HPV-16感染對(duì)喉咽鱗癌組織及FaDu細(xì)胞miRNA表達(dá)的影響

路武豪郭文濤馮 龍婁衛(wèi)華*（ 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科，河南 鄭州 45005； 廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞 5808； 河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)科，河南 鄭州 450008）

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HPV-16感染對(duì)喉咽鱗癌組織及FaDu細(xì)胞miRNA表達(dá)的影響

路武豪1郭文濤2馮 龍3婁衛(wèi)華1*
（1 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科，河南 鄭州 450052；2 廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞 523808；3 河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)科，河南 鄭州 450008）

目的 探討HPV-16感染對(duì)喉咽鱗癌組織及FaFu細(xì)胞miRNA表達(dá)的調(diào)控。方法 收集28例人喉咽鱗癌新鮮組織標(biāo)本，PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)標(biāo)本中HPV DNA的存在情況并進(jìn)行分型。穩(wěn)定培養(yǎng)整合HPV-16 E6-E7D的人喉咽鱗癌FaDu細(xì)胞，利用qRT-PCR對(duì)各組標(biāo)本及細(xì)胞中的miR-363、miR-15a及iR-155的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 28例喉咽鱗癌標(biāo)本中HPV陽(yáng)性者檢出7例，其中HPV-18型1例，HPV-52型1例，HPV-16，33混合型1例，HPV-16，52混合型1例。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：HPV-16陽(yáng)性喉咽鱗癌組織和細(xì)胞miR-363 和miR-15a表達(dá)均顯著上調(diào)，而miR-155表達(dá)水平均則沒有顯著變化。結(jié)論 HPV-16感染能夠影響人喉咽鱗癌組織及FaDu細(xì)胞miRNA表達(dá)水平。

HPV-16；喉咽鱗癌；FaFu細(xì)胞；miRNA；調(diào)控

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，病因?qū)W調(diào)查結(jié)果提示大量吸煙、飲酒是主要誘因，但是約有超過20%的此類腫瘤患者無(wú)煙酒嗜好，推測(cè)發(fā)病原因可能與HPV-16感染相關(guān)［1］。研究發(fā)現(xiàn)，HPV相關(guān)的HNSCC具有獨(dú)特的臨床特征，并且生物學(xué)行為與HPV陰性的HNSCC相比也存在較大差異，產(chǎn)生這些差異的機(jī)制尚待探索［2］。

本研究分別檢測(cè)了僅感染高危型HPV-16喉咽鱗癌組織miRNAs表達(dá)水平；穩(wěn)定感染HPV-16 E6-E7前后FaDu細(xì)胞miRNAs表達(dá)水平以及HPV陽(yáng)性的喉咽鱗癌組織和細(xì)胞中miRNAs表達(dá)水平，探索HPV-16感染對(duì)喉咽鱗癌miRNAs表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本采集：標(biāo)本采集于自2013年7月至2014年6月，在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院咽喉頭頸外科接受喉咽鱗癌手術(shù)切除的患者。

1.2細(xì)胞株：成功整合入HPV-16 E6-E7基因的人喉咽鱗癌FaDu細(xì)胞株由本課題組構(gòu)建。

1.3PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)標(biāo)本中HPV DNA并分型：參照AxyPrep公司基因組DNA小量試劑盒說(shuō)明書提取人喉咽鱗癌組織新鮮冰凍組織DNA。PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)手術(shù)切除的喉咽鱗癌新鮮冰凍組織標(biāo)本中的HPV并進(jìn)行分型。

1.4qRT-PCR檢測(cè)miR-363，miR-15a，miR-155表達(dá)：參照Small RNA提取試劑說(shuō)明書提取細(xì)胞Small RNA。應(yīng)用TaqMan 探針法分別擴(kuò)增整合入HPV-16 E6-E7基因的FaDu細(xì)胞和HPV-16陽(yáng)性的人喉咽鱗癌新鮮冰凍組織中miR-363，miR-15a，miR-155以及內(nèi)參照U6。使用ABI 7500 fast PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS17.0分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（± s）表示；多組均數(shù)間檢驗(yàn)采用單因素方差分析；組織標(biāo)本與細(xì)胞株miRNA相對(duì)表達(dá)量比較采用Wilcoxon Signed Ranks Test分析。

2　結(jié) 果

2.128例喉咽鱗癌標(biāo)本中7例檢測(cè)出為HPV陽(yáng)性：?jiǎn)我恍蛣eHPV感染共5例：HPV-16型3例，HPV-18型1例，HPV-52型1例；兩種型別混合感染共2例：HPV-16，33型和HPV-16，52型。

2.228例喉咽鱗癌患者臨床特征：大量吸煙的界定標(biāo)準(zhǔn)：吸煙超過20年且每天吸煙量≥1包；大量飲酒的界定標(biāo)準(zhǔn)：飲酒超過20年且每天≥150 g。臨床資料見表1。

2.3qRT-PCR檢測(cè)miR363、miR15a和miR155表達(dá)結(jié)果：HPV-16陽(yáng)性喉咽鱗癌組織中miR-15a、miR-363表達(dá)均顯著上調(diào)，miR-155無(wú)明顯改變；感染HPV-16 E6-E7的FaDu細(xì)胞中miR-15a和miR-363表達(dá)均顯著上調(diào)，miR-155仍然沒有顯著變化；HPV-16陽(yáng)性的喉咽鱗癌組織和細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-363、miR-15a和miR-155的表達(dá)均無(wú)顯著差異；HPV-16陰性的喉咽鱗癌組織與FaDu細(xì)胞中miR-363、miR-15a和miR-155表達(dá)亦無(wú)顯著性差異。見圖1。

圖1　HPV+組織/細(xì)胞與HPV-組織/細(xì)胞miR-363，miR-15a，miR-155相對(duì)表達(dá)水平比較

3　討 論

HPV相關(guān)的HNSCC呈逐年上升趨勢(shì)，但由于其預(yù)后相對(duì)較好，吸引了許多研究者來(lái)探索HPV相關(guān)的HNSCC的發(fā)病機(jī)制。micro RNA是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性小分子RNA，通過介導(dǎo)目的mRNA降解或抑制其翻譯過程，來(lái)負(fù)調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs與許多疾病密切相關(guān)，尤其在腫瘤的發(fā)生過程中通常存在著micro RNA的異常表達(dá)，既可以發(fā)揮癌基因的作用，又可以扮演抑癌基因的角色，發(fā)生這些現(xiàn)象的作用機(jī)制仍需深入研究［3］。

有研究［4］報(bào)道稱在HPV陽(yáng)性的HNSCC細(xì)胞中miRNA表達(dá)譜發(fā)生了明顯的改變，并且通過基因芯片技術(shù)和qRT-PCR檢測(cè)出在HPV-16陽(yáng)性HNSCC細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的有miR-363、miR-33和miR-497；表達(dá)下調(diào)的有miR-155、miR-181a、miR-29a、miR-181b、miR-218，以miR-155和miR-363改變最為明顯。此外，通過將HPV陽(yáng)性的HNSCC標(biāo)本與HPV陽(yáng)性的宮頸癌標(biāo)本miRNA表達(dá)譜進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)在HPV陽(yáng)性HNSCC中以miR-15a上調(diào)最為明顯。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)HPV-16陽(yáng)性的喉咽鱗癌組織中miR-15a表達(dá)水平明顯高于HPV陰性者，并且穩(wěn)定感染HPV-16 E6-E7的FaDu細(xì)胞中miR-15a表達(dá)也顯著高于未感染者。那么作為一種抑癌基因，miR-15a在HPV-16陽(yáng)性喉咽鱗癌組織中表達(dá)如此之高，能否認(rèn)為是HPV相關(guān)HNSCC預(yù)后較好的原因之一，為我們進(jìn)行下一階段的研究提供了一個(gè)重要的線索。

［1］ Ranee Mehra, K. Kian Ang, Barbara Burtness.Management of Human Papillomavirus-Positive and Human Papillomavirus-Negative Head and Neck Cancer［J］.Semin Radiat Oncol,2012,22（2）：194-197.

［2］ 高樹峰,張少容,徐蓮,等.慢病毒介導(dǎo)的siRNA靶向CD47基因?qū)θ撕戆┘?xì)胞Hep-2增殖、凋亡的影響［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2013,38（8）：634-638.

［3］ 李博,馬俊,劉麗玉,等.沉寂miR-345表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制探討［J］.中華全科醫(yī)學(xué),2015,13（7）： 1048-1050.

［4］ Walter V,Yin X,Wilkerson MD,et al.Molecular subtypes in head and neck cancer exhibit distinct patterns of chromosomal gain and loss of canonical cancer genes［J］.PLoS One,2013,8（2）：e56823.

R739.65

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1671-8194（2016）20-0043-02

河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（No.112102310679）

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