甲烷化抑制劑在微生物電化學(xué)合成乙酸系統(tǒng)中的生物抑制效應(yīng)

戚玉嬌，BRIDIER Arnaud， DESMOND LE QUEMENER Elie，呂　凡，何品晶， BOUCHEZ Théodore

（1同濟(jì)大學(xué)固體廢物處理與資源化研究所，上海 200092；2法國(guó)農(nóng)業(yè)與環(huán)境科技研究所（IRSTEA），巴黎 92761；3住房與城鄉(xiāng)建設(shè)部村鎮(zhèn)建設(shè)司農(nóng)村生活垃圾處理技術(shù)研究與培訓(xùn)中心，上海 200092）

?

甲烷化抑制劑在微生物電化學(xué)合成乙酸系統(tǒng)中的生物抑制效應(yīng)

戚玉嬌1，2，BRIDIER Arnaud2， DESMOND LE QUEMENER Elie2，呂凡1，3，何品晶1，3， BOUCHEZ Théodore2

（1同濟(jì)大學(xué)固體廢物處理與資源化研究所，上海 200092；2法國(guó)農(nóng)業(yè)與環(huán)境科技研究所（IRSTEA），巴黎 92761；3住房與城鄉(xiāng)建設(shè)部村鎮(zhèn)建設(shè)司農(nóng)村生活垃圾處理技術(shù)研究與培訓(xùn)中心，上海 200092）

研究了利用2-溴乙烷磺酸鈉（BES）選擇性抑制產(chǎn)甲烷菌，從而提高微生物電化學(xué)系統(tǒng)合成乙酸產(chǎn)率的可行性，并對(duì)比了BES添加前后陰極室微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明，厭氧混合菌接種物未經(jīng)BES處理時(shí)甲烷是電化學(xué)系統(tǒng)CO2還原的主導(dǎo)產(chǎn)物，最大生成速率達(dá)0.95 mmol·L-1·d-1，8d反應(yīng)時(shí)間甲烷中電子回收率達(dá)55.0%，16S rRNA測(cè)序結(jié)果顯示固態(tài)陰極的主要菌群為Methanobacteriaceae。BES的添加基本抑制了產(chǎn)甲烷菌的活動(dòng)，使得乙酸成為主導(dǎo)產(chǎn)物，其合成速率最高達(dá)2.22 mmol·L-1·d-1，系統(tǒng)總電子回收率達(dá)67.3%。Rhodocyclaceae（15.1%），Clostridiaceae（11.9%）、Comamonadaceae（11.1%）和Sphingobacteriales（11.0%）為主要菌群。研究結(jié)果表明了微生物電化學(xué)合成系統(tǒng)中抑制甲烷生成對(duì)調(diào)控微生態(tài)結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控電化學(xué)終產(chǎn)物的重要性。

微生物電化學(xué)合成系統(tǒng)；二氧化碳還原；乙酸合成；2-溴乙烷磺酸鈉（BES）；甲烷化抑制劑；控制；選擇性；生物過(guò)程

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20151517

引　言

微生物電化學(xué)合成系統(tǒng)（microbial electrosynthesis system，MES）是指以電呼吸微生物作催化劑［1-2］，利用電化學(xué)系統(tǒng)負(fù)蓄勢(shì)陰極［3］產(chǎn)生的電子還原CO2［4-6］或其他基質(zhì)［1］，合成有機(jī)物的體系。這項(xiàng)技術(shù)可高效、清潔地將二氧化碳等廉價(jià)基質(zhì)轉(zhuǎn)換成高價(jià)值有機(jī)化合物或燃料，產(chǎn)物純度高，大幅降低了產(chǎn)物分離的成本。如果將微生物電化學(xué)合成系統(tǒng)與太陽(yáng)能等新能源耦合［4］，可將間歇產(chǎn)生的新能源轉(zhuǎn)化為可以儲(chǔ)藏、運(yùn)輸?shù)牡葍r(jià)液態(tài)有機(jī)物，則更具資源化前景。

電呼吸微生物具備捕獲陰極上的電子并利用其進(jìn)行還原反應(yīng)的能力。此類微生物中，有的能夠直接接受電子，有的通過(guò)其他中介體或者水解反應(yīng)產(chǎn)生的H2間接接收電子［1，7］。迄今為止，多種自養(yǎng)微生物已被證實(shí)可通過(guò)Wood-Ljungdahl途徑還原二氧化碳合成乙酸或其他多碳有機(jī)物，包括Sporomusa ovata［4］、Clostridium ljungdahlii［8］、Clostridium aceticum［8］、Morella thermoacetica［8-9］、Acetobacterium spp.［10］和Marinobacter spp.［11］。

混合菌種也被成功地應(yīng)用于微生物電化學(xué)合成［10，12-14］。但是，混合菌種接種時(shí)，由于甲烷生成的Gibbs反應(yīng)自由能ΔG?=-130 kJ·mol-1）遠(yuǎn)低于乙酸合成的Gibbs反應(yīng)自由能ΔG?=-55 kJ·mol-1）［15］，熱力學(xué)上的優(yōu)勢(shì)使得甲烷相對(duì)其他有機(jī)物優(yōu)先合成。甲烷是氣態(tài)產(chǎn)物，其能量密度遠(yuǎn)低于乙酸等液態(tài)產(chǎn)物。

為了提高乙酸或其他有機(jī)化合物的產(chǎn)率，需首先抑制甲烷的生成［16］。近年來(lái)已報(bào)道的用于去除或者抑制甲烷生成的技術(shù)包括將陰極室暴露于空氣［17］、熱處理、低pH［17］、縮短水力停留時(shí)間［18］和紫外線處理［19］。但是，這些技術(shù)由于難以控制或者在長(zhǎng)期運(yùn)行過(guò)程中容易失效等原因，其應(yīng)用都受到了限制。因此，需要發(fā)展新的、持久有效的方法控制微生物電化學(xué)合成系統(tǒng)中甲烷的生成?；瘜W(xué)抑制劑是可行的有效途徑之一，因?yàn)槠淠軌蚯袛喈a(chǎn)甲烷過(guò)程終端的甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，進(jìn)而競(jìng)爭(zhēng)性抑制產(chǎn)甲烷菌的活動(dòng)［20］。多種特異性甲烷化抑制劑中，2-溴乙烷磺酸鈉（2-bromoethanesulfonate，BES）應(yīng)用得最為廣泛［21］。BES是輔酶M（2-巰基乙烷磺酸，Coenzyme M）的結(jié)構(gòu)類似物，能夠解離已結(jié)合的酶復(fù)合物，并攀附在酶的位置，進(jìn)而抑制產(chǎn)甲烷菌的活動(dòng)［22］。

已有研究證實(shí)，在微生物電化學(xué)合成系統(tǒng)中加入產(chǎn)甲烷菌抑制劑能夠有效地提高乙酸的產(chǎn)率［3，10，23］（表1）。Marshall等［3］對(duì)混合菌種進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)150 d的序批式循環(huán)培養(yǎng)，并在每個(gè)循環(huán)始端加入BES，最終得到微生物電化學(xué)合成系統(tǒng)中最高乙酸產(chǎn)率17.25 mmol·L-1·d-1。但是，抑制劑如何影響電化學(xué)系統(tǒng)中微生物種群結(jié)構(gòu)還處于未知狀態(tài)。

為此，本研究對(duì)比了BES添加前后微生物電化學(xué)合成乙酸系統(tǒng)中微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化，以加深了解電呼吸微生物及其他輔助微生物在電化學(xué)系統(tǒng)中固定二氧化碳合成乙酸所起的作用以及通過(guò)抑制劑調(diào)控微生態(tài)的可行性，為后續(xù)富集特異性合成乙酸的電呼吸微生物提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌種來(lái)源

接種菌種取自法國(guó)巴黎某生活污水處理廠厭氧消化池污泥，并于正式接種前在電化學(xué)系統(tǒng)陰極室預(yù)培養(yǎng)數(shù)月。

1.2微生物電化學(xué)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)裝置和運(yùn)行控制

采用雙室微生物電化學(xué)反應(yīng)器結(jié)構(gòu)，雙室由陽(yáng)離子交換膜（Fumasep?FKE，德國(guó)）隔開，陰極室和陽(yáng)極室總體積均為1.7L，填充1L含8g·L-1的甲烷標(biāo)準(zhǔn)生化潛力測(cè)試培養(yǎng)基（biochemical methane potential，NF EN ISO 11743）。工作電極陽(yáng)極為4cm×4cm碳布（Paxitech?，法國(guó)），通過(guò)珀絲（Heraeus?，0.5mm）與外電路相連；陰極為4cm×4cm不銹鋼平板（Outokumpu?，254SMO，德國(guó)），由不銹鋼軸（DURAN?DU.1200386）連接至外電路。飽和甘汞電極［SCE，+0.24 V vs標(biāo)準(zhǔn)氫電極（SHE）］（Radiometer Analytical，美國(guó)）作為陽(yáng)極室的參考電極。

培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入反應(yīng)器后，先向陰極室通CO2（純度＞99.999%）3min，接著再通N2（純度＞99.999%）7min，以去除體系中的氧氣，提供足量的基質(zhì)，并保證操作過(guò)程中陰極室內(nèi)為正壓。在整個(gè)操作過(guò)程中，每日采取氣體、液體樣品后，再以同樣方式用CO2和N2對(duì)陰極室進(jìn)行吹掃。該生物電化學(xué)系統(tǒng)以間歇模式在35℃±2℃環(huán)境下運(yùn)行，借助磁力攪拌器確保充分混合。整個(gè)操作過(guò)程中陰極室定期加入NaOH（0.5mol·L-1），以保證pH在7.5～8.5范圍內(nèi)。

采用多通道穩(wěn)壓器（BioLogic?，法國(guó)，VMP3，EC-Lab software），實(shí)現(xiàn)操作過(guò)程中所需的電勢(shì)和電流控制。本研究在兩天馴化期后采用恒電流模式（5 A·m-2），以保證恒量的電子供應(yīng)。

本研究中所提供的電勢(shì)，均以標(biāo)準(zhǔn)氫電極（SHE）作為參考。

1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)階段。第1階段（R1）持續(xù)8d，陰極室用前面提及的已經(jīng)預(yù)培養(yǎng)過(guò)的厭氧接種物進(jìn)行接種。第2階段包括兩次重復(fù)試驗(yàn)（R2和R3）。具體操作方法為，R1結(jié)束后，用新的培養(yǎng)基置換70%的原有培養(yǎng)液，并加入10 mmol·L-1的BES，以其特異性抑制產(chǎn)甲烷菌的活動(dòng)。R2同樣持續(xù)8 d，結(jié)束后啟動(dòng)R3，以同樣方法更新陰極培養(yǎng)液以及加入10 mmol·L-1BES。整個(gè)過(guò)程中，電極是陰極微生物唯一的電子來(lái)源，CO2是其唯一碳源。

1.4庫(kù)侖效率計(jì)算

庫(kù)侖效率（coulombic efficiency）亦稱電流效率（current efficiency），是指陰極微生物捕獲電路中的電子將其轉(zhuǎn)化為有機(jī)物的效率，按式（1）計(jì)算，即庫(kù)侖效率等于產(chǎn)物中的電子數(shù)目（Cp）與所消耗的總電子數(shù)目（Ct）之比。

1.5物化指標(biāo)分析

每日采集陰極室的氣體樣品和液體樣品，測(cè)試氣體組分、pH和有機(jī)酸。有機(jī)酸（乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、甲酸、戊酸）測(cè)定采用離子色譜儀（DIONEX DX 120，column IONPAC?ICE-AS1（9×250 mm），美國(guó)），流動(dòng)相為0.4 mmol·L-1七氟酸和5 mmol·L-1四丁基氫氧化銨。氣體組分（O2、N2、CH4、CO2、H2、H2S和N2）采用氣相色譜儀（Varian CP 4900，美國(guó)）測(cè)定。

1.6微生物學(xué)分析

R1和R2結(jié)束后，分別從陰極室采集300 ml懸浮菌液，立即在10000 g條件下離心5 min。離心后底部得到的顆粒經(jīng)液氮急冷處理后，置于-80℃冷凍箱保存，用于后續(xù)分子生物學(xué)分析。同時(shí)刮取收集陰極生物膜，以同樣方式離心、冷凍，并進(jìn)行后續(xù)基因測(cè)序分析。

采用DNA提取試劑盒（Powersoil? DNA isolation kit，MoBio，美國(guó)）提取上述樣品總DNA，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。DNA濃度采用熒光染料（Qubit dsDNA BR assay kits，Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）和Qubit 2.0 Fluorometer 180（Invitrogen，Life Technologies，美國(guó)）進(jìn)行測(cè)定。以樣品總DNA為模板，選用引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）（Eurofins，盧森堡）以及Platinium?Pfx DNA 聚合酶（Invitrogen，Life Technologies，美國(guó)）擴(kuò)增其中的16S SSU rDNA基因V4區(qū)。PCR反應(yīng)利用Mastercycler Pro S thermocycler（Eppendorf，德國(guó)）擴(kuò)增儀，擴(kuò)增條件：94℃，5 min；94℃，15 s；53℃，30 s；68℃，1 min；30個(gè)循環(huán)；68℃，5 min。緊接著，PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并參照擴(kuò)增子文庫(kù)制備方法，利用Agencourt AMPure XP beads kit（Beckman-Coulter，美國(guó)）進(jìn)行純化后，在法國(guó)農(nóng)業(yè)與環(huán)境科技研究所（IRSTEA）的MIMOSE平臺(tái)上完成測(cè)序。

得到16S rRNA序列后，首先采用USEARCH v8.0.1623軟件處理原始序列。將得到的干凈序列用UCHIME［24］篩選嵌合體，并去除嵌合體序列。最后，利用QIIME 1.8.0［25］軟件，與Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)119［26］比對(duì)，將每個(gè)OTU進(jìn)行歸類，得到菌種分類信息。

2　結(jié)果與討論

2.1微生物電化學(xué)系統(tǒng)的乙酸合成效率

如圖1所示，在最初8d的操作過(guò)程中（R1），甲烷是陰極CO2還原的主導(dǎo)產(chǎn)物，平均產(chǎn)率為0.41 mmol·L-1·d-1，并在第4天達(dá)到最高產(chǎn)率0.95 mmol·L-1·d-1。R1末期，甲烷累積量達(dá)3.18 mmol，甲烷中累積庫(kù)侖量為所消耗總電量的55.0%（圖2）。

加入BES后進(jìn)入R2反應(yīng)周期，產(chǎn)甲烷活動(dòng)立即停止，H2從第2天開始生成，平均產(chǎn)率達(dá)0.90mmol·L-1·d-1，最高產(chǎn)率達(dá)1.59 mmol·L-1·d-1；8 d運(yùn)行期結(jié)束后H2累積量達(dá)4.5 mmol·L-1。乙酸的合成滯后于氫氣的生成，但從第5天開始乙酸合成率迅速增至0.61 mmol·L-1·d-1，之后逐漸達(dá)到最高合成率0.78 mmol·L-1·d-1。R2末期，累計(jì)生成3.11 mmol·L-1乙酸，該階段乙酸平均產(chǎn)率達(dá)0.42 mmol·L-1·d-1。在此過(guò)程中體系中也有微量的甲酸生成，但迅速被轉(zhuǎn)化。R2結(jié)束時(shí)，52%的電子流向乙酸，19%的電子流向氫氣，這兩種產(chǎn)物總的庫(kù)侖效率高達(dá)71%。

圖1　微生物電化學(xué)合成系統(tǒng)中甲烷、氫氣、甲酸和乙酸的生成量Fig.1　Production of methane， hydrogen， formate and acetate in R1， R2 and R3

圖2　消耗總電量、產(chǎn)物回收電量［甲烷、氫氣及VFA（揮發(fā)性脂肪酸）］和總還原產(chǎn)物的庫(kù)侖效率Fig.2　Distribution of electrons in products （methane，hydrogen， VFAs） compared to total electrons consumed

作為R2的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，R3反應(yīng)周期在甲烷抑制和乙酸生成方面表現(xiàn)出相似的行為。H2從第3天開始以穩(wěn)定的產(chǎn)率0.6 mmol·L-1·d-1生成，并在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诶鄯e至4 mmol·L-1。與R2類似，乙酸的生成從第4天開始加速，并在第7天達(dá)到最大產(chǎn)率2.22mmol·L-1·d-1，9 d運(yùn)行期結(jié)束后累積量達(dá)2.98mmol·L-1。該階段乙酸平均產(chǎn)率為0.33mmol·L-1·d-1，與R2中平均產(chǎn)率相近（圖1）。乙酸中累積庫(kù)侖量達(dá)47%，相對(duì)應(yīng)地氫氣中的累積庫(kù)侖量為17%。

由上可知，混合菌種經(jīng)BES處理后，產(chǎn)甲烷菌被有效抑制，乙酸成為主導(dǎo)產(chǎn)物，氫氣為次要產(chǎn)物。R2和R3表現(xiàn)一致，反映了體系的運(yùn)行穩(wěn)定和可持續(xù)性。兩組實(shí)驗(yàn)中，乙酸平均產(chǎn)率為0.37 mmol·L-1·d-1（相當(dāng)于13.9 g·m-2·d-1，其中單位面積產(chǎn)率以單位電極面積為基準(zhǔn)），最高產(chǎn)率達(dá)2.22 mmol·L-1·d-1（83.3 g·m-2·d-1）。

2.2本研究與已有文獻(xiàn)報(bào)道的乙酸合成效率對(duì)比

純種接種時(shí)，一般庫(kù)侖效率很高，但是乙酸產(chǎn)率低。混合菌接種時(shí)，在不采用任何產(chǎn)甲烷菌抑制劑的條件下也很難達(dá)到高的乙酸產(chǎn)率。如表1所示，相比之下，本研究及文獻(xiàn)報(bào)道采用甲烷化抑制劑［3，10，23，27-28］的乙酸產(chǎn)率明顯更高。比較結(jié)果顯示抑制甲烷生成能明顯地提高乙酸的產(chǎn)率。因此，如何有效抑制甲烷生成是提高微生物電化學(xué)合成系統(tǒng)能量回收率的關(guān)鍵因素。

2.3微生物群落結(jié)構(gòu)分析

R1和R2反應(yīng)周期結(jié)束后，陰極室懸浮液與陰極表面上的微生物群落結(jié)構(gòu)如圖3和圖4所示，其中微生物的豐度比例均以總的所測(cè)序列數(shù)為基準(zhǔn)。

在門水平上（圖3），R1中相對(duì)豐度最高的是Euryarchaeota。Euryarchaeota在陰極表面的微生物群落中約占54.1%，在懸浮菌液中約占21.1%。接下來(lái)較豐富的菌種依次為Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes和Spirochaetae。在菌屬水平上（圖4），氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌Methanobacteriaceae為最主要的菌群，其比例在陰極電極膜微生物群落中達(dá)54.1%，在懸浮液微生物群落中達(dá)21.0%。顯而易見，Methanobacteriaceae更傾向于附著在電極上，這種現(xiàn)象與另一聚焦于陰極生成甲烷的研究結(jié)果相符［10］。Cheng等［30］認(rèn)為產(chǎn)甲烷菌能直接從電極上獲得電子產(chǎn)甲烷。本研究中Methanobacteriaceae也是更傾向于在電極上富集生長(zhǎng)。

R2反應(yīng)末期，乙酸合成占主導(dǎo)，相對(duì)應(yīng)地微生物群落的結(jié)構(gòu)組成發(fā)生了明顯的變化。產(chǎn)甲烷菌失去了其主導(dǎo)地位，Methanobacteriaceae序列的比例從R1中的21.0%降至7.6%（懸浮液中）。相反地，Proteobacteria門成為豐度最高的菌門（比例高達(dá)43.6%），其次是Firmicutes門（比例為22.3%）。

表1　R與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的乙酸合成效率對(duì)比Table 1　Comparative overview of autotrophic acetate production in microbial electrosynthesis

圖3　R1和R2中古菌和細(xì)菌群體門水平分布Fig.3　Hierarchical cluster analysis of archaeal and bacterial community at electrode and in bulk of R1 and in bulk of R2 at phylum level

圖4　R1和R2中古菌和細(xì)菌群體科水平分布Fig.4　Hierarchical cluster analysis of archaeal and bacterial community at electrode and in bulk of R1 and in bulk of R2 at family level

從R1到R2，即加入BES后，屬于Clostridiales目的細(xì)菌數(shù)目從11.7%增至18.9%。在Clostridiales目下，屬于Clostridiaceae的菌種在R1中數(shù)量幾乎為0，但在R2中其比例激增至11.9%。Clostridiaceae新陳代謝方式多樣，包括很多被熟知的同型產(chǎn)乙酸菌［31］，例如Clostridium aceticum、Clostridiumthermoaceticum為最早被證明有能力利用H2和CO2合成乙酸的同型產(chǎn)乙酸菌［32］。Clostridium ljungdahlii在多個(gè)MES系統(tǒng)中利用CO2通過(guò)乙酰CoA途徑合成乙酸，電子利用率高達(dá)80%［8］，并且該菌可被基因修改，進(jìn)而合成比乙酸更有價(jià)值的有機(jī)物，如石油替代物丁醇［33］，因而被認(rèn)定為最有潛力用于大規(guī)模合成生物燃料的備選菌種。另外，Clostridium autoethanogenum可利用CO合成乙醇［34］，Clostridium carboxidivorans也被證明可生物合成乙酸、乙醇、丁酸和丁醇［35］。因此，加入BES后比例迅速增大的Clostridiaceae是MES中接受陰極電子、還原CO2為乙酸的主要功能微生物。Family_Ⅺ也是屬于Clostridiales的菌種，數(shù)量從7.5%降至2.3%。這意味著在Clostridiales目下Clostridiaceae取代了Family_Ⅺ，對(duì)產(chǎn)甲烷菌抑制劑BES的加入做出了響應(yīng)。本研究中，Clostridailes的比例小于其他類似的微生物電化學(xué)產(chǎn)乙酸系統(tǒng)，如Patil等［28］報(bào)道在以乙酸為主導(dǎo)產(chǎn)物的陰極上屬于Clostridiales菌種的比例占微生物總量的77%。這是因?yàn)楸狙芯恐屑尤氘a(chǎn)甲烷抑制劑后混合菌種的培養(yǎng)僅持續(xù)了8 d，微生物群落還未完全完成更替演變。另外，本研究中并未發(fā)現(xiàn)其他一些熟知的同步產(chǎn)乙酸菌，如Sporomusa spp.、Acetobacterium spp.和Morella spp.以極微小的量存在（＜1%），尤其是Acetobacterium spp.［10，23］曾被多次證明為乙酸產(chǎn)生時(shí)出現(xiàn)的主要菌種。這說(shuō)明微生物合成體系中主要的產(chǎn)乙酸菌取決于不同的初始接種物和運(yùn)行條件。

加入產(chǎn)甲烷菌抑制劑后，伴隨著Clostridiales數(shù)目的增加，另外一種屬于Comamonadaceae科的菌種Hydrophaga spp.的比例也大幅增長(zhǎng)（3.3%到11.1%）。R2樣品中的Hydrogeophaga與Hydrogenophaga intermedia菌株（NCBI號(hào)：NR_114129.1）有著98%的相似度。Hydrogenophaga spp.被證明是一類新的氫氧化自養(yǎng)細(xì)菌，其多數(shù)菌種可以還原硝酸鹽和亞硝酸鹽，例如Hydrogenophaga pseudoflava和Hdrogenophaga taeniospiralis［36］。另外，屬于Sphingobacteriales目的未培養(yǎng)菌種WCHB1-69在產(chǎn)甲烷菌抑制劑加入前后均以不可忽略的數(shù)目存在，其在R1和R2懸浮液微生物群落中的比例分別為11.3%和11.0%。Sphingobacterials常見于厭氧反應(yīng)器，與產(chǎn)氫細(xì)菌有著很高的相似度。有研究假設(shè)此類細(xì)菌可捕獲陰極電子生成氫氣，供產(chǎn)甲烷菌和產(chǎn)乙酸菌使用［10］。Thrash等［37］在其研究中證明某些微生物可通過(guò)氫氣的生成從陰極間接接受電子。因此R2中Hydrogenophaga spp.和WCHB1-69的共存有可能扮演著從陰極表面?zhèn)鬟f電子至電子受體的角色。

另外一種在R1和R2中都存在的菌種Rhodocyclaceae（比例分別為15.3% 和15.1%），主要以Azoarcus spp. （99%的相似度，NCBI號(hào)：NR_074801.1）的形式存在。Azoarcus spp.以顯著數(shù)量存在的情況與之前某一空氣陰極生物燃料電池相似，該電池陽(yáng)極中該菌比例達(dá)42%，陰極中達(dá)47%［38］。Azoarcusspp.是一類在土壤或污水中常見的固氮微生物，能夠利用硝酸鹽作電子受體降解多種有機(jī)物［39］。但是，本研究由于并未分析含氮物質(zhì)（4NH+，2NO-和3NO-）濃度變化，并不能推斷此菌種是否參與體系中的生物合成。另外，Desulfovibrionaceae也同時(shí)存在于R1和R2中（5.0% vs 4.7%），此類細(xì)菌是最為熟知的能夠還原硫的細(xì)菌，在環(huán)境樣品中很常見［40］。這兩類菌種可能來(lái)源于接種物。

另外兩種屬于Synergistaceae的菌種Aminiphilus spp.和Aminivibrio spp.，也在產(chǎn)甲烷菌抑制劑加入后數(shù)量有明顯增加，Spirochaetaceae數(shù)量也有所增加（從0.2%增至5.2%）。這些改變有可能與乙酸的合成密切相關(guān)，但其具體貢獻(xiàn)尚待進(jìn)一步研究。

3　結(jié)　論

采用兩段實(shí)驗(yàn)法探究了微生物電化學(xué)系統(tǒng)中利用混合菌種作生物催化劑還原CO2合成乙酸的現(xiàn)象。第1階段，采用未經(jīng)處理的混合菌種接種，甲烷作為唯一產(chǎn)物，產(chǎn)率高達(dá)0.95 mmol·L-1·d-1，最終甲烷中的電子回收率達(dá)55%。16S rRNA 測(cè)序結(jié)果顯示Methanobacteriaceae為主導(dǎo)菌群，其比例在電極表面微生物菌群中達(dá)54.1%，在懸浮液菌群中達(dá)21.0%。第2階段，體系中加入BES以抑制產(chǎn)甲烷菌的活動(dòng)。BES的加入有效阻斷了產(chǎn)甲烷菌的活動(dòng)，體系還原CO2合成乙酸和氫氣最高產(chǎn)率分別為2.2 mmol·L-1·d-1和1.59 mmol·L-1·d-1。與主導(dǎo)產(chǎn)物的變化相對(duì)應(yīng)，微生物群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生了明顯的變化。屬于Clostridiaceae的細(xì)菌從0增至11.9%。Comamonadaceae科下的Hydrogenophaga spp.和一個(gè)屬于Sphingobacterials的未經(jīng)培養(yǎng)菌種WCHB1-69僅在第2階段共存，這兩類菌種協(xié)同作用，有可能參與乙酸合成過(guò)程中從陰極表面到電子受體的電子傳導(dǎo)。Clostridiaceae、Hydrogenophaga spp.和WCHB1-69這3類菌種與陰極中主導(dǎo)產(chǎn)物從甲烷到乙酸的變化密切相關(guān)。由此可見，微生物種群結(jié)構(gòu)以及不同菌種之間的相互關(guān)系直接決定了體系的效率和產(chǎn)率。而且，抑制產(chǎn)甲烷作用對(duì)促進(jìn)其他產(chǎn)物生成非常關(guān)鍵，一旦產(chǎn)甲烷菌被抑制，產(chǎn)甲烷菌數(shù)量下降，就能隨之富集同型產(chǎn)乙酸菌，進(jìn)而建立一個(gè)可高效產(chǎn)乙酸的微生物合成體系。

符號(hào)說(shuō)明

b ——產(chǎn)物的摩爾轉(zhuǎn)換系數(shù)，乙酸的摩爾轉(zhuǎn)換系數(shù)為8 eq·mol-1，甲烷的摩爾轉(zhuǎn)換系數(shù)為 8 eq·mol-1，甲酸的摩爾轉(zhuǎn)換系數(shù)為 2 eq·mol-1，氫氣的摩爾轉(zhuǎn)換系數(shù)為 2 eq·mol-1

——產(chǎn)物i中的電子數(shù)目，pCFbn=

Ct——所消耗的總電子數(shù)目，通過(guò)電流-時(shí)間（i-t）曲

線獲得

F ——法拉第常數(shù)，96485 C·mol-1

n ——產(chǎn)物的摩爾數(shù)

References

［1］RABAEY K， ROZENDAL R A. Microbial electrosynthesis—revisiting the electrical route for microbial production ［J］. Nature Reviews Microbiology， 2010， 8 （10）：706-716.

［2］ROSENBAUM M A， FRANKS A E. Microbial catalysis in bioelectrochemical technologies： status quo， challenges and perspectives ［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2014， 98（2）： 509-518.

［3］MARSHALL C W， ROSS D E， FICHOT E B， et al. Long-term operation of microbial electrosynthesis systems improves acetate production by autotrophic microbiomes ［J］. Environmental Science & Technology， 2013， 47 （11）： 6023-6029.

［4］NEVIN K P， WOODARD T L， FRANKS A E， et al. Microbial electrosynthesis： feeding microbes electricity to convert carbon dioxide and water to multicarbon extracellular organic compounds ［J］. mBio， 2010， 1 （2）： e00103-10.

［5］VAN EERTEN-JANSEN M C A A， TER HEIJNE A， BUISMAN C J N， et al. Microbial electrolysis cells for production of methane from CO2： long-term performance and perspectives ［J］. International Journal of Energy Research， 2012， 36 （6）： 809-819.

［6］SOUSSAN L， RIESS J， ERABLE B， et al. Electrochemical reduction of CO2catalysed by Geobacter sulfurreducens grown on polarized stainless steel cathodes ［J］. Electrochemistry Communications， 2013：2827-2830.

［7］LOVLEY D R. Powering microbes with electricity： direct electron transfer from electrodes to microbes ［J］. Environmental Microbiology Reports， 2011， 3 （1）：27-35.

［8］NEVIN K P， HENSLEY S A， FRANKS A E， et al. Electrosynthesis of organic compounds from carbon dioxide is catalyzed by a diversity of acetogenic microorganisms ［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2011， 77 （9）： 2882-2886.

［9］SONG J， KIM Y， LIM M， et al. Microbes as electrochemical CO2conversion catalysts ［J］. ChemSuschem， 2011， 4 （5）： 587-590.

［10］MARSHALL C W， ROSS D E， FICHOT E B， et al. Electrosynthesis of commodity chemicals by an autotrophic microbial community ［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2012，78 （23）： 8412-8420.

［11］WANG Z， LEARY D H， MALANOSKI A P， et al. A previously uncharacterized， nonphotosynthetic member of the chromatiaceae is the primary CO2-fixing constituent in a self-regenerating biocathode［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2015， 81 （2）： 699-712.

［12］JIANG Y， SU M， ZHANG Y， et al. Bioelectrochemical systems for simultaneously production of methane and acetate from carbon dioxide at relatively high rate ［J］. International Journal of Hydrogen Energy， 2013， 38 （8）： 3497-3502.

［13］JOURDIN L， FREGUIA S， DONOSE B C， et al. A novel carbon nanotube modified scaffold as an efficient biocathode material for improved microbial electrosynthesis ［J］. Journal of Materials Chemistry A， 2014， 2 （32）： 13093-13102.

［14］ZAYBAK Z， PISCIOTTA J M， TOKASH J C， et al. Enhanced start-up of anaerobic facultatively autotrophic biocathodes in bioelectrochemical systems ［J］. Journal of Biotechnology， 2013， 168（4）： 478-485.

［15］KOTSYURBENKO O R， GLAGOLEV M V， NOZHEVNIKOVA A N， et al. Competition between homoacetogenic bacteria and methanogenic archaea for hydrogen at low temperature ［J］. Fems Microbiology Ecology， 2001， 38 （2-3）： 153-159.

［16］CHAE K J， CHOI M J， KIM K Y， et al. Selective inhibition of methanogens for the improvement of biohydrogen production in microbial electrolysis cells ［J］. International Journal of Hydrogen Energy， 2010， 35 （24）： 13379-13386.

［17］CALL D， LOGAN B E. Hydrogen production in a single chamber microbial electrolysis cell lacking a membrane ［J］. Environmental Science & Technology， 2008， 42 （9）： 3401-3406.

［18］WANG A J， LIU W Z， CHENG S A， et al. Source of methane and methods to control its formation in single chamber microbial electrolysis cells ［J］. International Journal of Hydrogen Energy， 2009，34 （9）： 3653-3658.

［19］HOU Y P， LUO H P， LIU G L， et al. Improved hydrogen production in the microbial electrolysis cell by inhibiting methanogenesis using ultraviolet irradiation ［J］. Environmental Science & Technology， 2014，48 （17）： 10482-10488.

［20］LIU H， WANG J， WANG A J， et al. Chemical inhibitors of methanogenesis and putative applications ［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2011， 89 （5）： 1333-1340.

［21］ZHUANG L， CHEN Q， ZHOU S G， et al. Methanogenesis control using 2-bromoethanesulfonate for enhanced power recovery from sewage sludge in air-cathode microbial fuel cells ［J］. International Journal of Electrochemical Science， 2012， 7 （7）： 6512-6523.

［22］ZHU H G， BELAND M. Evaluation of alternative methods of preparing hydrogen producing seeds from digested wastewater sludge［J］. International Journal of Hydrogen Energy， 2006， 31 （14）：1980-1988.

［23］SU M， JIANG Y， LI D. Production of acetate from carbon dioxide in bioelectrochemical systems based on autotrophic mixed culture ［J］. Journal of Microbiology and Biotechnology， 2013， 23 （8）： 1140-1146.

［24］EDGAR R C， HAAS B J， CLEMENTE J C， et al. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection ［J］. Bioinformatics， 2011，27 （16）： 2194-2200.

［25］CAPORASO J G， KUCZYNSKI J， STOMBAUGH J， et al. QIIMEallows analysis of high-throughput community sequencing data ［J］. Nature Methods， 2010，7 （5）： 335-336.

［26］QUAST C， PRUESSE E， YILMAZ P， et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project： improved data processing and web-based tools ［J］. Nucleic Acids Research， 2013， 41 （D1）： D590-D596.

［27］MODESTRA J A， NAVANEETH B， MOHAN S V. Bio-electrocatalytic reduction of CO2： enrichment of homoacetogens and pH optimization towards enhancement of carboxylic acids biosynthesis ［J］. Journal of CO2Utilization， 2015， 10： 78-87.

［28］PATIL S A， ARENDS J B A， VANWONTERGHEM I， et al. Selective enrichment establishes a stable performing community for microbial electrosynthesis of acetate from CO2［J］. Environmental Science & Technology， 2015， 49 （14）： 8833-8843.

［29］BAJRACHARYA S， TER HEIJNE A， BENETTON X D， et al. Carbon dioxide reduction by mixed and pure cultures in microbial electrosynthesis using an assembly of graphite felt and stainless steel as a cathode ［J］. Bioresource Technology， 2015， 195： 14-24.

［30］CHENG S A， XING D F， CALL D F， et al. Direct biological conversion of electrical current into methane by electromethanogenesis［J］. Environmental Science & Technology， 2009， 43 （10）： 3953-3958.

［31］LEE C， KIM J， SHIN S G， et al. Monitoring bacterial and archaeal community shifts in a mesophilic anaerobic batch reactor treating a high-strength organic wastewater ［J］. Fems Microbiology Ecology，2008， 65 （3）： 544-554.

［32］DIEKERT G， WOHLFARTH G. Metabolism of homoacetogens ［J］. Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology， 1994， 66 （1/2/3）： 209-221.

［33］KOPKE M， HELD C， HUJER S， et al. Clostridium ljungdahlii represents a microbial production platform based on syngas ［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2010， 107 （29）： 13087-13092.

［34］ABRINI J， NAVEAU H， NYNS E J. Clostridium autoethanogenum，sp. nov， an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbonmonoxide ［J］. Archives of Microbiology， 1994， 161 （4）： 345-351.

［35］LIOU J S C， BALKWILL D L， DRAKE G R， et al. Clostridium carboxidivorans sp nov.， a solvent-producing clostridium isolated from an agricultural settling lagoon， and reclassification of the acetogen Clostridium scatologenes strain SL1 as Clostridium drakei sp nov. ［J］. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2005， 55： 2085-2091.

［36］WILLEMS A， BUSSE J， GOOR M， et al. Hydrogenophaga， a new genus of hydrogen-oxidizing bacteria that includes Hydrogenophagaflava comb. nov. （formerly pseudomonas-flava）， Hydrogenophaga-Palleronii （formerly Pseudomonas palleronii）， Hydrogenophaga Pseudoflava （formerly Pseudomonas pseudoflava and “Pseudomonascarboxydoflava”）， and Hydrogenophaga taeniospiralis （formerly Pseudomonas taeniospiralis） ［J］. International Journal of Systematic Bacteriology， 1989， 39 （3）： 319-333.

［37］THRASH J C， VAN TRUMP J I， WEBER K A， et al. Electrochemical stimulation of microbial perchlorate reduction ［J］. Environmental Science & Technology， 2007， 41 （5）： 1740-1746.

［38］SHEHAB N， LI D， AMY G L， et al. Characterization of bacterial and archaeal communities in air-cathode microbial fuel cells， open circuit and sealed-off reactors ［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，2013， 97 （22）：9885-9895.

［39］REINHOLDHUREK B， HUREK T， GILLIS M， et al. Azoarcus gen. nov.， nitrogen-fixing proteobacteria associated with roots of kallar grass （Leptochloa fusca （L.） Kunth）， and description of two species，Azoarcus indigens sp. nov. and Azoarcus communis sp. nov. ［J］. International Journal of Systematic Bacteriology， 1993， 43 （3）：574-584.

［40］WARREN Y A， CITRON D M， MERRIAM C V， et al. Biochemical differentiation and comparison of desulfovibrio species and other phenotypically similar genera ［J］. Journal of Clinical Microbiology，2005， 43 （8）： 4041-4045.

Selective inhibition of methanogens using 2-bromoethanesulfonate for improvement of acetate production from CO2in bioelectrochemical systems

QI Yujiao1，2， BRIDIER Arnaud2， DESMOND LE QUEMENER Elie2， Lü Fan1，3，HE Pinjing1，3， BOUCHEZ Théodore2
（1Institute of Waste Treatment and Reclamation， Tongji University， Shanghai 200092， China；2Irstea， UR HBAN， 1 rue Pierre-Gilles de Gennes CS10030， 92761 Antony cedex， France；3Centre for the Technology Research and Training on Household Waste in Small Towns & Rural Area， Ministry of Housing and Urban-Rural Development of PR. China （MOHURD）， Shanghai 200092， China）

In this study， the specific reduction of CO2to acetate in presence of methanogenesis inhibitor 2-bromoethanesulfonate （BES） was studied in a bio-electrochemical system （BES） via a two stage experimental design. During first stage using untreated mixed anaerobic consortia， the methanogenesis was dominated and the CO2reduction yielded methane at the maximum rate of 0.95 mmol·L-1·d-1at nearly 55.0% coulombic recovery. Sequences belonging to the family Methanobacteriaceae were dominant at the cathodic electrode. During second stage， BES addition selectively suppressed the growth of methanogens， which resulted in a shift of the dominant activity to acetogenesis with the maximum production rate of 2.22 mmol·L-1·d-1with a recovery of 67.3% of electrons in acetate and hydrogen after two duplicates. The main populations were Rhodocyclaceae （15.1%），Clostridiaceae （11.9%）， Comamonadaceae （11.1%） and Sphingobacteriales （11.0%）. This study highlighted the importance of inhibition of methanogenesis to manoeuvre microbial structures， which decided the final product profiles during a microbial electro synthesis operation.

date： 2015-10-08.

BOUCHEZ Théodore， theodore.bouchez@ irstea.fr； Prof. HE Pinjing， solidwaste@#edu.cn

supported by the French Investissement d'Avenir Program （ANR-10-BTBR-02）， the National Natural Science Foundation of China （21177096， 51378375）， and the 111 Program.

microbial electrosynthesis systems （MES）； carbon dioxide reduction； acetogenesis； 2-bromoethanesulfonate（BES）； methanogenesis inhibition； control； selectivity； boiprocess

TQ 151.5+2

A

0438—1157（2016）05—2033—08

2015-10-08收到初稿，2015-11-26收到修改稿。

聯(lián)系人：BOUCHEZ Théodore，何品晶。第一作者：戚玉嬌（1991—），女，碩士研究生。

法國(guó)國(guó)家科研署基金項(xiàng)目（BIORARE，ANR-10-BTBR-02）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21177096，51378375）；111引智項(xiàng)目。