丹梔逍遙散加減對肝郁氣滯型新生血管性青光眼的臨床應用及機制探討

段　穎　張淑清　于俊義

(河北省衡水市第四人民醫(yī)院眼科，衡水，053000)

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丹梔逍遙散加減對肝郁氣滯型新生血管性青光眼的臨床應用及機制探討

段穎張淑清于俊義

(河北省衡水市第四人民醫(yī)院眼科，衡水，053000)

目的：觀察丹梔逍遙散加減對肝郁氣滯型新生血管性青光眼的臨床療效及其與HIF-1/VEGF/Notch1信號通路相關性探討。方法：將42例肝郁氣滯型新生血管性青光眼患者隨機分成2組，治療組給予丹梔逍遙散加減+降眼壓藥物口服，對照組予降眼壓藥物，觀察2組治療4周后眼壓、視力、視野、新生血管回退情況等；應用Western Blot檢測2組患者血清中HIF-1a、VEGF、Notch1蛋白表達情況。結果：2組經(jīng)不同方法治療4周后眼壓、視力、視野、新生血管情況比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，治療組經(jīng)丹梔逍遙散加減口服治療與對照組比較，HIF-1a、VEGF、Notch1的蛋白表達情況明顯低于對照組，且有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論：丹梔逍遙散加減治療新生血管性青光眼可以有效控制眼壓，提高視力、視野，促使新生血管消退，是一種安全有效的治療方式，值得臨床推廣應用，其作用機制可能是通過調控HIF-1/VEGF/Notch信號通路來實現(xiàn)的。

丹梔逍遙散；肝郁氣滯型；新生血管性青光眼；臨床應用；HIF/VEGF/Notch；信號通路

新生血管性青光眼(Neovascularglaucoma，NVG)是纖維血管組織在房角增生，導致小梁網(wǎng)阻塞，周邊虹膜前粘連和進行性房角關閉，進而眼壓升高進而產(chǎn)生的一種繼發(fā)性青光眼[1]。近年來，伴隨著眼后段廣泛缺血性疾病，如糖尿病視網(wǎng)膜病變，視網(wǎng)膜靜脈阻塞、高血壓、高血脂等發(fā)病率的逐年增高，作為其主要并發(fā)癥的NVG的患病率比例也呈上升趨勢，并且是一種破壞性強、失明率高的眼病。目前認為NVG的發(fā)病機制是缺血缺氧刺激引起虹膜及房角新生血管的產(chǎn)生，缺血缺氧刺激一方面引起新生血管促進因子釋放，另一方面也活化血管抑制因子，當促進因子的作用大于抑制因子時，便有新生血管產(chǎn)生[2]。而在眾多的血管生長因子中，血管內皮生長因子(VEGF)在NVG的作用最令人注目。HIF-1蛋白對機體缺血缺氧具有特異性感受,缺血動物模型證實HIF-1蛋白具有促進新生血管形成的作用[3-4]。VEGF作為HIF-1直接調控作用的靶基因之一,兩者在缺血后血管新生過程中的關系密切。此外，大量研究表明缺氧可以提高內皮細胞Notch信號通路的活性，同時上調VEGF等生長因子在損傷部位的表達,誘導內皮細胞形成新的血管組織，且認為VEGF通過Notch信號系統(tǒng)起作用[5-7]?；谥嗅t(yī)學認為肝郁氣滯型是本病的常見證型之一，本文旨在研究丹梔逍遙散加味治療肝郁氣滯型NVG的臨床療效，并進一步探討其機制。

1　資料與方法

1.1實驗材料丹梔逍遙散，高速冷凍離心機(Thermo Fisher，美國)，電泳槽(Bio-rad，美國)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad，美國)，Hank，S液、PMSF(碧云天，中國)，SDS-PAGE電泳膠(碧云天，中國)，HIF-1a、VEGF、Notch1及β-actin一抗和堿性磷酸酶標記山羊抗兔(CST公司，美國)。

1.2臨床資料

1.2.1一般資料收集2012年7月至2015年9月來我院就診的42例肝郁氣滯型NVG患者(均簽署參與本研究的知情同意書)，采用隨機數(shù)字表法將42名患者為治療組(21例)和對照組(21例)。治療組21例中男14例，女7例，平均年齡(54.1±5.76)歲，發(fā)病后青光眼病程2～13個月；對照組21例中男13例，女8例，平均年齡(55.3±6.13)歲，發(fā)病后青光眼病程2～15個月；2組患者一般資料經(jīng)統(tǒng)計學比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2.2入選標準全部患者經(jīng)裂隙燈顯微鏡、前房角鏡等檢查證實虹膜出現(xiàn)新生血管，并伴有眼壓升高，眼壓>21 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)；虹膜新生血管；房角鏡下房角關閉大于180[8]。未曾行任何手術及激光治療的NVG；自愿作為受試對象，簽署知情同意書。原發(fā)病糖尿病視網(wǎng)膜病變14例，視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞16例，視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞7例，視網(wǎng)膜血管炎5例。排除標準：心、肝、腦、腎功能不全、腫瘤及VEGF有關的疾病者；妊娠及哺乳期婦女;嚴重精神疾病患者。中醫(yī)診斷與辨證標準參照《中醫(yī)眼科學》中肝郁氣滯型綠風內障的診斷標準[9]。

1.2.3治療方法對照組采用降眼壓藥物治療(噻嗎心安眼水滴眼，1滴，2次/d；匹魯卡品眼水滴眼，1滴,5次/d；口服尼目克司，25 mg，2次/d)。治療組在對照組治療基礎上加用丹梔逍遙散加減：牡丹皮、梔子、柴胡、當歸、白芍、白術各12 g，茯苓15 g，吳茱萸2 g，薄荷9 g，黃連、甘草各6 g，生姜3 g。1劑/d，每天早晚溫服2次，連用4周。

1.2.4觀察療效指標術后觀察并記錄眼壓、視力、視野、新生血管回退情況。1)眼壓：臨床治愈：眼壓恢復低于2.74 kPa(21 mmHg)；好轉：眼壓下降至2.74～3.25 kPa(21～24 mmHg)，加用降眼壓藥物可基本正常；未愈：眼壓未降，眼部諸癥及全身癥狀無改善。2)視力：臨床治愈：視力恢復至發(fā)病前；好轉：視力恢復部分但未至發(fā)病前；未愈：視力無改善。3)視野：臨床治愈：視野恢復至發(fā)病前；好轉：視野恢復部分但未至發(fā)病前；未愈：視野無改善。4)新生血管回退：新生血管全部回退；新生血管部分回退；新生血管未回退。

1.3標本采集和檢測方法及內容1)血清采集：入院時第2天清晨靜息空腹狀態(tài)下，抽取實驗對象肘靜脈血20 mL,肝素抗凝后與等量Hallk，S液對倍稀釋充分混勻到40 mL,按照淋巴細胞分離液:抗凝血稀釋液1∶1的比例,在15 mL離心管中加入約6 mL淋巴細胞分離液，24～26 ℃水平離心2 000 r/min×20 min；離心后管內分為五層,血漿和Hank,S液、單個核細胞(白色云霧層狹窄帶)、分離液、粒細胞、紅細胞；用毛細滴管插到云霧，吸取單個核細胞,置入另一離心管中,加入5倍以上體積的Hank，S液,1 500 r/min×10 min,洗滌細胞兩次；末次離心后,棄上清,加入含有10%小牛血清的RPMI-1640,重懸細胞。根據(jù)用蛋白酶抑制劑(PMSF)法提取總蛋白。2)根據(jù)DAB方法對所提蛋白液進行濃度測定后于100 ℃金屬浴中變性。3)每泳道上樣量為50 μg蛋白；電泳(4%濃縮膠，12%分離膠，120 V，50 mA，1.5 h)結束后將凝膠取出，用聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉印，50 V，100 mA，2 h。5%脫脂奶粉液的封閉2 h，TBS清洗，分別加入稀釋的抗HIF-1a、VEGF、Notch1和β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBS清洗，加入堿性磷酸酶標記山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG，1∶2 000)室溫2 h，TBS清洗。將濾膜放于顯色液中顯色后顯影，圖像由生物分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司，Model Gel Doc 2000，美國)分析處理。

2　結果

由表1可知，2組經(jīng)不同方法治療4周后眼壓、視力、視野、新生血管情況比較有統(tǒng)計學意義，P<0.05;由圖1可知，治療組經(jīng)丹梔逍遙散加減口服治療4周后與對照組比較，HIF-1a、VEGF、Notch1的蛋白表達情況明顯低于對照組，且有統(tǒng)計學意義，P<0.05。

表1　2組眼壓、視力、視野、新生血管情況情況分析對比

2組治療后眼壓、視力、視野、新生血管情況比較：χ2分別為7.29、11.98、8.77、3.65,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1　2組HIF-1a、VEGF、Notch1的蛋白表達情況

表2　2組HIF-1a、VEGF、Notch1的蛋白相對表達強度

注：與對照組比較，*P<0.05。

3　討論

NVG是一種病情重且極難治性的繼發(fā)性青光眼，其致盲率高達92.4%[10]。隨著分子生物學和免疫學的飛速發(fā)展，眼部新生血管的相關研究已成為國內外眼科專家的熱點研究，其中，以研究觀察HIF-1、VEGF的表達情況及機制最為多見。組織缺血缺氧后HIF-1作為血管新生的核心調控因子對血管新生具有重要作用，主要通過以下機制發(fā)揮作用:1)上調VEGF受體、配體以及NO，使血管通透性增加為血管形成作好準備；2)降解細胞外基質同時增加金屬蛋白水解酶活性為細胞的存活提供環(huán)境；3)通過VEGF和整合素使血管內皮細胞由血管芽腔形成血管網(wǎng)；4)最后通過血管生成素、血小板衍生生長因子等作用于基質細胞，使新生血管進一步成為成熟血管[11-12]。VEGF是目前所發(fā)現(xiàn)的功能最強、最直接的血管形成促進因子，被公認為血管生成過程中的中心調節(jié)者[13]。有研究表明，NVG的發(fā)病與視網(wǎng)膜內VEGF表達增加，眼內VEGF濃度增高密切相關[14]。趙君[15]等研究發(fā)現(xiàn)，大鼠角膜堿燒傷后的預后與異常增生的微血管有關，VEGF、HIF-1二者間的動態(tài)平衡的失調促進角膜組織中的微血管形成。Notch受體介導的信號轉導途徑參與了新生血管的形成。Hainaud等[16]研究發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎模型中注射VEGF的激活劑使VFGF的表達上調，VFGF的表達上調引起Notch信號通路相關信號分子的活化，促進血管生成；此研究表明Notch信號通路是VEGF的下游靶點，兩者共調控新生血管的形成與成熟過程，在血管新生方面發(fā)揮重要作用。

中醫(yī)學對青光眼已有深刻的認識，認為青光眼屬“綠風內障”和“青風內障”范疇，是由肝氣郁滯、脾濕生痰、肝膽火熾、陰虛陽亢等致氣血失和所致。近代醫(yī)家認為本病多由內傷七情所致。七情所傷，最易傷氣，氣傷影響及血，使氣血同時受病，上亂清道，蒙蔽空竅而發(fā)病。丹梔逍遙散出自《內科摘要方》，主要用于治療肝氣郁結、肝血不足、虛熱內生的病癥。方中以柴胡做為君，疏肝解郁，使肝氣調達；白芍性酸苦微寒，養(yǎng)血斂陰，柔肝緩急。當歸味辛散，養(yǎng)血和血，乃血中氣藥。當歸與白芍同用，補肝體而調肝用，使血和則肝和，血充則肝柔共為臣藥。木郁則土衰，肝病易傳脾，故以白術、茯苓、甘草健脾益氣，共為佐藥。再加用牡丹皮清血中之伏火，梔子清肝熱、瀉火除煩、導熱下行。諸藥合用，共奏疏肝解郁、健脾涼血之效，成為治療青光眼肝郁證型的有效方劑[17]。

本文通過對比治療發(fā)現(xiàn)2組不同方法治療4周后，治療組經(jīng)丹梔逍遙散加減口服治療與對照組比較，眼壓、視力、視野、新生血管情況比較有統(tǒng)計學意義。2組血清提取單核細胞檢測HIF-1a、VEGF、Notch1的蛋白表達情況,結果顯示，治療組的HIF-1a、VEGF、Notch1的蛋白表達明顯低于對照組，且有統(tǒng)計學意義。綜述表明丹梔逍遙散加減治療NVG可以有效控制眼壓，提高視力、視野，促使新生血管消退，是一種安全有效的治療方式，值得臨床推廣應用，其作用機制可能是通過調控HIF/VEGF/Notch信號通路來抑制血管新生的過程，但具體調控機制有待于進一步研究。

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(2016-01-04收稿責任編輯：徐穎)

Clinical Application of Danzhi Xiaoyao Powder in Treating Neovascularglaucoma of Qi Stagnation due to Depression of Liver and Its Mechanism

Duan Yin, Zhang Shuqing, Yu Junyi

(OphthalmologyDepartment,Fourthpeople′shospital,Hengshui053000,China)

Objective: To observe clinical curative effect of Danzhi Xiaoyao Powder in the therapy of ganyu qizhi type of neovascularglaucoma(NVG) and deeply investigate the relationship between this effect and HIF-1/VEGF/Notch1 pathway. Methods: A total of 42 patients NVG were randomly divided into into 2 groups，21 patients in treatment group were treated with modified Danzhi Xiaoyao Powder and iop drugs，21 patients in control group were treated with only iop drugs.Observe the two groups after treatment of 4 weeks, intraocular pressure, visual ，view and new blood vessels.The expression of HIF-1a、VEGF、Notch1 at the protein level was assessed by Western Blot．Results: Significant differences were observed in terms of intraocular pressure, visual, view and new blood vessels (P<0.05). Compared with the control group, the expression of HIF-1a, VEGF, Notch1 level in the treatment group were significantly decreased (P<0.05). Conclusion: Danzhi Xiaoyao Powder in the treatment of NVG may effectively control the intraocular pressure, improve eyesight and restrain new blood vessels. It is a safe and effective treatment, worthy of clinical popularization and application. Its mechanism may be related to the regulation of HIF-1/VEGF/Notch1 signaling pathway.

Danzhi xiaoyao Powder; Qi stagnation due to depression of liver pattern; NVG; HIF-1/VEGF/Notch1 signaling pathway; Clinical effect

衡水市科技局科研項目(編號：14035A)

段穎(1981.03—)，女，大學本科,主治醫(yī)師，研究方向：眼科常見病及多發(fā)病的診斷與治療，E-mail：13315820033@163.com

R242;R246.82

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.07.034