鉤藤中鉤藤堿、異鉤藤堿的提取與含量測(cè)定在預(yù)后中的應(yīng)用分析

張　恒　饒坤林

(湖北省荊州市中心醫(yī)院藥學(xué)部，荊州，434020)

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中藥研究

鉤藤中鉤藤堿、異鉤藤堿的提取與含量測(cè)定在預(yù)后中的應(yīng)用分析

張恒饒坤林

(湖北省荊州市中心醫(yī)院藥學(xué)部，荊州，434020)

目的：探討鉤藤中鉤藤堿、異鉤藤堿的提取與含量測(cè)定在預(yù)后中的應(yīng)用。方法：采取水煎液以及甲醇提取液的方式對(duì)鉤藤中的鉤藤堿及異鉤藤堿進(jìn)行提取，并使用高效液相色譜系統(tǒng)分別對(duì)其提取的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：在2.5～80 μg/mL的范圍內(nèi)鉤藤堿的線性關(guān)系良好，此時(shí)的回歸方程為Y=76.717 0X-0.072 7(r=0.999 8)，RSD<8.7%；在2.0～80 μg/mL的范圍內(nèi)異鉤藤堿的線性關(guān)系良好，此時(shí)的回歸方程為Y=87.472 9X-0.366 6(r=0.999 7)，RSD<7.3%。甲醇提取液的方式所提取鉤藤堿和異鉤藤堿的含量高于水煎液的方式，并且使用二十倍質(zhì)量的甲醇量，24 h的冷侵時(shí)間以及60 min的超聲時(shí)間最合適。結(jié)論：使用甲醇進(jìn)行提取在用于鉤藤中鉤藤堿及異鉤藤堿中作用優(yōu)異，對(duì)其質(zhì)量的控制性好，重復(fù)性高，操作方法簡(jiǎn)單，可提高預(yù)后，值得在臨床上應(yīng)用推廣。

鉤藤堿；異鉤藤堿；提取方法

鉤藤是一種傳統(tǒng)中藥，其種類眾多，有鉤藤、毛鉤藤、大葉鉤藤、華鉤藤等，有15種，屬于一種茜草科植物[1-2]。該藥物的鉤莖枝可以用來(lái)入藥，具有降壓、抗心律失常、鎮(zhèn)靜的作用，并且在老年癡呆癥的治療中也發(fā)揮著功效[3-4]。在鉤藤中，鉤藤堿和異鉤藤堿這2種成分在藥效上面的作用效果最大[5-6]。因此在對(duì)這2種成分的提取和測(cè)定上面有著十分重要的臨床意義，此次我們應(yīng)用了不同方式對(duì)鉤藤中的鉤藤堿及異鉤藤堿進(jìn)行了提取并對(duì)其含量進(jìn)行了檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1儀器由美國(guó)DIONEX公司生產(chǎn)的高效液相色譜系統(tǒng)，Dionex summit型，其中包括色譜工作站Chromeleon，二極管陣列檢測(cè)器PDA-100，柱溫箱TCC-100，自動(dòng)進(jìn)樣器ASI-100。美國(guó)Milipore公司生產(chǎn)的Milipore0.45 μm濾膜以及過(guò)濾器，日本shimadzu公司生產(chǎn)的AUM220D電子分析天平，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)的低速大容量離心機(jī)LXJ-IIB。

1.2受試藥物鉤藤堿對(duì)照品(純度≥98%，批號(hào)150821，生產(chǎn)廠家：南昌被他生物科技有限公司)，異鉤藤堿對(duì)照品(純度≥98%，批號(hào)150902，生產(chǎn)廠家：南京貝塔生物科技有限公司)，甲醇(色譜純，北京Dikma科技有限公司)，鉤藤標(biāo)準(zhǔn)藥材：廣州市藥品檢驗(yàn)所。水為去離子水，由密理博純水機(jī)Milli-Q型進(jìn)行制備。

1.3方法

1.3.1色譜條件色譜柱選擇Phenomenex C18柱，流動(dòng)相中甲醇和水的比例為70∶30，0.5 mL/min的流速，30 ℃柱溫，5 ℃進(jìn)樣器溫度，245 nm的檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.3.2對(duì)照品儲(chǔ)備液的配置精密提取1.00 mg的鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品以及1.00 mg的異鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組，將其分別放置在1.0 mL的棕色容量瓶之中，然后加入60%的甲醇溶液進(jìn)行搖勻，得出鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.00 mg/mL，異鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.00 mg/mL，然后放入冷凍箱內(nèi)保存，注意避光。在使用前可用60%的甲醇進(jìn)行稀釋至所需要的濃度。

1.3.3樣品的制備將鉤藤藥材使用2種方式進(jìn)行制備：1)通過(guò)水煎液制備，將鉤藤藥材經(jīng)過(guò)搗碎之后過(guò)20目篩，通過(guò)精密稱取5 g的量，放入圓底燒瓶之中，再使用10倍質(zhì)量的純水將其浸泡40 min后，使用電熱套進(jìn)行加熱，然后進(jìn)行45 min的回流提取，之后冷卻約15 min的時(shí)間，將濾液體積進(jìn)行測(cè)量并記錄。2)另一種方式使用甲醇提取液，將鉤藤藥材搗碎之后過(guò)20目篩，同樣精密稱取5 g的量，放入棕色瓶之中，精密加入甲醇，質(zhì)量為鉤藤藥材的20倍，隨后放入4 ℃的冰箱內(nèi)將其冷浸24 h，并進(jìn)行45 min的低溫超聲，將甲醇的重量補(bǔ)足后進(jìn)行過(guò)濾，測(cè)量并記錄濾液體積。將以上制備的2種濾液提取1.5 mL后放入離心管之中，通過(guò)10 000 r/min離心10 min后，加入0.45 μm的清液入微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，然后進(jìn)行進(jìn)樣分析，分別按照各自最后剩下的“濾液體積”進(jìn)行換算，換算后的含量為相同提取液體積下相等含量的藥材的。

1.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備通過(guò)精密吸取鉤藤堿對(duì)照品1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，分別置入7個(gè)1 mL的棕色容量瓶之中，分別為80、60、40、20、10、5、2.5 μL，再精密吸取異鉤藤堿對(duì)照品1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，同樣放入7個(gè)1 mL的棕色容量瓶之中，為80、60、40、20、10、5、2.0 μL。然后使用60%的甲醇定容，分別對(duì)所有溶液進(jìn)行10 μL的進(jìn)樣檢測(cè)分析。結(jié)果顯示，在2.5～80 μg/mL的范圍內(nèi)鉤藤堿的線性關(guān)系良好，此時(shí)的回歸方程為Y=76.717 0X-0.072 7(r=0.999 8)；在2.0～80 μg/mL的范圍內(nèi)異鉤藤堿的線性關(guān)系良好，此時(shí)的回歸方程為Y=87.472 9X-0.366 6(r=0.999 7)。

1.3.5檢測(cè)限和定量限通過(guò)精密量去線性項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液進(jìn)行定量的稀釋，信噪比S/N的比值為3∶1，結(jié)果顯示鉤藤堿的檢測(cè)限為0.25 μg/mL，異構(gòu)藤間的檢測(cè)限為0.5 μg/mL；然后信噪比S/N的比值為10∶1，結(jié)果顯示鉤藤堿的定量限為1.0 μg/mL，異鉤藤堿的定量限為1.5 μg/mL。

1.3.6專屬性試驗(yàn)通過(guò)精密吸取10 μL的對(duì)照品溶液以及樣品溶液，在1.3.1所描述的色譜條件下對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示的鉤藤堿的保留時(shí)間約在15.6 min，異鉤藤堿的保留時(shí)間大約18.92 min，雙峰的分離度較好，所得到結(jié)果不受鉤藤藥材中其他成分的影響。

1.3.7精密度試驗(yàn)通過(guò)精密吸取鉤藤堿和異鉤藤堿精密后將其混合在對(duì)照品溶液中，溶液劑量為10 μL，連續(xù)進(jìn)行6次的測(cè)定，結(jié)果所得鉤藤堿的峰面積RSD為1.20%，異鉤藤堿的為3.13%，證明了儀器的精密度良好。

1.3.8重復(fù)性試驗(yàn)選取5份同一批次的鉤藤樣品，按照2.3所描述的方法下對(duì)供試品溶液進(jìn)行制備，通過(guò)10 μL進(jìn)樣的方法進(jìn)行檢測(cè)，所得的鉤藤堿含量的RSD為2.23%，異鉤藤堿的為2.14%。

1.3.9穩(wěn)定性試驗(yàn)選取同一供試品溶液，在0、2、4、6、10以及14 h時(shí)進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè)，所得到的結(jié)果顯示，鉤藤堿和異構(gòu)藤間的峰面積RSD分別為4.65%和3.54%，結(jié)果顯示供試品在14 h內(nèi)依然穩(wěn)定。

1.3.10鉤藤堿及異鉤藤堿加樣回收率試驗(yàn)比較分析提取同一批次的鉤藤總共6份，通過(guò)精密計(jì)算分別加入含有鉤藤堿以及異鉤藤堿的對(duì)照品之中，溶液有高、中、低三種濃度，提取并測(cè)定，同時(shí)計(jì)算回收率。見(jiàn)表1。

2　結(jié)果

2.1鉤藤藥材通過(guò)水煎液的方式含量結(jié)果選取6份鉤藤藥材，每份5 g，依照1.3.3方法進(jìn)行試品的制備，分別在10 min、20 min、30 min、45 min、60 min以及90 min的時(shí)候?qū)悠愤M(jìn)行提取。所得到的結(jié)果顯示在熱穩(wěn)定上，鉤藤堿和異鉤藤堿的表現(xiàn)極差，通過(guò)加熱很容易將其破壞，使得藥理作用缺失，不同時(shí)間段水煎液中測(cè)得鉤藤堿含量為0.0025%～0.0030%，異鉤藤堿的含量為0.0041%～0.0053%。

2.2正交試驗(yàn)優(yōu)選鉤藤藥材的甲醇提取方法由于甲醇的用量、冷侵時(shí)間、超聲時(shí)間對(duì)提取率的結(jié)果影響較大，通過(guò)表2的因素水平安排表進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示，在甲醇量、冷侵時(shí)間、超聲時(shí)間中，對(duì)提取率的影響情況由大至小依次為，超聲時(shí)間>甲醇量>冷侵時(shí)間，使用20倍質(zhì)量的甲醇量，24 h的冷侵時(shí)間以及60 min的超聲時(shí)間最合適。

表1　鉤藤堿及異鉤藤堿加樣回收率試驗(yàn)比較分析

表2　因素水平表

2.3鉤藤堿中鉤藤堿與異鉤藤堿的含量測(cè)量提取3個(gè)批次的鉤藤藥材以及標(biāo)準(zhǔn)鉤藤藥材，按照上面的正交試驗(yàn)所得到的最佳條件提取制備，然后測(cè)定鉤藤堿和異鉤藤堿的結(jié)果。見(jiàn)表3。

表3　鉤藤堿中鉤藤堿與異鉤藤堿的含量測(cè)量(%)

3　討論

鉤藤主要產(chǎn)于江西、湖南、廣東、云南等地區(qū)，性微寒，味甘，歸肝，心包經(jīng)，主要功效為清熱平肝、定驚熄風(fēng)[7-8]。在肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)，驚癇抽搐，感冒夾驚，妊娠子癇，小兒啼哭，頭疼暈眩上也有很大的功效[9]。在現(xiàn)代藥理學(xué)中，具有控制血壓，擴(kuò)張外周血管等作用，并且該藥物毒性低，用藥時(shí)帶來(lái)的不良反應(yīng)較小，安全性高，臨床上常用于治療高血壓[10-11]。有研究顯示，鉤藤在抗血小板聚集以及抵抗血栓形成的過(guò)程中也有著良好的療效[12-13]。在之前臨床上有很多關(guān)于鉤藤的處理方式，其中有水煎液、石油醚回流、甲醇提取、乙醇回流等[14-15]。其中乙醇回流和甲醇提取能夠保證鉤藤堿和異鉤藤堿的提取率最高，但是乙醇回流的方式由于操作方式過(guò)于復(fù)雜，分離方式太難，并且其中的雜質(zhì)也較多。此次我們使用了水煎液和甲醇的方式對(duì)鉤藤中的鉤藤堿和異鉤藤堿進(jìn)行了提取。

鉤藤堿和異鉤藤堿的穩(wěn)定性很差，在一些極性溶液或者處于高溫照射的條件下很容易形成轉(zhuǎn)換，從而使得鉤藤堿和異鉤藤堿的含量出現(xiàn)降低的情況。建議將鉤藤堿和異鉤藤堿的標(biāo)準(zhǔn)品放在放置于冷凍、干燥且避光的環(huán)境下進(jìn)行保存，不易使其中各物質(zhì)含量發(fā)生降解，并且在實(shí)驗(yàn)時(shí)需即配即用，測(cè)定樣品的時(shí)候需盡快，以得到最可靠有效的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。研究顯示，相比于水煎液的提取方式，通過(guò)甲醇提取鉤藤中鉤藤堿及異鉤藤堿的方式要更為優(yōu)異，這種方式所得的提取率大約在水煎液法的10倍以上，有效性高。并且此次研究對(duì)影響提取率的因素上也進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)最佳的提取工藝和檢測(cè)方式為用20倍量的甲醇量，24 h的冷侵時(shí)間以及60 min的超聲時(shí)間。以往有研究顯示，在對(duì)配置1周后的鉤藤堿對(duì)照品溶液進(jìn)行重新檢測(cè)后，鉤藤堿的表達(dá)依然穩(wěn)定，但是異鉤藤堿多出了一峰，含量變小，該作者推斷是少數(shù)的鉤藤堿轉(zhuǎn)化成了異鉤藤堿[16]。但在我們的研究中顯示，鉤藤堿及異鉤藤堿在甲醇中24 h內(nèi)的含量都呈現(xiàn)穩(wěn)定，證明了使用鉤藤堿和異鉤藤堿用來(lái)對(duì)藥材的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)是可靠的。

綜上所述，使用甲醇進(jìn)行提取在用于鉤藤中鉤藤堿及異鉤藤堿中作用優(yōu)異，對(duì)其質(zhì)量的控制性好，重復(fù)性高，操作方法簡(jiǎn)單，可提高預(yù)后，值得在臨床上應(yīng)用推廣。

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(2016-03-08收稿責(zé)任編輯：張文婷)

Application in Prognosis of the Extraction and Content Determination of Rhynchophylline and Isorhynchophylline in Gambir Plant Nod

Zhang Heng, Rao Kunlin

(JingzhouCentralHospital,Hubei,Jingzhou434020,China)

Objective: To explore the application of extraction and content determination in the prognosis of uncaria rhynchophylline and isorhynchophylline in Gambir Plant Nod. Methods: The uncaria rhynchophylline and isorhynchophylline extract was taken by water extract and methanol extract methods, and the content of the extract was determined by high performance liquid chromatography. Results: The good linear relationship of rhynchophylline was in the range of 2.5～80 μg/mL, the regression equation for the time Y=76.717 0X-0.072 7(r=0.999 8),RSD<8.7%; In the linear relationship between the range of 2.0～80 μg/mL, rhynchophylline was good, the regression equation for the time Y=87.472 9X-0.366 6(r=0.999 7),RSD<7.3%. The content of rhynchophylline and isorhynchophylline extracted by methanol extraction liquid was higher than those extracted by the water. And the best way to extract the contents was under the condition of 20 times the maximum amount of methanol, 24 hours of the invasion of cold time and 60 min of sonication. Conclusion: The methanol extraction method is prominent in extracting in uncaria rhynchophylline and isorhynchophylline, with good quality control, high repeatability, simple operation, and effect of improving prognosis, which is worthy of clinical application and promotion.

Rhynchophylline; Isorhynchophylline; Extraction method

武漢市科技計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：2013060501010152)

張恒(1982.11—)，男，本科，主管藥師，研究方向：藥學(xué)，E-mail：2064611@qq.com

饒坤林(1983.09—)，女，碩士研究生，主管護(hù)師，研究方向：手術(shù)室護(hù)理，E-mail：121004261@qq.com

R284.2

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.07.047