丹參酮ⅡA對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞高遷移率族蛋白-1、腫瘤壞死因子-α表達(dá)的影響及機(jī)制*

汪德坤 魏漢維 彭戩（湖北省武漢市東湖醫(yī)院，湖北武漢430074）

·綜述·

丹參酮ⅡA對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞高遷移率族蛋白-1、腫瘤壞死因子-α表達(dá)的影響及機(jī)制*

汪德坤 魏漢維 彭戩
（湖北省武漢市東湖醫(yī)院，湖北武漢430074）

目的觀察丹參酮ⅡA對(duì)高遷移率族蛋白B1（HMGB-I）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞的表達(dá)的影響。方法雄性SD大鼠45只隨機(jī)分為正常組（A組）、膿毒癥組（B組）及丹參酮ⅡA+膿毒癥組（C組），采用HE染色和ELISA法測(cè)定心肌組織中的TNF-α含量，Western blot法檢測(cè)心肌組織中HMGB-1的表達(dá)。結(jié)果HE染色顯示B組大鼠心肌纖維水腫、疏松，間質(zhì)充血水腫，膠原纖維增多，可見(jiàn)部分心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞水腫脫落，而C組心肌病理改變較B組輕。ELISA法測(cè)定心肌組織TNF-α含量，Western blot法檢測(cè)心肌組織中HMGB-1的表達(dá)，B組都較C組明顯增加（P＜0.05），心肌凋亡指數(shù)B組與C組也有明顯差異（P＜0.05）。且以上改變C組與A組也存在差異（P＜0.05）。結(jié)論丹參酮ⅡA可以減少膿毒癥大鼠心肌組織TNF-α及HMGB-I的表達(dá)，對(duì)膿毒癥心肌抑制有保護(hù)作用。

膿毒癥丹參酮ⅡA高遷移率族蛋白-1腫瘤壞死因子-α

【Abstract】Objective:To observe the influence and mechanism of tanshinoneⅡA on the expression of HMGB-I and TNF-αof cardiomyocyte in ratswith sepsis.M ethods:45male SD ratswere random ly divided into 3 groups：the normal group（group A），sepsis group（group B），tanshinoneⅡA+sepsis group（group C），using HE staining and ELISA method to determine the contentof TNF-αinmyocardial tissue，Western blotmethod to detect the expression of HMGB-1 in myocardial tissue.Results:HE staining showed that in group B，there were myocardial fibers edema，osteoporosis，interstitial hyperemia and edema，increased collagen fibers，the visible part of the endocardial endothelial edema，and myocardial pathological changes compared with group B and group C.Group B was significantly increased compared with the group C in ELISA method to determine content of TNF-αin myocardial tissue and Western blotmethod to detect the expression of HMGB-1 inmyocardial tissue（P《0.05），and myocardial apoptosis index of group B and group C also had obvious difference（P《0.05）.And the changes above and the differences also existed in the comparison between group A and group C（P《0.05）.Conclusion:TanshinoneⅡA can reduce the expression of TNF-αand HMGB-Iofmyocardial tissue of rat in sepsis，has a protective effect tomyocardial inhibition in sepsis.

【Key words】Sepsis；TanshinoneⅡA；Highmobility group protein 1；Tumor necrosis factor alpha

心功能不全是膿毒癥的常見(jiàn)并發(fā)癥之一，近50%的膿毒癥患者可出現(xiàn)不同程度的心肌抑制，病死率高達(dá)70%～90%［1］。心肌細(xì)胞凋亡是引起膿毒癥心肌抑制的重要因素［2］。炎癥早期的重要炎性因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可促進(jìn)心肌凋亡，TNF-α通常在脂多糖刺激幾分鐘內(nèi)即開(kāi)始釋放，在2 h左右達(dá)高峰，并在隨后2 h內(nèi)迅速下降至無(wú)法測(cè)出［3］，而且利用TNF-α拮抗劑治療膿毒癥也多以失敗告終，提示在膿毒癥后期的病理生理過(guò)程中有其他晚期炎癥介質(zhì)參與。研究發(fā)現(xiàn)晚期炎癥因子高遷移率族蛋白B1（HMGB-1）參與了膿毒癥心肌損傷的炎癥反應(yīng)以及其他病理生理過(guò)程［4-5］。此外，Ha等［6］發(fā)現(xiàn)，抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的HMGB-I的釋放能提高膿毒癥小鼠的生存率。丹參酮ⅡA有抗炎、免疫調(diào)理、抗氧化、穩(wěn)定血管內(nèi)皮等作用，發(fā)現(xiàn)其可以減少膿毒癥死亡率［7］，但其機(jī)制一直不清楚。本實(shí)驗(yàn)

旨在觀察膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞HMGB-I及TNF-α的表達(dá)，并觀察丹參酮ⅡA干預(yù)對(duì)其表達(dá)的影響，探討丹參酮ⅡA心臟保護(hù)性作用的機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD雄性大鼠45只購(gòu)自蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［合格證號(hào)SCXK（蘇）2008-0005］，體質(zhì)量230～320 g。

1.2藥物與試劑丹參酮ⅡA磺酸鈉（上海第一生化藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20026249）。TNF-αELISA試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。HMGB-1抗體購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

1.3分組與給藥雄性大鼠45只，正常喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對(duì)照組（A組）、膿毒癥組（B組）、丹參酮ⅡA+膿毒癥組（C組）各15只。C組開(kāi)始腹腔注射丹參酮ⅡA磺酸鈉0.1 mL/只，每日1次，持續(xù)2周。A組和B組注射同體積的0.9%氯化鈉注射液，每天1次，持續(xù)2周。

1.4模型制備喂養(yǎng)2周后B組和C組采用盲腸結(jié)扎穿孔法構(gòu)建膿毒癥大鼠模型［8］。術(shù)前禁食8 h，10%水合氯醛（0.3mL/kg）腹腔注射麻醉，消毒大鼠腹部皮膚，于腹部正中做2 cm縱切開(kāi)腹，鈍性分離盲腸，在盲腸末端1 cm處用4-0號(hào)絲線環(huán)形結(jié)扎盲腸，保持腸道通暢，避免損失血管。在距結(jié)扎遠(yuǎn)端5mm處采用9號(hào)針頭穿刺3次，輕擠出腸內(nèi)容物適量，縫合關(guān)閉腹腔。各組術(shù)后48 h處死。

1.5標(biāo)本采集與檢測(cè)1）心肌形態(tài)學(xué)檢測(cè)。大鼠心肌組織分別經(jīng)甲醛固定、乙醇脫水、石蠟包埋切片、HE染色，置光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。2）心肌TNF-α及HMGB-1含量測(cè)定。處死大鼠取左室心肌組織，分別給予0.9%氯化鈉注射液沖洗、勻漿離心（3000 r/min，15 min），取上清液備用。心肌組織中TNF-α含量采用ELISA法測(cè)定，操作步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。HMGB-1的表達(dá)采用Western blot法檢測(cè)［9-10］，采用GAPDH作為內(nèi)參，以其條帶吸光度值作為標(biāo)準(zhǔn)，以HMGB-1/GAPDH條帶吸光度比值作為HMGB-1蛋白表達(dá)的相對(duì)量。3）心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)。大鼠心肌組織分別經(jīng)過(guò)甲醛固定、乙醇脫水以及石蠟包埋切片，心肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè)按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以凋亡指數(shù)（AI）作為評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞凋亡情況的指標(biāo)，AI=視野內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)所有細(xì)胞數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P《0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組HE染色結(jié)果比較見(jiàn)圖1。A組大鼠的心肌細(xì)胞、膠原纖維含量正常、間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常；B組大鼠心肌細(xì)胞、間質(zhì)充血水腫，膠原纖維含量增多，部分心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫及脫落；C組心肌組織病理改變與B組相同，但較B組輕。

圖1　丹參酮ⅡA對(duì)膿毒癥大鼠心肌組織的影響（HE，4 0 0倍）

2.2各組心肌組織TNF-α、HMGB-1水平及心肌凋亡指數(shù)（AI）比較見(jiàn)表1。與A組相比，B組心肌細(xì)胞TNF-α、HMGB-1表達(dá)及AI指數(shù)顯著增加（P《0.01）。C組大鼠心肌細(xì)胞TNF-α、HMGB-1表達(dá)及AI指數(shù)較B組明顯減少（P《0.05）。

表1　各組心肌組織TNF-α、HMGB-1表達(dá)及A I水平比較（±s）

表1　各組心肌組織TNF-α、HMGB-1表達(dá)及A I水平比較（±s）

與A組比較，△P＜0.05；與B組比較，▲P＜0.05。

組別n AI C組15 0.09±0.01▲△A組15 0.04±0.01 B組15 0.22±0.03△TNF-α（pg/mL）HMGB-1（ng/mL）25.61±2.42▲0.40±0.05▲△21.14±3.32 0.20±0.04 47.35±4.31△0.84±0.05△

3　討論

心肌功能障礙在膿毒癥高死亡率中扮演著十分重要的角色。早在1951年，Waisbren等就發(fā)現(xiàn)膿毒癥所導(dǎo)致的心肌功能異?，F(xiàn)象，但其具體的發(fā)病和作用機(jī)理不明確。研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥時(shí)，體循環(huán)中存在大量的抑制心臟功能的細(xì)胞因子，其共同作用于心肌組織，出現(xiàn)心肌缺血缺氧性改變，最終可導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡、壞死，從而引起心臟功能的異常改變［11-12］。TNF-α是膿毒癥早期的主要炎癥介質(zhì)，在膿毒癥中TNF-α顯著增加，與心肌功能障礙相關(guān)。同時(shí)，TNF-α還能刺激單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞合成IL-1，而IL-1在膿毒癥休克中起著中心作用。研究顯示，IL-1對(duì)心肌有負(fù)性肌力作用，抑制心肌收縮，膿毒癥時(shí)心肌收縮力與順應(yīng)性多出現(xiàn)異常改變［13］。HMGB-1是膿毒癥過(guò)程中一個(gè)較晚出現(xiàn)的關(guān)鍵炎癥介質(zhì)，可顯著促進(jìn)炎癥因子如IL-1、IL-6、TNF-α以及C反應(yīng)蛋白和巨噬細(xì)胞炎性蛋白等的釋放，從而發(fā)揮促炎作用［14］。Deng等研究表明，HMGB-1具有促凋亡和促炎性反應(yīng)等作用，可加重心肌損傷的病理生理過(guò)程［15］。研究發(fā)現(xiàn)，A組心肌纖維排列整齊，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而B(niǎo)組大鼠心肌細(xì)胞腫脹，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，凋亡細(xì)胞體積變小，蛋白表達(dá)也提示B組TNF-α、HMGB-1明顯增加；給予丹參酮ⅡA處理后，C組心肌組織TNF-α、HMGB-1表達(dá)明顯下降，心肌損害明顯改善，心肌凋亡指數(shù)明顯下降。因有研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能抑制NF-κB活性增強(qiáng)［16］，而TNF-α、IL-1及HMGB-1表達(dá)均受NF-κB調(diào)控［17］，故膿毒癥大鼠經(jīng)丹參酮ⅡA處理后TNF-α及HMGB-1表達(dá)明顯下降，丹參酮ⅡA對(duì)膿毒癥心肌損傷有保護(hù)作用，但是C組與A組相比仍有差異，這也說(shuō)明丹參酮ⅡA并不能完全抑制膿毒癥心肌損傷，但其能抑制炎癥反應(yīng)仍然是膿毒癥治療的主要方向，其機(jī)制需要進(jìn)一步的探索。

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In fluence and M echanism of TanshinoneⅡA on the Expression of HMGB-I and TNF-αof Cardiomy-ocyte in Ratsw ith Sepsis

WANG Dekun，WEIHanwei，PENG Jian.Donghu Hospital，Hubei，Wuhan 430074，China.

·研究報(bào)告·

R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

1004-745X（2016）07-1272-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.07.002

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30500657）；湖北省自然科學(xué)基金（211CDB196）