狀良種的選育工作。

鹽度不僅是海水最重要的理化特性，也是影響刺參生長發(fā)育的重要因素之一，許多海洋生物的呼吸排泄、能量收支都與海水鹽度有著密切的聯(lián)系［4-6］。一般情況下，刺參對鹽度的耐受范圍是22～36［7］；其最適鹽度為28～34［8］。由于缺少滲透壓調(diào)節(jié)器官， 棘皮動物被認(rèn)為是狹鹽性動物［1，9-10］。然而，最近的研究表明，許多動物可以通過調(diào)節(jié)體腔液的體積以及細(xì)胞內(nèi)的滲透壓平衡能夠適應(yīng)很寬的鹽度范圍［11-13］。趙斌等［14］對比低鹽脅迫下3種不同規(guī)格刺參生長的差異，發(fā)現(xiàn)鹽度20時，3種規(guī)格刺參特定生長率均為負(fù)值，刺參表現(xiàn)為負(fù)增長。胡煒等［15］發(fā)現(xiàn)當(dāng)鹽度降至22時體質(zhì)量增長變緩，趨于停滯，但仍能維持正常的生理活動，個體死亡率為15%～20%。呂偉志等［16］認(rèn)為刺參能夠在鹽度16的海水下生存30 d；雨季來臨時，只要海水鹽度不低于16，時間不超過一個月的池塘均可養(yǎng)殖海參。肖培華等［17］采用鹽度驟降的模式，研究發(fā)現(xiàn)體質(zhì)量在5 g以上的刺參，96 h內(nèi)所能夠承受的最低鹽度為18。綜上所述，本實驗選取鹽度18作為刺參低鹽脅迫的起始鹽度。鹽度的變化模式一般分為鹽度緩降和鹽度驟降兩種。胡煒等［15］采用逐步降低鹽度（Salinity decreased gradually，DG）和鹽度驟降（Salinity decreased sharply，DS）兩種模式進行鹽度脅迫實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽度22和鹽度18的DG和DS實驗組刺參在成活率方面均出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），鹽度18時DS組刺參成活率最低，僅為45.67%。Hu等［18］通過對比鹽度驟降和鹽度緩降兩種模式，發(fā)現(xiàn)采用鹽度驟降模式，導(dǎo)致刺參僅能適應(yīng)很窄的鹽度范圍，然而采用鹽度緩降的模式，刺參可以適應(yīng)更廣的鹽度范圍。鑒于鹽度驟降會導(dǎo)致刺參產(chǎn)生強烈的應(yīng)激反應(yīng)致使我們無法區(qū)分刺參苗種死亡是鹽度本身還是降低鹽度的過程引發(fā)的，因此本實驗采用梯度降鹽（鹽度緩降）這一模式進行低鹽脅迫實驗，以期更客觀地反映不同選育群體的刺參低鹽耐受極限。

自2005年起，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所圍繞刺參開展良種選育相關(guān)研究，引入日本及中國沿海10余個不同地理種群優(yōu)質(zhì)刺參資源，構(gòu)建了刺參親本庫，以刺型、耐高溫、抗?fàn)N爛弧菌等為目標(biāo)開展優(yōu)良苗種培育，目前已培育出日本刺參F2代、抗病刺參F3代、多刺刺參F2代和青青刺參F1 代4個不同刺參群體。其中抗病刺參是以抗?fàn)N爛弧菌為選育目標(biāo)選育而來，而燦爛弧菌是刺參“腐皮綜合征”的主要致病菌，可以導(dǎo)致刺參大批量化皮死亡，使刺參養(yǎng)殖業(yè)蒙受重大損失［19-21］。多刺刺參主要特征為刺列數(shù)為6排，刺總數(shù)≥45個。青青刺參主要特征為表皮呈青綠色，棘刺粗大且呈桔黃色。隨著刺參育種工作的不斷推進，對選育進程中不同世代的性狀進行評定是良種選育的重要研究內(nèi)容。隨著海參產(chǎn)業(yè)規(guī)模的擴大，黃河口也形成了較大規(guī)模的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶；然而，這一地區(qū)海域存在河口排洪強度大、鹽度低等特點，低鹽度給海參健康養(yǎng)殖造成了巨大威脅和經(jīng)濟損失。因此，耐低鹽刺參的培育對保障這些海域進行刺參健康養(yǎng)殖具有重要的現(xiàn)實意義。本文以未經(jīng)選育的野生刺參苗種為對照，測定低鹽脅迫條件下不同刺參品系生長、存活和非特異性免疫酶活力的差異，對不同選育品系對低鹽耐受力進行評價，以期為刺參健康養(yǎng)殖、良種性狀評價、選育與推廣等方面提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗選用4個刺參不同選育品系，選育背景分別為：日本刺參F2代（RC-F2）是從日本引入的野生刺參群體自交獲得的F2代群體；抗病刺參F3代（KC-F3）是以抗?fàn)N爛弧菌侵染為選育目標(biāo)，以日本青刺參、煙臺野生刺參和青島野生刺參3個基礎(chǔ)群體，經(jīng)抗逆馴化后存活的個體為親本培育的F3代；多刺刺參F2代（DC-F2）是以棘刺數(shù)量為選育目標(biāo)，從青島野生刺參中選取棘刺總數(shù)≥45的個體為親本所培育的F2代苗種；青青刺參F1代（QQ-F1）是以青島野生刺參中選取表皮青綠色、棘刺桔黃色的個體為親本所培育的F1代；以未經(jīng)選育的青島野生刺參（QW）苗種為對照組，詳見表1。實驗所用刺參均取自青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司，5個群體平均體質(zhì)量分別為5.08 g±0.74g（RC-F2）、5.22 g±0.58g（KC-F3）、5.07 g± 0.53g（DC-F2）、5.14 g±0.65g（QQ-F1）和4.93 g±0.51g（QW），參齡均為6個月。

表1 本實驗所用刺參不同品系的親本來源和性狀Tab.1 Source and characteristics of the parents of the 5 different A.japonicus populations used in this study

1.2 實驗方法

1.2.1 刺參苗種的暫養(yǎng)

取4個刺參不同選育品系和野生刺參苗種各700頭在水族實驗車間暫養(yǎng)7d，暫養(yǎng)條件為水溫18.05℃± 0.13℃，鹽度31.43±0.1，溶氧7.08 mg/L±0.04 mg/L，pH 8.08±0.05。暫養(yǎng)所用容器為400 L的白色塑料水槽（100 cm×60 cm×60 cm）。暫養(yǎng)期間每天按時投喂、換水和吸底清污。

1.2.2 實驗分組

低鹽脅迫共分6個鹽度組，鹽度設(shè)置分別為：13、14、15、16、17、18，以自然海水鹽度組（31.00±0.53）作為對照組，每組設(shè)3個平行，每個平行水槽中放養(yǎng)30頭刺參，低鹽脅迫所用養(yǎng)殖水槽為容積為40 L的白色塑料水槽（45 cm×30 cm×30 cm）。

1.2.3 實驗操作與管理

實驗期間水源為砂濾的自然海水，海水鹽度為31.00±0.53，實驗所用不同鹽度海水為砂濾后的海水中添加自來水調(diào)配，鹽度用YSI 550水質(zhì)測量儀測定。

實驗時間為2014年9月8日至2014年11月1日，實驗周期為54 d。實驗期間水溫16.53℃±1.41℃，溶氧7.01 mg/L±0.18 mg/L，pH 8.14±0.11。本實驗采用梯度降低鹽度的方法：鹽度為31～21，每天降低1個鹽度；鹽度為20～13，每2 d降低1個鹽度，兩個過程共24 d，整個馴化期間均無刺參死亡。以鹽度降至相應(yīng)低鹽脅迫鹽度時為相應(yīng)脅迫試驗起始點，對試驗用刺參分組并稱重記為試驗初始體質(zhì)量，低鹽脅迫試驗周期為30 d。

實驗期間正常投喂，每日投喂1次，每天采用虹吸的方法吸底清污并且換水，日換水量為總水量的1/3左右。每天觀察刺參吐腸、化皮頭數(shù)和刺參苗種的生理狀態(tài)，并記錄養(yǎng)殖用水的鹽度、溫度、溶氧和pH等水質(zhì)指標(biāo)。

1.3 低鹽脅迫下各品系刺參特定生長率的測定

脅迫期間每15 d稱一次體質(zhì)量，刺參體質(zhì)量測量方法參考王印庚等［22］。鑒于鹽度13組5個群體刺參在30 d內(nèi)出現(xiàn)大規(guī)模死亡，僅QQ-F1有少量存活，本實驗采用15 d時刺參苗種的平均體質(zhì)量為評價指標(biāo)。利用特定生長率 RSG（Specific Growth Rate）衡量刺參生長情況，特定生長率的計算公式為：

式中，Wt為最終體質(zhì)量，W0為初始體質(zhì)量，t為養(yǎng)殖天數(shù)。

1.4 低鹽脅迫下各品系刺參存活率的測定

鑒于刺參死亡標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一，且死亡個體在養(yǎng)殖水體中對養(yǎng)殖水體污染過重，本實驗以吐腸率和化皮率為判定依據(jù)，對刺參死亡的定義為：在實驗條件下，出現(xiàn)吐腸或化皮，且失去正常吸附能力的個體，視為刺參死亡個體。在飼養(yǎng)期間每天觀察和記錄刺參吐腸和化皮頭數(shù)，并及時將其撈出。各刺參群體存活率從進入相應(yīng)低鹽脅迫第1天開始統(tǒng)計。為衡量刺參對低鹽的耐受限度，本實驗選取3個耐鹽評價指標(biāo)，即 30 d半致死鹽度（Median lethal salinity-30d，LS50-30d）、低鹽度下的開始死亡時間（Time of beginning death，TBD）和半致死時間（Median survival time，ST50）［23-25］。本實驗采用線性回歸法求得LS50-30d、TBD和ST50［26］，公式為：Y=+b（X-），公式中因變量Y為鹽度或時間，變量X為死亡率，為實驗組鹽度或時間的平均值，為實驗組死亡率的平均值，b為系數(shù)，

1.5 低鹽脅迫下各品系刺參非特異性免疫酶活的測定

為判斷低鹽脅迫下刺參免疫活力的變化，實驗選取刺參體腔液堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）、酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和溶菌酶（Lysozyme，LZM）為刺參非特異性免疫酶指標(biāo)。樣品采集時間為上述低鹽脅迫試驗中進入低鹽脅迫第2天抽取刺參苗種的體腔液。同時為了更客觀地反映鹽度下降過程中免疫酶指標(biāo)的變化，增加了鹽度為31、27、24、21時各群體樣本，樣品采集時間為馴化階段進入相應(yīng)鹽度第2天降低鹽度之前。體腔液抽取方法為：沿刺參腹部剪開，抽取體腔液，然后4℃，4 000 r/min離心10 min，取上清液用于非特異性免疫酶活測定。各酶活力的測定均使用南京建成生物工程研究所的試劑盒，測定方法及酶活計算公式參照試劑盒說明書。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)用Excel 2010進行繪圖分析，用SPSS 17.0軟件進行單因子方差分析，設(shè)顯著水平為P＜0.05，極顯著水平為P＜0.01，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。

2 結(jié)果

2.1 低鹽脅迫對刺參不同選育品系存活的影響

低鹽脅迫下對刺參不同選育品系存活的影響如圖1所示。按照試驗結(jié)束時各群體的存活率作為衡量指標(biāo)，在低鹽脅迫時，鹽度越低各群體的存活率也逐步下降，但不同選育品系在各鹽度低鹽脅迫時存活率的變化趨勢存在較顯著的差異。在鹽度17以上時，不同群體的存活率無顯著差異（P＞0.05），鹽度降至16時，DC-F2出現(xiàn)急性死亡，存活率大幅下降至32.22%，顯著低于其他4個群體；在鹽度降至15時，除QQ-F1外，其他3個群體也開始出現(xiàn)大批死亡，到實驗結(jié)束時，QQ-F1的存活率為64.45%，顯著高于其他4個群體（P＜0.01）；在鹽度降低至13時，除QQ-F1仍有少量存活外（存活率為5.56%），其他4個群體均全部死亡，死亡率達到100%。

圖1 低鹽脅迫對刺參不同選育品系存活的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3）Fig.1 Effects of low salinity on the survival rate of the five strains ofA.japonicus（Mean±SD，n=3）圖中不同字母代表此鹽度下不同品系之間有顯著性差異（P＜0.05），下同Different letters at the figure represent a significant difference between the strains at that salinity（P＜0.05），the same as follows

根據(jù)不同低鹽濃度脅迫下各群體刺參苗種死亡情況，采用線性回歸法計算出各鹽度梯度下不同群體開始死亡時間（TBD）和ST50見表2。在鹽度16時DC-F2第5.71天開始出現(xiàn)死亡，在17.48 d死亡達到半數(shù)，而其他4個群體始終超過半數(shù)存活；鹽度15時，僅有QQ-F1始終超過半數(shù)存活，RC-F2、KC-F3和QW分別在9.15 d、7.43 d和8.86 d開始死亡，ST50分別為26.74 d、23.41 d和25.58 d，并且顯著長于DC-F2（P＜0.01）；在鹽度14時，QQ-F1在第10.36 d開始出現(xiàn)死亡，第23.54天時死亡達到半數(shù)，顯著長于其他4個群體（P＜0.05）。鹽度13時，5個群體刺參開始死亡時間均小于10 d。

表2 刺參不同選育品系在各低鹽脅迫下的開始死亡時間及半致死時間（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3）Tab.2 The TBD and ST50of the five populations of A.japonicus at different salinity conditions(Mean±SD,n=3)

采用線性回歸法計算出各群體刺參LS50-30d如圖2所示，DC-F2的LS50-30d為16.48，顯著高于其他4個群體（P＜0.01）；QQ-F1的LS50-30d為14.26，顯著低于其他4個群體（P＜0.05）。RC-F2、KC-F3和QW 的LS50-30d分別為15.02、15.19和15.13，相互之間差異不顯著（P＞0.05）。由此可見，所選育的4個群體中QQ-F1具有最高的低鹽耐受性。

圖2 刺參不同選育品系30天半性致死鹽度（LS50-30d）（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3）Fig.2 The median lethal salinity-30d（LS50-30d）for the five strains ofA.japonicus（Mean±SD，n=3）

2.2 低鹽脅迫對刺參不同選育品系特定生長率的影響

低鹽脅迫對5個不同刺參群體特定生長率的影響如圖3所示。在鹽度31時，各刺參群體特定生長率均維持在較高水平，并且無顯著性差異（P＞0.05）。在受到低鹽脅迫時，5個刺參群體的特定生長率隨著鹽度的下降而顯著下降。當(dāng)鹽度降低到18時各群體的特定生長率均顯著降低，僅有QQ-F1和QW表現(xiàn)為正生長（RSG＞0），其他3個刺參群體均出現(xiàn)負(fù)生長（RSG＜0）；而當(dāng)鹽度降至17時，僅有QQ-F1依然保持正生長狀態(tài)（RSG＞0），當(dāng)鹽度低于16時，所有刺參群體均表現(xiàn)出負(fù)生長。從各群體在不同低鹽脅迫時RSG顯著性變化的鹽度節(jié)點可以看出，RC-F2、KC-F3、DC-F2、QQ-F1和QW苗種分別在鹽度14、15、16、13、14時較相鄰上一鹽度出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）。

圖3 低鹽脅迫對刺參不同選育品系特定生長率的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3）Fig.3 Effects of low salinity on the specific growth rate of the five strains ofA.japonicus（Mean±SD，n=3）

2.3 低鹽脅迫對刺參不同選育品系非特異性免疫酶活的影響

2.3.1 低鹽脅迫對刺參不同選育品系堿性磷酸酶(AKP)的影響

低鹽脅迫對刺參不同選育品系A(chǔ)KP的影響如圖4所示。隨著鹽度的降低5個群體AKP活性均出現(xiàn)先升高后降低的過程。在鹽度由31降至21的過程中，5個群體均表現(xiàn)出AKP活性升高的現(xiàn)象，RC-F2和DC-F2在鹽度為21時達到峰值，活力分別為5.06金氏單位/100mL和7.63金氏單位/100mL；KC-F3、QQ-F1和QW在鹽度為24時達到峰值，活力分別為5.89金氏單位/100 mL、7.07金氏單位/100 mL和6.53金氏單位/100 mL。鹽度降至18時，各群體AKP的活性較之前的高鹽時顯著下降（P＜0.01）。不同群體在低鹽脅迫時AKP的變化各不相同：RC-F2在鹽度15～18時，AKP活力變化不顯著（P＞0.05），在鹽度14時AKP活力顯著下降（P＜0.01）并達到最低點，活力為0.50金氏單位/100 mL；KC-F3 的AKP活力隨著鹽度的下降而下降，但在鹽度為16～18時活力下降不顯著（P＞0.05），在鹽度降為15時AKP活力顯著下降（P＜0.01）；DC-F2在鹽度為16時AKP活性下降幅度較其他4個群體差異極顯著（P＜0.01）；與其他4個群體不同的是，QQ-F1的AKP活力在鹽度降至13時才出現(xiàn)顯著下降（P＜0.01）；QW的AKP活力變化顯著下降點出現(xiàn)在鹽度為14時（P＜0.05）。

圖4 低鹽脅迫對刺參不同選育品系堿性磷酸酶（AKP）的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=9）Fig.4 Effects of low salinity on AKP of the five strains ofA.japonicus（Mean±SD，n=9）

2.3.2 低鹽脅迫對刺參不同選育品系酸性磷酸酶(ACP)的影響

低鹽脅迫對刺參不同選育品系A(chǔ)CP的影響如圖5所示。低鹽脅迫下不同群體ACP活力變化與AKP活性變化相似，也是出現(xiàn)ACP活性先升高后降低的過程，除RC-F2在鹽度為21時達到峰值外，其他4個群體均在鹽度為24時達到峰值。在進入低鹽脅迫后（鹽度低于18以后），ACP活性較鹽度21時顯著下降（P＜0.01）。同一低鹽濃度脅迫下各群體AKP下降幅度存在較大差異，DC-F2在鹽度16時的下降幅度最大，與其他4個群體差異顯著（P＜0.01），而QQ-F1在鹽度14時仍然保持在較高的水平，活力為1.37金氏單位/100 mL。

圖5 低鹽脅迫對刺參不同選育品系酸性磷酸酶（ACP）的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=9）Fig.5 Effects of low salinity on ACP of the five strains ofA.japonicus（Mean±SD，n=9）

2.3.3 低鹽脅迫對刺參不同選育品系超氧化物歧化酶(SOD)的影響

低鹽脅迫對刺參不同選育品系SOD的影響如圖6所示。隨著鹽度的降低5個群體SOD活性相對于AKP活性和ACP活性波動比較平穩(wěn)。在鹽度高于21時，不同群體不同鹽度SOD活力差別不顯著（P＞0.05），表達較平穩(wěn)。進入低鹽脅迫后（鹽度低于18以下），各群體SOD表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，且均在鹽度17時SOD活力達到峰值，隨后隨著鹽度的降低其SOD活性逐步降低。同一低鹽濃度脅迫下各群體SOD下降幅度存在較大差異，其中DC-F2在鹽度16和14時SOD活力均顯著低于與其他4個群體（P＜0.01）；QQ-F1的SOD活力在14時仍然保持在較高的水平，活力為25.76U/mL，在鹽度13時才出現(xiàn)顯著下降（P＜0.01）；而RC-F2和KC-F3在鹽度14 時SOD活力出現(xiàn)顯著下降（P＜0.01）。

2.3.4 低鹽脅迫對刺參不同選育品系溶菌酶(LZM)的影響

圖6 低鹽脅迫對刺參不同選育品系超氧化物歧化酶（SOD）的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=9）Fig.6 Effects of low salinity on SOD of the five strains ofA.japonicus（Mean±SD，n=9）

圖7 低鹽脅迫對刺參不同選育品系溶菌酶（LZM）的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=9）Fig.7 Effects of low salinity on LZM of the five strains ofA.japonicus（Mean±SD，n=9）

低鹽脅迫對刺參不同選育品系LZM的影響如圖7所示。隨著鹽度的降低5個群體LZM活性均出現(xiàn)先升高后降低的過程，且均在鹽度18時達到峰值，在鹽度12時活力達到最低。但在低鹽脅迫過程中，對于不同選育品系其LZM活力下降幅度存在較大差異，DC-F2的LZM活力下降最快，在鹽度16時LZM活力下降幅度顯著大于其他4個群體（P＜0.05）。相對于其他群體，QQ-F1的LZM活力下降較為緩慢，在鹽度14時仍保持較高的LZM活力，顯著高于其他4個群體（P＜0.01）

3 討論

3.1 低鹽脅迫對刺參生長和存活的影響

本實驗結(jié)果表明，刺參不同品系在低鹽耐受時的存活率存在較大差異，由刺參5個不同群體30d的半致死鹽度（LS50-30d）可知，QQ-F1的LS50-30d最低，為14.26，而DC-F2的LS50-30d最高，為16.48，兩者鹽度差值為2.22，說明QQ-F1對低鹽脅迫的耐受性更好。刺參不同群體各鹽度下的開始死亡時間（TBD）和半致死時間（ST50）也印證了這一結(jié)論，即在相同低鹽脅迫下，QQ-F1出現(xiàn)死亡和死亡達到半數(shù)的時間顯著滯后于其他4個群體。Join［27］研究發(fā)現(xiàn)海參可以通過改變其結(jié)締組織的機械強度，收縮自身體積來積極調(diào)節(jié)滲透壓平衡。根據(jù)刺參不同群體的選育目標(biāo)和結(jié)果發(fā)現(xiàn)DC-F2的顯著特點為棘刺列數(shù)和棘刺總數(shù)高，表面積大，而QQ-F1的顯著特點為體壁厚且棘刺粗壯，體壁機械強度較大。由此初步推測相應(yīng)低鹽脅迫時DC-F2需要消耗更多的能量用于維持滲透壓的平衡，而導(dǎo)致其低鹽耐受力比較弱，這可能也是DC-F2在鹽度16時就出現(xiàn)大批死亡的原因之一。不同刺參品系在低鹽耐受時的特定生長率同樣存在較大差異，當(dāng)鹽度達到18時，除QQ-F1外，其他4個群體均開始出現(xiàn)負(fù)增長，QQ-F1在鹽度高于17時均可表現(xiàn)為正增長。結(jié)合試驗結(jié)束時不同群體低鹽耐受存活率，鑒于不同群體在鹽度13和14時的存活率均較低，在低于15鹽度以下時進行RSG比較意義不大，因此選擇鹽度16以上時的RSG判定不同群體的耐低鹽特性更為客觀。根據(jù)不同群體在鹽度為16、17和18時的RSG可以看出QQ-F1在低鹽度下的特定生長率顯著高于其他4個群體，表現(xiàn)出良好的耐低鹽特性。綜合不同群體苗種特點和對低鹽脅迫的耐受性可以看出，棘刺的數(shù)目和體壁的厚度與低鹽脅迫的耐受性顯著相關(guān)。通過5個不同群體對低鹽脅迫的耐受能力可以看出，QQ-F1在低鹽海域或鹽度變化較大海域的養(yǎng)殖具有較廣闊的應(yīng)用前景。

3.2 刺參不同選育品系非特異性免疫酶活對低鹽脅迫的響應(yīng)

刺參屬于低等生物，不像高等生物一樣有著發(fā)達的特異性免疫［28］，因此刺參免疫防御體系主要由非特異性免疫系統(tǒng)來承擔(dān)。刺參體腔細(xì)胞既是細(xì)胞免疫的承擔(dān)者，又是體液免疫因子的提供者［29］。激活后的體腔細(xì)胞可以產(chǎn)生多種免疫因子以及各種具有免疫活性的酶類（如超氧化物歧化酶、溶菌酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶等），提高刺參機體的免疫力［30］。因此可以通過刺參非特異免疫酶活變化，來反應(yīng)其在脅迫狀態(tài)下的免疫應(yīng)答。本實驗研究了刺參不同選育品系在不同低鹽脅迫下AKP、ACP、SOD和LZM的變化過程，從變化趨勢可以看出，在鹽度21～31時，ACP、AKP、LZM活性隨著鹽度的降低酶活呈上升趨勢，SOD活力變化不顯著，說明在刺參適宜的鹽度范圍內(nèi)，刺參可通過提高ACP、AKP、LZM等各種免疫酶活力來減少鹽度下降對機體造成的影響，以維持機體處于正常的生理狀態(tài)。而當(dāng)鹽度降低突破其適宜鹽度后即機體處于低鹽脅迫時，ACP和AKP活力迅速下降，其解毒和抗異物能力明顯減弱；SOD 和LZM卻在鹽度17和18時酶活力顯著上升并達到峰值，而在鹽度降至16以下時SOD和LZM活性迅速下降，說明刺參在一定低鹽范圍內(nèi)可通過提高SOD和LZM活性即提高抗氧化酶等活力來抵抗低鹽脅迫，然而，在突破一定鹽度閾值后，機體無法承受高強度低鹽脅迫，SOD和LZM表達能力也隨之下降，這與董曉亮等［31］研究結(jié)果一致。結(jié)合低鹽脅迫死亡情況也可以看出，在鹽度低于16時，各刺參群體陸續(xù)出現(xiàn)急性死亡。在低鹽度下，其刺參的死亡原因相當(dāng)復(fù)雜，但其中非特異性免疫酶活力大大下降現(xiàn)象也可能與死亡有一定關(guān)系。對比5個不同群體的4種非特異性免疫酶活力變化幅度可以看出，DC-F2苗種的4種酶活力均在鹽度16時下降幅度最高，顯著低于其他4個群體（P＜0.05），說明低鹽耐受力較差；而QQ-F1在鹽度低于16以后4種酶活力雖然也有顯著下降，但其酶活下降幅度較小，在鹽度14時，仍維持在較高水平，顯著高于其他4個群體（P＜0.01），說明其具有較強的低鹽耐受能力。

綜合以上結(jié)果可以看出，以耐低鹽為評判指標(biāo)時，5個群體的低鹽耐受力排序為QQ-F1＞RC-F2＞QW＞KC-F3＞DC-F2，QQ-F1的LS50-30d為14.26，表現(xiàn)出良好的低鹽耐受能力和較高非特異性免疫酶活力。這是目前刺參低鹽耐受能力強的品系之一，在入?？?、港灣區(qū)域等低鹽度或鹽度不穩(wěn)定的海域具有良好的推廣應(yīng)用前景。本次實驗探究了QQ-F1、RC-F2、QW、KC-F3、DC-F2 5個刺參群體的低鹽耐受能力，然而隨著育種的不斷開展，不同世代之間對低鹽的耐受能力還有待于進一步探究，以便選擇低鹽耐受能力更強的品系，應(yīng)用于刺參的育、繁、推工作。其中，重點研究青青刺參品系的耐低鹽機理以及在低鹽區(qū)開展養(yǎng)殖測試，為耐低鹽刺參品系的養(yǎng)殖推廣提供技術(shù)參數(shù)。

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（本文編輯：梁德海）

Response to low salinity of four strains of sea cucumber Apostichopus japonicus larvae

HOU Xi-tan1,2,LIAO Mei-jie2,LI Bin2,WANG Yin-geng2,ZHANG Zheng2,CHEN Gui-ping2,RONG Xiao-jun2,SUN Jin-sheng1,FAN Rui-yong3

（1.College of Life Science，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China；2.Yellow Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences；Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology，Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes，Qingdao 266071，China；3.Qingdao Ruizi Rare Marine Animal Culture&Development Co.Ltd，Qingdao 266408，China）

Nov.11，2015

Apostichopus japonicus；low salinity stress；specific growth rate；median lethal salinity；median survival time；non-specific immune enzyme activity

The salinity of the sea in estuarine areas is low and unstable，which threatens the survival and growth of sea cucumbers.To evaluate the low salinity tolerance of four sea cucumber（Apostichopus japonicus）strains（RC-F2，KC-F3，DC-F2，and QQ-F1），the growth，survival，and non-specific immune enzyme activities were monitored at seven salinity levels（13，14，15，16，17，18，and 31）；wild sea cucumber specimens from the Qingdao coast（QW）were used as controls.The RSGs（Specific Growth Rate）of all the strains，including the control，QW，decreased significantly under the stress of low salinity conditions.Only the QQ-F1 strain showed positive RSGat salinity 17.The LS50-30d of QQ-F1 was significantly lower than that of the other strains（RC-F2，KC-F3，DC-F2，QQ-F1，and QW were 15.02，15.19，16.48，14.26，and 15.13，respectively）.At salinity 14，the ST50of QQ-F1 was significantly longer than that of the other strains（RC-F2，KC-F3，DC-F2，QQ-F1，and QW were 19.84d，18.43d，10.11d，23.54d，and 19.01d，respectively）.Although the enzyme activities of AKP，ACP，SOD，and LZM were decreased in all 5 species under low salinity conditions（salinity＜18），the QQ-F1 strain maintained a comparatively higher enzyme activity level and showed higher overall tolerance to the stress of low salinity.Based on the growth，survival，and non-specific immune enzyme activities，the tolerance to low salinity of the 5 populations was ordered as follows：QQ-F1＞RC-F2＞QW＞KC-F3＞DC-F2.The high tolerance of QQ-F1 for low salinity suggest that it would be a good candidate for popularization of low salinity sea areas or unstable salinity coastal areas.These results could be helpful for healthy farming and breeding of sea cucumbers，as well as for evaluations of their character.

A

1000-3096（2016）05-0019-10

2015-12-12；

2016-01-11

國家十二五“863”項目 （2012AA10A412-4）；國家自然科學(xué)基金項目（31202016）；山東省農(nóng)業(yè)良種工程重大項目“速生抗病耐高溫刺參良種選育”；國家948項目（2014-Z13）；山東省自主創(chuàng)新成果轉(zhuǎn)化專項（2013ZHZX2A0801）

［Foundation：NationalHigh Technology Research andDevelopment Program，China，No.2012AA10A412-4；National Natural Science Foundation of China，No.31202016；Agriculture Seed Improvement ProjectofShandongProvince；Program forinternationaladvanced agricultural science and technology introduction，No.2014-Z13；Special Research Funds for Independent Innovation and Scientific &Technology Achievements Transformation Of Shandong Province，No.2013ZHZX2A0801］

侯西坦（1990-），男，山東鄒城人，碩士研究生，研究方向：海參良種選育，電話：0532-85817991，E-mail：houxitan@126.com；王印庚，通信作者，研究員，電話：0532-85841732，E-mail：wangyg@ysfri.ac.cn