ADAM10處理增強(qiáng)銅離子誘導(dǎo)的重組朊蛋白的蛋白酶抗性

陳操 呂燕 石琦 董小平

102206北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所朊病毒室傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

論 著

ADAM10處理增強(qiáng)銅離子誘導(dǎo)的重組朊蛋白的蛋白酶抗性

陳操 呂燕 石琦 董小平

102206北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所朊病毒室傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的 分析ADAM10對(duì)銅離子誘導(dǎo)后的PrP蛋白的剪切特點(diǎn)。方法 常規(guī)方法表達(dá)、純化人PrP全長蛋白（aa 23-230），利用氯化銅對(duì)純化后的 PrP蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)。用不同濃度的ADAM10對(duì)PrP蛋白進(jìn)行處理，檢測誘導(dǎo)后全長蛋白及剪切片段的PK抗性。結(jié)果 重組人PrP蛋白經(jīng)Cu2+誘導(dǎo)后具有部分抵抗PK消化的特點(diǎn)。Cu2+誘導(dǎo)后的PrP蛋白可被ADAM10剪切，具有劑量依賴性。ADAM10對(duì)Cu2+誘導(dǎo)的PrP蛋白處理后抵抗PK消化的能力明顯加強(qiáng)。結(jié)論 ADAM10可以剪切Cu2+誘導(dǎo)的PrP蛋白，同時(shí)增加了處理后PrP蛋白的PK抗性。

【主題詞】 朊蛋白；銅離子；去整合素金屬蛋白酶10；蛋白酶抗性；剪切

Fund programs：Nationa1 Natura1 Science Foundation of China（81401670，81572048，81301429）；SKLID Deve1opment Grant（2012SKLID102，2015SKLID503）

傳播性海綿狀腦?。╰ransmissib1e spongiform encepha1opathies，TSEs）是一類可以感染人類和動(dòng)物的神經(jīng)退行性疾病［1］。目前研究認(rèn)為，TSEs病原是一種異常形式的朊蛋白—朊病毒，故該病又稱為朊病毒病（prion disease）。該類疾病的發(fā)病機(jī)制目前認(rèn)為是正常的細(xì)胞型朊蛋白（PrPC）轉(zhuǎn)變?yōu)榭臻g構(gòu)型異常的、不溶的及具有部分蛋白酶抗性的異常朊蛋白（PrPSc），它能夠在受感染的腦組織中沉積，引起神經(jīng)元的退行性變，最終導(dǎo)致患者死亡［2］。成熟的PrPC是一種通過其 C端的糖基磷脂酰肌醇（g1ycosy1phosphatidy1inosito1，GPI）錨定于細(xì)胞膜外表面的糖蛋白［3］。

近些年對(duì)該病的研究發(fā)現(xiàn)，二價(jià)金屬離子如銅離子、錳離子及鋅離子參與到了PrPC向PrPSc的轉(zhuǎn)化過程中。在朊病毒感染小鼠的腦組織中這些二價(jià)金屬離子的含量發(fā)生了明顯的變化［4］。同時(shí)，二價(jià)金屬離子可與重組野生型朊蛋白的八肽重復(fù)區(qū)結(jié)合，使重組野生型朊蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，具有部分抵抗蛋白酶K（Proteinase K，PK）消化的特點(diǎn)［5］。

我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，PrP蛋白與去整合素金屬蛋白酶10（A disintegrin and meta11oproteinase 10，ADAM10）可發(fā)生明顯的相互作用并可以被其剪切。在朊病毒感染過程中，ADAM10的含量亦發(fā)生了明顯的變化［6］。由于PrP蛋白是一種重要的銅離子代謝的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［5］，結(jié)合銅離子后的PrP蛋白是否也能夠經(jīng)歷ADAM10的剪切作用。本研究擬通過體外模擬銅離子結(jié)合后的PrP蛋白觀察其是否能夠被ADAM10剪切及對(duì)其剪切特點(diǎn)進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1材料 原核BL21（DE3）菌株、含有5個(gè)八肽重復(fù)區(qū)的重組人PrP蛋白表達(dá)質(zhì)粒pQE30-huPrP23-230及GST蛋白表達(dá)質(zhì)粒pQE30-GST均由本科室保存。

1.2野生型 PrP重組蛋白的表達(dá)與純化 將pQE30-huPrP23-230轉(zhuǎn)化至原核BL21（DE3）菌株，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，菌液超聲破碎后與鎳柱結(jié)合進(jìn)行親和層析純化，透析后收集重組人PrP蛋白。

1.3銅離子處理 純化后的野生型重組PrP蛋白經(jīng)4℃、20 000 g離心30 min，上清與氯化銅（200 μmo1/L）4℃孵育2周后立即進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4蛋白酶抗性實(shí)驗(yàn) 純化后的野生型重組PrP蛋白與2～160 μg/m1 PK 37℃孵育1 h。加入5× SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5 min終止PK消化反應(yīng)。用PrP抗體（3F4）特異性Western B1ot進(jìn)行檢測和分析［7］。為了避免銅離子對(duì)PK活性的影響，我們利用相同體積的純化后的GST蛋白做對(duì)照，37℃直接與 PK孵育1 h，隨后立即用 GST抗體（anti-GST）特異性Western B1ot進(jìn)行檢測和分析。

1.5PrP 體外剪切實(shí)驗(yàn) 根據(jù)說明書的要求，利用商品化的具有剪切活性的ADAM10蛋白（PF124，Merck公司）在37℃、1 h的條件下對(duì)純化后的重組人PrP蛋白進(jìn)行剪切試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1Cu2+誘導(dǎo)后重組人PrP蛋白的PK消化特點(diǎn)

常規(guī)方法純化重組人野生型PrP蛋白，經(jīng)SDSPAGE檢測，純度＞95%，濃度為1 mg/m1。為了評(píng)估Cu2+對(duì)野生型PrP蛋白PK消化特性的影響，將Cu2+誘導(dǎo)后的野生型PrP蛋白與不同濃度的PK孵育，同時(shí)以沒有Cu2+處理的PrP蛋白作為對(duì)照進(jìn)行平行試驗(yàn)。Western B1ot結(jié)果顯示經(jīng)2.5 μg/m1的PK消化后對(duì)照組就檢測不到PrP特異性條帶的存在，然而在較高（5 μg/m1）的PK濃度條件下Cu2+誘導(dǎo)后的PrP蛋白仍可以檢測到明顯的PrP特異性信號(hào)。隨著將PK濃度由5 μg/m1逐漸增加至40 μg/ m1時(shí)，PrP特異性信號(hào)強(qiáng)度則逐漸降低（圖1A）。作為對(duì)照，Cu2+誘導(dǎo)后的GST蛋白在經(jīng)2.5 μg/m1的PK消化后就檢測不到GST特異性條帶的存在（圖1B）。表明Cu2+誘導(dǎo)后的PrP蛋白具有部分抵抗PK消化的特點(diǎn)。

圖1　Cu2+誘導(dǎo)后PrP蛋白的PK消化試驗(yàn)Fig.1 Assays of PK-resistances of Cu2+-induced PrP

2.2ADAM10對(duì)Cu2+誘導(dǎo)后的重組人PrP蛋白的剪切作用 我們近期研究顯示體外ADAM10可以特異性剪切重組人 PrP蛋白（未經(jīng)任何處理）［6］，為了驗(yàn)證Cu2+誘導(dǎo)后的PrP蛋白是否也可以被ADAM10進(jìn)一步剪切，我們將Cu2+誘導(dǎo)后的PrP蛋白與不同濃度的具有剪切活性的ADAM10蛋白進(jìn)行孵育，Western B1ot結(jié)果顯示未經(jīng)ADAM10處理的全長PrP蛋白為一條單一的、具有特異性信號(hào)的條帶，而經(jīng)0.4 μg/m1 ADAM10處理后除了全長PrP蛋白外，在17 KDa左右看到PrP特異性的信號(hào)，同時(shí)隨著將ADAM10濃度由0.4 μg/m1逐漸提升至6.4 μg/m1，17KDa左右PrP特異性的信號(hào)逐漸增強(qiáng)（圖2A）。灰度值量化結(jié)果更加明顯的顯示經(jīng)3.2 μg/m1 ADAM10處理后小片段的PrP蛋白占全長PrP蛋白的比例明顯上升，至6.4 μg/m1 ADAM10處理時(shí)，小片段的PrP蛋白的灰度值是全長PrP蛋白的1.6倍（圖2B）。這些結(jié)果提示重組人PrP蛋白經(jīng) Cu2+誘導(dǎo)后仍可被ADAM10剪切。

A.Western b1ot結(jié)果；B.灰度值量化分析結(jié)果，剪切片段/相應(yīng)全長PrP圖2　Cu2+誘導(dǎo)后PrP蛋白的ADAM10剪切試驗(yàn)A.Western b1ot with PrP-specific monoc1ona1 3F4.B.Densitometryana1ysis of the average gray va1ue of the PrP segment.Data were presented as the ratio of segmented PrP to corresponding fu11-1ength oneFig.2 Assays of ADAM10 treatment of Cu2+-induced PrP

2.3Cu2+誘導(dǎo)的重組人PrP蛋白經(jīng)ADAM10處理后的PK消化特點(diǎn) 為了分析Cu2+誘導(dǎo)后重組人PrP蛋白經(jīng)ADAM10剪切后的特點(diǎn)，我們將經(jīng)6.4 μg/m1 ADAM10處理的未經(jīng) Cu2+誘導(dǎo)及經(jīng)Cu2+誘導(dǎo)后的重組人PrP蛋白進(jìn)行PK消化特點(diǎn)的分析。Western b1ot結(jié)果顯示未經(jīng)Cu2+誘導(dǎo)的PrP蛋白，無論是否經(jīng)過ADAM10處理都無法抵抗PK的消化作用（圖3A），而Cu2+誘導(dǎo)的PrP蛋白經(jīng)ADAM10處理后具有比之前未經(jīng)ADAM10處理更強(qiáng)的抵抗PK消化的作用（圖3B）?；叶戎盗炕Y(jié)果顯示，未經(jīng)ADAM10處理的Cu2+誘導(dǎo)的全長PrP蛋白可抵抗5 μg/m1的PK消化，而經(jīng)ADAM10處理后可抵抗10 μg/m1的PK消化（圖3C）。相似的結(jié)果在抵抗PK消化的PrP剪切片段中也可看出，未經(jīng)ADAM10處理的Cu2+誘導(dǎo)PrP的PK抗性片段可抵抗20 μg/m1的PK消化，而經(jīng)ADAM10處理的則可抵抗80 μg/m1的PK消化（圖3D）。這些結(jié)果提示ADAM10對(duì)Cu2+誘導(dǎo)PrP蛋白的處理可能阻礙了PK在PrP蛋白上的剪切結(jié)合位點(diǎn)，從而使其具有更強(qiáng)的抵抗PK消化的特點(diǎn)。

A.未經(jīng)Cu2+誘導(dǎo)的PrP；B.經(jīng)Cu2+誘導(dǎo)后的PrP；C.量化分析結(jié)果顯示不同濃度PK消化后剩余全長PrP所占未經(jīng)任何處理的PrP蛋白的灰度值百分比；D.不同濃度PK消化后PrP片段所占未經(jīng)任何處理的PrP蛋白的灰度值百分比。設(shè)未經(jīng)任何處理的全長PrP的灰度值為1圖3　經(jīng)ADAM10處理后Cu2+誘導(dǎo)的PrP蛋白的PK消化試驗(yàn)A.Without Cu2+-induced PrP.B.With Cu2+-induced PrP.C.Densitometry ana1ysis of the percentage of the gray va1ues of remaining fu11 1ength PrP to that of origina1 untreated fu11 1ength PrP according to the various concentrations of PK.D.Densitometry ana1ysis of the percentage of the gray va1ues of the remaining PrP segment to that of origina1 untreated fu11 1ength PrP according to the various concentrations of PK.The gray va1ue of origina1 untreated fu11 1ength PrP is set to 100%.Fig.3 Assays of PK-resistances in Cu2+-induced PrP treated by ADAM10

3 討論

總所周知，二價(jià)金屬離子可以結(jié)合PrP蛋白，同時(shí)許多朊病毒病感染者腦組織中也都可以發(fā)現(xiàn)這種二價(jià)金屬離子含量的變化［4-5］，提示二價(jià)金屬離子參與了PrPC向PrPSc的轉(zhuǎn)化。由于PrPSc具有抵抗PK抗性的特點(diǎn)，故目前主要利用這一重要特點(diǎn)鑒別PrPSc與PrPC。已有研究顯示Cu2+誘導(dǎo)后的PrP蛋白會(huì)改變對(duì)PK消化的敏感性［5］。本研究中，我們通過Cu2+誘導(dǎo)的重組PrP蛋白具有部分抵抗PK消化的特性，很好地模擬了Cu2+對(duì)PrP的作用，同時(shí)提示銅離子可能是PrPC向PrPSc的轉(zhuǎn)化過程中的一個(gè)協(xié)同因子。

作為一個(gè)具有催化活性的金屬蛋白酶，有研究認(rèn)為 ADAM10參與了培養(yǎng)細(xì)胞中 PrPC的“α-剪切”［8-9］，剪切位點(diǎn)為氨基酸110和111之間。我們之前的結(jié)果證明對(duì)重組PrPC的剪切位點(diǎn)可能在PrP蛋白的跨膜區(qū)（氨基酸第111-134位）。事實(shí)上，對(duì)于ADAM10在PrP蛋白上的剪切位點(diǎn)仍舊存在爭議［10-12］。但是我們的結(jié)果直接證明了ADAM10不僅能夠水解正常的PrP重組蛋白，還能夠水解Cu2+誘導(dǎo)后的人PrP蛋白。我們分析由于Cu2+與PrP蛋白的結(jié)合位點(diǎn)主要在八肽重復(fù)區(qū)（氨基酸第51-91位），故PrP蛋白的N端結(jié)合Cu2+后不會(huì)對(duì)PrP蛋白的跨膜區(qū)及C端的結(jié)構(gòu)造成影響，這也是ADAM10能夠進(jìn)一步剪切Cu2+誘導(dǎo)的PrP蛋白的分子基礎(chǔ)。

PrP蛋白和ADAM10均是膜蛋白，它們有足夠的空間進(jìn)行相互作用，這在我們之前的研究中已經(jīng)證明［6］。在本研究中，ADAM10處理Cu2+誘導(dǎo)后的PrP蛋白具有的PK抗性明顯強(qiáng)于未經(jīng)ADAM10處理的Cu2+誘導(dǎo)后的PrP蛋白，我們推測這可能是由于空間位阻效應(yīng)所造成的。由于Cu2+誘導(dǎo)后的PrP蛋白的N端的空間結(jié)構(gòu)要明顯復(fù)雜于未經(jīng)Cu2+誘導(dǎo)后的PrP蛋白致使不易被PK完全消化，而此時(shí)進(jìn)一步增加ADAM10的處理即進(jìn)一步復(fù)雜了或直接占位了PK的消化位點(diǎn)，致使低濃度的PK無法與靶蛋白完全結(jié)合，導(dǎo)致其具有更強(qiáng)的PK抗性。由于PrP蛋白是參與體內(nèi)銅離子代謝作用的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這種情況在體內(nèi)應(yīng)極易發(fā)生，那么在生理?xiàng)l件下如何避免這種抵抗消化作用的發(fā)生以及機(jī)體調(diào)控異常時(shí)這種抵抗消化作用的存在是否有益于PrPSc的侵染和復(fù)制需待下一步的深入研究。

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Enhanced PK-resistance of the Cu2+-induced recombinant prion protein treated by ADAM10

ChenCao，Lyu Yan，Shi Qi，Dong Xiaoping National Institute for Viral Disease Control and Prevention，State Key Laboratory for Infectious Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China

Dong Xiaoping，Email：dongxp238@sina.com

Objective To ana1yze the characteristics of the ADAM10 c1eavage on the Cu2+-induced recombinant prion protein.Methods Recombinant human prion protein（PrP，aa 23-230）was expressed and purified by routine methods.The purified human PrP was induced by copper ch1oride.Subsequent1y，the Cu2+-induced recombinant human PrP was treated with various concentrations of ADAM10 and its PK-resistance was assessed by PrP-specific Western B1ot after incubating with various concentrations of proteinase K.Results The Cu2+-induced purified recombinant prion protein has the characteristic of partia1 PK-resistance.ADAM10 can c1eavage the Cu2+-induced purified recombinant prion protein，with a dosedependent manner.The PK-resistance abi1ity of ADAM10-treated Cu2+-induced purified recombinant prion protein is higher than that of ADAM10-untreated one.Conclusions ADAM10 can c1eavage the Cu2+-induced purified recombinant prion protein and enhance the PK-resistance abi1ity of the treated prion protein.

Prion protein；Cu2+；ADAM10；PK-resistance；c1eavage

國家自然科學(xué)基金（81401670，81572048，81301429）；傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（2012SKLID102，2015SKLID503）

董小平，Emai1：dongxp238@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.001

2016-02-02）