天然產(chǎn)物oblongifolin C誘導(dǎo)ROS和線粒體降解

程　敏　許　瑋　劉　磊　謝偉東　徐宏喜　許乃寒*

(1 清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京，100084； 2 清華大學(xué)深圳研究生院生命與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳，518055；3 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海，201203； 4 中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)上海高校工程研究中心，上海，201203)

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天然產(chǎn)物oblongifolin C誘導(dǎo)ROS和線粒體降解

程敏1許瑋1劉磊1謝偉東2徐宏喜3,4許乃寒2*

(1 清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京，100084； 2 清華大學(xué)深圳研究生院生命與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳，518055；3 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海，201203； 4 中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)上海高校工程研究中心，上海，201203)

目的：探討藤黃屬植物中提取的多環(huán)多異戊烯基間苯三酚類天然小分子化合物oblongifolin C(OC)對(duì)細(xì)胞線粒體功能和細(xì)胞凋亡的影響。方法：以野生型和促凋亡基因bax/bak雙敲除的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF和人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116為研究模型，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，共聚焦顯微術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)OC對(duì)ROS，線粒體功能和細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果：OC能夠誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS，破壞線粒體結(jié)構(gòu)，降低線粒體膜電位，最終造成線粒體降解和細(xì)胞內(nèi)ATP耗竭，使細(xì)胞走向凋亡。結(jié)論：OC能通過(guò)多條途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是一種極有抗癌潛力的天然化合物。

藤黃；Oblongifolin C；ROS；線粒體；凋亡

Oblongifolin C(OC)是藤黃屬植物中提取的一類多環(huán)多異戊烯基間苯三酚化合物，具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力[6]。研究發(fā)現(xiàn)OC是一種新型的自噬抑制劑，能夠抑制自噬溶酶體的形成和溶酶體組織蛋白酶Cathepsin B和Cathepsin D的表達(dá)和活性，從而降低腫瘤細(xì)胞對(duì)饑餓的耐受力[7]。此外，OC還能引起DNA雙鏈斷裂損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子CHOP的表達(dá)并激活JNK蛋白激酶活性，誘導(dǎo)不依賴促凋亡蛋白Bax和Bak的細(xì)胞凋亡[8]。本研究深入探討了OC對(duì)線粒體功能的影響，為從天然產(chǎn)物中篩選抗腫瘤新藥的研究提供了科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞系野生型(WT)及bax/bak基因雙敲除(DKO)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF和人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116由英國(guó)Beatson癌癥研究所Kevin Ryan教授提供。

1.1.2試劑與儀器Dulbecco modified Eagle medium(DMEM)高糖培養(yǎng)基，RPMI1640培養(yǎng)基，青霉素-鏈霉素(penicillin-streptomycin)溶液購(gòu)自Gibco/Invitrogen公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自PAA Laboratories GmbH公司；Oblongifolin C(OC)由上海中醫(yī)藥大學(xué)徐宏喜教授提供；ATP檢測(cè)試劑盒，線粒體探針MitoTracker和Rho123購(gòu)自Molecular Probes公司；COXIV抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗體購(gòu)自Proteintech公司；HRP偶聯(lián)的二抗以及ECL顯色液購(gòu)自KPL公司；流式細(xì)胞儀BD InfluxTM購(gòu)自美國(guó)BD公司；共聚焦顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理野生型和bax/bak-/-MEF和HCT116細(xì)胞分別用加有10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基和RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置放于含有5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到培養(yǎng)板的80%左右時(shí)，用0.25%胰酶-EDTA溶液消化細(xì)胞，按合適比例種到細(xì)胞培養(yǎng)板中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)?；衔颫C用DMSO溶解配置成10 mM母液，藥物使用終濃度為15 μM處理24 h(特殊說(shuō)明情況除外)。Caspase抑制劑Z-VAD-FMK和Ac-LETD-CHO的使用濃度為50 μM處理24 h。

1.2.2共聚焦顯微鏡試驗(yàn)將對(duì)照組細(xì)胞和藥物處理過(guò)的MEF細(xì)胞用線粒體熒光染料MitoTracker Red CMXRos(50 M)在常溫染色20 min，然后用PBS漂洗細(xì)胞2次除去染料。在Olympus共聚焦顯微鏡下觀察線粒體的形態(tài)并拍照。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)線粒體數(shù)量用MitoTracker Green FM檢測(cè)，線粒體膜電勢(shì)用Rh123檢測(cè)。分別收集對(duì)照組細(xì)胞和藥物處理過(guò)的MEF細(xì)胞懸液用線粒體熒光染料MitoTracker Green FM(50 M)，Rh123(10 M)，或者DCFH-DA(10 M)在常溫下避光染色30 min，然后用PBS漂洗細(xì)胞2次，用BD InfluxTM流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4細(xì)胞ATP水平檢測(cè)ATP水平用ATP檢測(cè)試劑盒(Molecular Probes)測(cè)定，將一定體積含有熒光素酶的反應(yīng)試劑放在黑色96孔板中，加入細(xì)胞懸液開始反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.5蛋白質(zhì)免疫印跡將藥物處理過(guò)的MEF或者HCT116細(xì)胞樣品收集后用裂解液(50 mMTriseHCl，pH 8.0，4M urea and 1% Triton X-100)進(jìn)行裂解收集總蛋白，用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。以濃度為12%的SDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠電泳對(duì)樣品進(jìn)行蛋白的分離，然后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上。用5%脫脂奶粉/TBST(含0.2%Tween-20的TBS溶液)在室溫下封閉1 h，然后分別加入COXIV和內(nèi)參GAPDH抗體室溫孵育2 h。用TBST溶液洗膜后加入HRP偶聯(lián)的二抗室溫孵育1 h后，加入適量ECL化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)1 min后用X膠片進(jìn)行曝光，顯影和定影。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究中所有的試驗(yàn)均進(jìn)行了3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，利用非配對(duì)的雙尾t檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性差異分析，當(dāng)P值<0.05時(shí)顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以*表示。

2　結(jié)果

2.1化合物OC誘導(dǎo)細(xì)胞ROS增多本研究用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)活性氧的檢測(cè)。DCFH-DA本身沒(méi)有熒光，進(jìn)入細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無(wú)熒光的探針使之發(fā)出熒光。如圖1所示，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明OC處理MEF細(xì)胞1 h，2 h，4 h后細(xì)胞內(nèi)活性氧水平明顯增加。因此，本研究推測(cè)OC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能與細(xì)胞內(nèi)活性氧的增多有關(guān)。

圖1　流式細(xì)胞試驗(yàn)檢測(cè)OC對(duì)MEF細(xì)胞ROS的影響

2.2MitoTracker Red染色觀察OC導(dǎo)致細(xì)胞線粒體腫脹變形及膜電位降低活性氧的產(chǎn)生與線粒體損傷密切相關(guān)。為了研究天然化合物OC對(duì)線粒體的影響，筆者用線粒體熒光染料MitoTracker Red分別對(duì)野生型(WT)和bax/bak-/-(DKO)型MEF和HCT116細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞染色。如圖2A所示，對(duì)照組野生型細(xì)胞表現(xiàn)為明顯的長(zhǎng)線狀或卷曲線狀線粒體。促凋亡蛋白Bax和Bak的缺失對(duì)線粒體形狀有較大的影響，線粒體斷裂較顯著，但仍然能夠看到線形線粒體形態(tài)。而在15 M OC處理8 h的細(xì)胞中，線粒體則腫脹斷裂呈小球狀。上述結(jié)果提示，OC可以影響線粒體的動(dòng)態(tài)變化，破壞線粒體的形態(tài)。

線粒體形態(tài)的變化預(yù)示著膜電位的下降和線粒體通透性的改變，因此作者用Rh123結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)了OC對(duì)線粒體膜電位的影響。如圖2B所示，在OC處理的野生型和bax/bak基因雙敲除細(xì)胞中。線粒體膜電位均顯著降低。

圖2　A.OC引起線粒體腫脹斷裂并降低線粒體膜電位;B.OC降低線粒體膜電位

2.3OC導(dǎo)致細(xì)胞線粒體數(shù)量減少為確定OC對(duì)線粒體數(shù)量的影響，筆者用MitoTracker Green FM標(biāo)記線粒體并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體數(shù)量。有報(bào)道稱蛋白酶體抑制劑MG132能誘導(dǎo)線粒體降解導(dǎo)致線粒體數(shù)量減少，因此，本文用MG132作為本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照。如圖3所示，流式細(xì)胞結(jié)果顯示OC(15 M)或者M(jìn)G132(25 M)處理細(xì)胞24 h后MitoTracker Green FM的曲線明顯向左偏移，提示線粒體數(shù)量減少(n=3，*P<0.05)；OC導(dǎo)致的線粒體數(shù)量的減少與Bax和Bak蛋白的缺失沒(méi)有明顯的相關(guān)性。因此上述結(jié)果表明OC不僅破壞線粒體的形態(tài)，也會(huì)造成線粒體數(shù)量的減少。

圖3　OC處理細(xì)胞后細(xì)胞中線粒體的數(shù)量顯著減少

2.4OC導(dǎo)致線粒體蛋白降解和ATP水平降低為了進(jìn)一步驗(yàn)證OC對(duì)線粒體的影響，Western blot檢測(cè)了線粒體內(nèi)膜蛋白細(xì)胞色素c氧化酶亞基IV(COXIV)的表達(dá)水平。如圖4A所示，OC(15 M)處理野生型和bax/bak雙基因敲除的MEF細(xì)胞24 h后，細(xì)胞樣品中COXIV蛋白含量顯著降低，而內(nèi)參蛋白GAPDH的表達(dá)不受OC的影響。上述結(jié)果提示，OC能直接誘導(dǎo)線粒體的降解從而使線粒體數(shù)量減少。

線粒體是細(xì)胞的能量代謝中心，筆者檢測(cè)了OC對(duì)細(xì)胞內(nèi)ATP水平的影響。野生型和雙敲除MEF細(xì)胞分別用5，10，20 M OC處理24 h后檢測(cè)ATP，檢測(cè)結(jié)果用細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量做歸一化處理。如圖4B所示，OC顯著降低細(xì)胞內(nèi)ATP水平，低濃度OC(5 M)就能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)量下降60%以上，而高濃度OC(20 M)則導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP水平降低90%(n=3，**P<0.01)，并且OC導(dǎo)致的ATP水平降低與Bax和Bak蛋白表達(dá)與否沒(méi)有相關(guān)性。以上結(jié)果提示，OC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與線粒體損傷相關(guān)。

圖4　OC導(dǎo)致線粒體蛋白降解和細(xì)胞內(nèi)ATP水平降低

3　討論

研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞中存在很多正?；虻耐蛔?，傳統(tǒng)的放化療法對(duì)許多凋亡基因突變的癌細(xì)胞起不到殺傷作用，這是由于細(xì)胞不能感知死亡信號(hào)的刺激，因而不能誘發(fā)細(xì)胞凋亡。Bax和Bak是Bcl-2家族中起促凋亡作用的重要成員，調(diào)控線粒體外膜的通透和細(xì)胞色素c的釋放從而啟動(dòng)下游的凋亡通路[9-10]。Bax和Bak蛋白表達(dá)的缺失使細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)不敏感，細(xì)胞不能發(fā)生凋亡，因此Bax和Bak缺失的細(xì)胞往往對(duì)大多數(shù)傳統(tǒng)的癌癥療法都有抵抗作用[11-13]。本研究中以野生型和Bax/Bak雙敲除的MEF和HCT116為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，檢測(cè)了藤黃屬植物中分離的天然產(chǎn)物OC對(duì)細(xì)胞ROS，線粒體功能和細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OC誘導(dǎo)ROS,破壞線粒體結(jié)構(gòu)，降低線粒體膜電位，并最終造成線粒體降解和ATP的耗竭。通過(guò)對(duì)比OC在野生型和DKO細(xì)胞中對(duì)凋亡的影響結(jié)果可以看出OC對(duì)于凋亡通路缺陷而化療耐受的惡性腫瘤治療有較好的應(yīng)用前景。

線粒體是真核生物細(xì)胞內(nèi)最重要的一種細(xì)胞器，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生命活動(dòng)，包括細(xì)胞凋亡除了廣為人知的線粒體凋亡信號(hào)通路外，線粒體自身的損傷和線粒體功能的破壞也在凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年的研究發(fā)現(xiàn)一種線粒體死亡的現(xiàn)象Mitoptosis，在某些情況下細(xì)胞內(nèi)的線粒體會(huì)發(fā)生大范圍的斷裂并最終通過(guò)凋亡將線粒體吞噬[14-16]。有報(bào)道表明蛋白酶體抑制劑MG132處理的HCT116細(xì)胞中膜電位降低，線粒體片段化并降解，線粒體功能喪失并最終誘導(dǎo)細(xì)胞走向不依賴Bax/Bak的細(xì)胞凋亡[17]。本研究中的天然化合物OC有和MG132類似的誘導(dǎo)線粒體死亡的現(xiàn)象，說(shuō)明線粒體功能的喪失可能導(dǎo)致了最終的細(xì)胞凋亡。

本課題組在之前的研究中發(fā)現(xiàn)OC是一種自噬抑制劑，通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞饑餓應(yīng)激條件下的自噬活性降低細(xì)胞對(duì)饑餓的耐受力，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。OC還能引起DNA雙鏈斷裂損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OC誘導(dǎo)細(xì)胞ROS增多，ROS的積累會(huì)導(dǎo)致DNA氧化損傷，激活線粒體依賴的內(nèi)源性凋亡通路。同時(shí)，OC還能直接作用于線粒體本身，破壞線粒體結(jié)構(gòu)造成線粒體降解，因此OC能通過(guò)多條途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是一種極有抗癌潛力的天然化合物。

[1]Han，Q B and H X Xu.Caged Garcinia xanthones：development since 1937[J].Curr Med Chem,2009，16(28)：3775-3796.

[2]Pandey，M K，B Sung，K S Ahn，et al.Gambogic acid，a novel ligand for transferrin receptor，potentiates TNF-induced apoptosis through modulation of the nuclear factor-kappaB signaling pathway[J].Blood，2007，110(10)：3517-3525.

[3]Zhao，L，Q L Guo，Q D You，et al.Gambogic acid induces apoptosis and regulates expressions of Bax and Bcl-2 protein in human gastric carcinoma MGC-803 cells[J].Biol Pharm Bull，2004，27(7)：998-1003.

[4]Liu，W，Q L Guo，Q D You，et al.Anticancer effect and apoptosis induction of gambogic acid in human gastric cancer line BGC-823[J].World J Gastroentero，2005，11(24)：3655-3659.

[5]Yang，Y，L Yang，Q D You，et al.Differential apoptotic induction of gambogic acid，a novel anticancer natural product，on hepatoma cells and normal hepatocytes[J].Cancer Lett，2007，256(2)：259-266.

[6]Feng，C，L Y Zhou，T Yu，et al.A new anticancer compound，oblongifolin C，inhibits tumor growth and promotes apoptosis in HeLa cells through Bax activation[J].Int J Cancer，2012，131(6)：1445-1454.

[7]Lao，Y，G Wan，Z Liu，et al.The natural compound oblongifolin C inhibits autophagic flux and enhances antitumor efficacy of nutrient deprivation[J].Autophagy，2014，10(5)：736-749.

[8]Xu，W，M Cheng，Y Lao，X Wang，J Wu，L Zhou，Y Zhang，H Xu，and N Xu.DNA damage and ER stress contribute to oblongifolin C-induced cell killing in Bax/Bak-deficient cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2015,457(3)：300-306.

[9]Youle，R J and A Strasser.The BCL-2 protein family：opposing activities that mediate cell death[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2008,9(1)：47-59.

[10] Chipuk，J E and D R Green.How do BCL-2 proteins induce mitochondrial outer membrane permeabilization?[J].Trends Cell Biol,2008,18(4)：157-164.

[11]Fischer，U，K Janssen，and K Schulze-Osthoff.Cutting-edge apoptosis-based therapeutics：a panacea for cancer?[J].BioDrugs,2007,21(5)：273-297.

[12]Wei，M C，W X Zong，E H Cheng，T Lindsten，V Panoutsakopoulou，A J Ross，K A Roth，G R MacGregor，C B Thompson，and S J Korsmeyer.Proapoptotic BAX and BAK：a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death[J].Science,2001,292(5517)：727-730.

[13]Zong，W X，T Lindsten，A J Ross，G R MacGregor，and C B Thompson.BH3-only proteins that bind pro-survival Bcl-2 family members fail to induce apoptosis in the absence of Bax and Bak[J].Genes Dev,2001,15(12)：1481-1486.

[14]Skulachev，V P.Programmed death phenomena：from organelle to organism[J].Ann N Y Acad Sci,2002,959：214-237.

[15]Tinari，A，T Garofalo，M Sorice，M D Esposti，and W Malorni.Mitoptosis：different pathways for mitochondrial execution[J].Autophagy,2007,3(3)：282-284.

[16]Skulachev，V P，L E Bakeeva，B V Chernyak，L V Domnina，A A Minin，O Y Pletjushkina，V B Saprunova，I V Skulachev，V G Tsyplenkova，J M Vasiliev，L S Yaguzhinsky，and D B Zorov.Thread-grain transition of mitochondrial reticulum as a step of mitoptosis and apoptosis[J].Mol Cell Biochem,2004,256-257(1-2)：341-358.

[17]Lomonosova，E，J Ryerse，and G Chinnadurai.BAX/BAK-independent mitoptosis during cell death induced by proteasome inhibition?[J].Mol Cancer Res,2009,7(8)：1268-1284.

(2016-07-05收稿責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Natural Product Oblongofilin C Induces ROS and Mitochondrial Dysfunction

Cheng Min1，Xu Wei1，Liu Lei1，Xie Weidong2，Xu Hongxi3,4，Xu Naihan2*

(1SchoolofLifeSciences，TsinghuaUniversity，Beijing100084，China; 2KeyLabinHealthyScienceandTechnology，GraduateSchoolatShenzhen，TsinghuaUniversity，Shenzhen518055，China; 3SchoolofPharmacy，ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shanghai201203，China; 4EngineeringResearchCenterofShanghaiCollegesforTCMNewDrugDiscovery，Shanghai201203，China)

Objective:To study the effect of natural product Oblongifolin C(OC)，a polycyclic polyprenylated acylphloroglucinol isolated from Garcinia yunnanenis Hu，on mitochondrial function and apoptosis.Methods:Wild type and bax/bak-/-mouse embryonic fibroblast MEF and human colon carcinoma cell line HCT116 were used as in intro model systems.Flow cytometry，confocal microscopy and immunoblotting were performed to detect the impacts of OC on ROS，mitochondrial function and apoptosis.Results:OC results in mitochondrial degradation and ATP depletion by increasing ROS production，disrupting mitochondrial outer membrane，reducing mitochondrial membrane potential，and finally induces apoptotic cell death.Conclusion:OC induces apoptosis through multiple pathways and it might be an attractive anticancer compound for the treatment of tumors.

Garcinia; Oblongifolin C；ROS；Mitochondria；Apoptosis

深圳市知識(shí)創(chuàng)新計(jì)劃基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(編號(hào)：JCYJ20140417115840281)

程敏(1992.01—)，女，碩士研究生，研究方向：細(xì)胞自噬，E-mail：ch-cm@qq.com

許乃寒(1973.02—)，女，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：細(xì)胞自噬，細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡，E-mail：xu.naihan@sz.tsinghua.edu.cn

Q28

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.07.001

專題——中藥活性物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究