自噬和凋亡在甲型流感病毒和肺炎球菌協(xié)同感染小鼠模型中作用的初探

秦臻 王紅仁 黃筱鈞 羅俊 游江舟 李婉宜 楊遠(yuǎn) 周琳琳 李明遠(yuǎn)

610041成都，四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室

自噬和凋亡在甲型流感病毒和肺炎球菌協(xié)同感染小鼠模型中作用的初探

秦臻 王紅仁 黃筱鈞 羅俊 游江舟 李婉宜 楊遠(yuǎn) 周琳琳 李明遠(yuǎn)

610041成都，四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室

目的 建立甲型流感病毒（Inf1uenza A virus，IAV）和肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，SP）協(xié)同感染小鼠模型，在該模型中初步探索自噬和凋亡的發(fā)生情況。方法 將IAV和SP以不同順序感染Ba1b/c小鼠，觀察其體重變化和死亡率，檢測(cè)其肺部IAV和SP滴度、病理改變情況，建立IAV～SP協(xié)同感染動(dòng)物模型。使用免疫組化法檢測(cè)自噬特征蛋白LC3及凋亡特征蛋白Caspase-3的表達(dá)情況。結(jié)果 IAV～SP組第二次感染后24 h時(shí)小鼠肺部IAV和SP滴度最高，死亡率也明顯高于其他各組，48 h病理改變也最為嚴(yán)重。免疫組化結(jié)果顯示IAV感染早期（24 h～48 h）LC3蛋白表達(dá)出現(xiàn)峰值，Caspase-3緩慢上升；晚期（72 h～96 h）Caspase-3蛋白表達(dá)出現(xiàn)峰值，而LC3蛋白表達(dá)逐漸下降。結(jié)論 本研究成功建立了IAV～SP協(xié)同感染動(dòng)物模型，模型鼠中自噬先于凋亡發(fā)生，為進(jìn)一步研究自噬和凋亡在IAV～SP協(xié)同感染中的作用奠定了基礎(chǔ)。

【主題詞】 甲型流感病毒；肺炎鏈球菌；自噬；凋亡；炎癥

Fund program：Opening project of State Key Laboratory of Ora1 Diseases（SKLOD2015OF08）

甲型流感病毒（IAV）是分節(jié)段的負(fù)鏈RNA包膜病毒，由于其極強(qiáng)的變異性，使得常規(guī)抗病毒藥物及流感疫苗的應(yīng)用都受到一定限制［1，2］。在IAV感染引起的嚴(yán)重及死亡病例中，大都是因?yàn)槔^發(fā)了細(xì)菌性感染，其中以肺炎鏈球菌 （Streptococcus pneumoniae，SP）為主［3］。近年來(lái)自噬（Autophagy）和凋亡（Apoptosis）的深入研究，為探索IAV感染導(dǎo)致嚴(yán)重的繼發(fā)性細(xì)菌感染的發(fā)生機(jī)制提供了新的突破點(diǎn)。

自噬是一種高度保守的能降解細(xì)胞內(nèi)衰老細(xì)胞器及外來(lái)入侵物質(zhì)的細(xì)胞死亡方式，可在饑餓、缺氧及感染等情況下被激活，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［4］。周智等人發(fā)現(xiàn)IAV感染A549細(xì)胞后可激活細(xì)胞自噬，而抑制自噬可阻礙病毒復(fù)制［5］。此后，體內(nèi)外研究均證實(shí)抑制自噬可減輕IAV所致疾病程度［6，7］。凋亡是一種細(xì)胞的“自殺”死亡方式，最終可有效清除細(xì)胞本身及其內(nèi)容物［8］。至今也有較多IAV感染可誘導(dǎo)凋亡發(fā)生、抑制凋亡可減輕疾病程度的報(bào)道［9，10］。本研究建立了 IAV～SP協(xié)同感染小鼠模型，并初步探索了模型中自噬和凋亡的發(fā)生情況，以期為進(jìn)一步研究自噬和凋亡在IAV～SP協(xié)同感染模型中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 甲型流感病毒（A/Puerto Rico/8/ 34，H1N1）小鼠適應(yīng)株和肺炎鏈球菌ATCC6303均由本教研室保存；9-11日齡SPF級(jí)受精雞蛋（濟(jì)南斯派福瑞）；哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)（Oxoid）；MDCK細(xì)胞購(gòu)于ATCC；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（上海復(fù)蒙）；兔抗鼠LC3B多克隆抗體（Abcam）；兔抗鼠 Caspase-3多克隆抗體（Ce11 Signa1ing）；生物素化羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的親和素和DAB顯色試劑盒（武漢博士德）；健康8～9周齡雌性Ba1b/c小鼠（四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；Leica光學(xué)顯微鏡（ICC50 HD）；SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件；GraphPad Prism 5.0數(shù)據(jù)分析作圖軟件；ImagePro P1us 6.0圖像分析軟件。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1IAV和SP的培養(yǎng)：使用10日齡雞胚復(fù)蘇并培養(yǎng)IAV，所得尿囊液的TCID50為10-5.1/0.1 m1，分裝儲(chǔ)存于-80℃。SP在加有3%～5%脫纖維兔血的哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基中復(fù)蘇并培養(yǎng)，培養(yǎng)物經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定其不同稀釋濃度下在600 nm處的吸光度值（A600值），并將各濃度SP菌液等體積均勻涂布于血平板上計(jì)數(shù)菌落數(shù)，由此建立SP濃度-A600標(biāo)準(zhǔn)曲線，公式為y=214419x-293.05（y為每100 μ1中細(xì)菌個(gè)數(shù)，x為A600值）。

1.2.2半數(shù)致死量（LD50）測(cè)定：將IAV和SP分別稀釋不同梯度濃度攻擊小鼠，攻擊劑量均為每只小鼠0.1 m1，記錄各組小鼠的死亡數(shù)量，并利用Reed-Muench方法按表 1和表 2分別計(jì)算 IAV和 SP 的LD50。

1.2.3IAV-SP協(xié)同感染動(dòng)物：研究采用0.5 LD50IAV和0.3 LD50SP按不同順序和組合（表3）給小鼠滴鼻，每只小鼠滴100 μ1，每只鼻孔50 μ1。觀察動(dòng)物死亡情況，并于每次感染后不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，取肺組織檢測(cè)IAV/SP滴度、HE染色檢測(cè)病理改變、免疫組化檢測(cè)LC3/Caspase-3的表達(dá)情況。

表1　IAV的LD50測(cè)定Tab.1 Determination of IAV LD50

表2　SP的LD50測(cè)定Tab.2 Determination of SP LD50

表3　IAV和SP以不同順序感染小鼠Tab.3 Mice cha11enged with IAV and/or SP in a sequence-manner

1.2.4IAV/SP滴度檢測(cè)：將小鼠肺組織取出后用PBS洗3次，加入500 μ1 PBS進(jìn)行勻漿，所得勻漿液經(jīng)4℃、10 000 r/min離心5 min。取上清進(jìn)行IAV滴度檢測(cè)，將上清10倍連續(xù)稀釋后分別感染單層MDCK細(xì)胞，于72 h觀察細(xì)胞CPE情況，并用Reed-Muench法計(jì)算TCID50。沉淀用500 μ1 PBS重懸10倍連續(xù)稀釋后等量涂布至哥倫比亞血平板，24 h后對(duì)平板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.5HE染色檢測(cè)小鼠肺組織病理改變：感染IAV和/或SP 48 h后取小鼠肺組織，分別用4%PFA固定后行石蠟包埋，再制成5 μm厚切片，進(jìn)行HE染色后普通光學(xué)顯微鏡下觀察病理改變。

1.2.6免疫組化半定量分析LC3、Capase-3的表達(dá)：小鼠肺組織取出后用PBS洗3次，4%PFA中固定后用石蠟包埋，制成5 μm厚切片。按1∶150（抗-Caspase-3）或1∶250（抗-LC3）滴加一抗，再按1∶100滴加生物素化羊抗兔IgG，然后加1∶100的HRP標(biāo)記的親和素，DAB顯色后用蘇木素復(fù)染。染色后顯微鏡下觀察和拍照，并用ImagePro P1us 6.0軟件對(duì)陽(yáng)性區(qū)域進(jìn)行累積光密度（IOD）、陽(yáng)性區(qū)域面積（Area）測(cè)量，通過(guò)光密度總和（IOD sum）/陽(yáng)性區(qū)域面積總和（Area sum）來(lái)反應(yīng)蛋白表達(dá)情況［11］。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，使用非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Kap1an-Meier曲線用于小鼠生存分析，所有數(shù)據(jù)均使用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4生物安全 本研究在四川大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室生物安全二級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1IAV～SP協(xié)同感染動(dòng)物模型建立 IAV～SP組在第二次攻擊后48 h內(nèi)死亡，IAV組和SP組小鼠分別有44.45%和20%的死亡率，IAV+SP組死亡率為50%，而SP～I(xiàn)AV組小鼠在第二次攻擊后死亡率為0，對(duì)照組無(wú)小鼠死亡（圖1）。

圖1　IAV和SP以不同方式感染小鼠后死亡情況Fig.1 Surviva1 curves for IAV and SP infection in different approaches in different groups

A：IAV～SP組，B：IAV+SP組，C：IAV組，D：SP組，E：對(duì)照組圖2　IAV～SP協(xié)同感染小鼠模型感染48 h后肺部病理變化（400×）A：IAV～SP group，B：IAV+SP group，C：IAV group，D：SP group，E：Contro1 groupFig.2 Patho1ogica1 changes from synergistic infection of IAV～SP 48 hours（400×）

圖3　LC3/Caspase-3免疫組化半定量測(cè)定Note：the mice were infected with IAV，the 1ungs were removed at 1，2，3，4 and 7 days 1ater（n=4），and LC3（A）and Caspase-3（B）were measured with immunohistochemica1（IHC）.The resu1ts were checked under the microscope magnifying 400；5 randomsights of each samp1e were se1ected.ns：difference was not statistica11y significant，?P＜0.05，??，???P＜0.01Fig.3 LC3/Caspase-3 ana1ysis of IOD sum/Area sum with IHC

2.2IAV/SP滴度變化 小鼠在單獨(dú)感染病毒后第5天IAV滴度達(dá)到峰值，隨后緩慢下降，而在第二次感染SP后IAV滴度出現(xiàn)上升；IAV+SP組及SP～I(xiàn)AV組分別在感染24 h時(shí)IAV滴度達(dá)到峰值，隨后下降。IAV～SP組小鼠24 h和48 h的SP滴度均明顯高于IAV+SP和 SP組，其中 SP組滴度最低。

2.3各組感染小鼠肺部病理變化情況 IAV～SP 組48 h肺部病理?yè)p傷最為嚴(yán)重，鏡下可見(jiàn)全肺肺泡結(jié)構(gòu)消失，巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2，A）；IAV+SP組雖也有上述病理改變，但病變范圍較IAV～SP組小（圖2，B）；IAV組小鼠肺間質(zhì)具有較重病理改變，但仍可見(jiàn)部分細(xì)支氣管、肺泡等完整結(jié)構(gòu)（圖2，C）；而SP組病理改變較輕（圖2，D）。

2.4IAV感染小鼠后自噬和凋亡的發(fā)生情況初探

在感染2 d內(nèi)，LC3表達(dá)量出現(xiàn)峰值，隨后下降，第7天時(shí)與對(duì)照組無(wú)明顯差異（圖3 A）；Caspase-3在感染后第1天表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)明顯差異，緩慢上升并于第4天出現(xiàn)峰值（圖3 B）。

3 討論

IAV感染后繼發(fā)性細(xì)菌性肺炎是IAV所致嚴(yán)重及死亡病例的主要原因之一，所以研究IAV和肺炎鏈球菌等常見(jiàn)協(xié)同感染細(xì)菌［3］在宿主體內(nèi)的相互作用機(jī)制，有助于尋找對(duì)抗IAV感染的有效預(yù)防和治療的新方法。在本研究中，我們通過(guò)將IAV和/ 或SP按照不同順序和組合感染小鼠，觀察每組小鼠的疾病過(guò)程和死亡情況，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的肺部IAV/SP滴度及病理變化，以建立IAV～SP協(xié)同感染小鼠模型。

研究結(jié)果顯示IAV感染小鼠后第5天開(kāi)始死亡，與IAV滴度升高趨勢(shì)一致，而繼發(fā)感染SP后小鼠在48 h內(nèi)全部死亡。IAV～SP組肺部SP滴度明顯高于SP組或IAV+SP組，且肺部病理?yè)p傷最為嚴(yán)重，說(shuō)明IAV感染后使得SP更易入侵機(jī)體，這種病毒-細(xì)菌協(xié)同作用模式比其他各組感染模式更易造成嚴(yán)重甚至小鼠死亡。我們認(rèn)為自噬在IAV感染早期可能對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用，而IAV感染后期引發(fā)的凋亡導(dǎo)致機(jī)體更易受到細(xì)菌入侵，于是我們?cè)贗AV感染后的不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)自噬和凋亡的特征性蛋白LC3/Caspase-3的表達(dá)情況進(jìn)行了免疫組化半定量分析。初步結(jié)果顯示IAV感染早期確實(shí)發(fā)生了自噬，這可能是由于病毒利用了自噬這一機(jī)制進(jìn)行自身復(fù)制，反過(guò)來(lái)自噬對(duì)機(jī)體起著保護(hù)作用［12］；而感染后期凋亡反應(yīng)占據(jù)主要地位，機(jī)體免疫力降低，此時(shí)再受到細(xì)菌入侵，導(dǎo)致嚴(yán)重后果。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)先感染SP、7 d后再感染IAV的小鼠無(wú)一死亡，我們認(rèn)為可能是由于SP感染激活了自噬所致。周智的博士論文中也顯示，無(wú)論是增強(qiáng)或減弱細(xì)胞自噬作用，IAV滴度均下降［13］。Wo1f等發(fā)現(xiàn)SP的溶素是保護(hù)機(jī)體免于肺炎鏈球菌性肺炎后IAV感染的關(guān)鍵因素［14］，而Li等發(fā)現(xiàn)SP的溶血素是激活自噬的關(guān)鍵因子［15］。總之，SP對(duì)機(jī)體感染IAV具有一定的保護(hù)作用，可能是預(yù)防流感的一種新策略。

本研究成功建立了IAV～SP協(xié)同感染動(dòng)物模型，初步探索了IAV和SP協(xié)同感染后對(duì)自噬和凋亡的影響，率先在動(dòng)物體內(nèi)初步證實(shí)了“IAV感染早期以發(fā)生自噬為主，而晚期以發(fā)生凋亡為主”的假說(shuō)。我們將在IAV-SP協(xié)同感染小鼠模型中對(duì)自噬與凋亡進(jìn)行調(diào)控，深入研究它們?cè)诹鞲泻屠^發(fā)的細(xì)菌感染發(fā)病機(jī)制中的作用也有可能發(fā)現(xiàn)防控流感及其繼發(fā)感染的新策略。

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Preliminary exploring of autophagy and apoptosis in Animal model of synergistic infection with influenza A virus and Streptococcus pneumoniae

Qin Zhen，Wang Hongren，Huang Xiaojun，Luo Jun，You Jiangzhou，Li Wanyi，Yang Yuan，Zhou Linlin，Li Mingyuan Department of Microbiology，West China School of Preclinical and Forensic Medicine，Sichuan University，Chengdu 610041，China

Li Mingyuan，Email：lmy3985@sina.com

Objective To estab1ish an anima1 mode1 for synergistic infection of Inf1uenza A virus （MIAetVh）odasnd Streptococcus pneumonia（SP）and pre1iminari1y exp1ore the ro1es of autophagy and apoptosis. Ba1b/c mice were administered with IAV and/or SP in different sequences.Morta1ities were observed.Titers of IAV and SP，patho1ogica1 changes in the 1ungs were ana1yzed at certain time points.The expressions of LC3，Caspase-3 were assayed by immunohistochemica1 staining.Results Mice infected IAV seven days ahead of SP，compared with those from other groups，ended up with the highest morta1ity rate and IAV/SP titers 24 hours after the second cha11enge，they a1so exhibited the most severe patho1ogica1 changes 48 hours after the second cha11enge.Immunochemistry assay showed that the peak of LC3 expression appeared at the ear1y stage of IAV infection fo11owed by a decrease in a time-dependent manner，whi1e Caspase-3 reached the highest expression at the 1ate stage of IAV infection.Conclusions An IAV-SP synergistic infection mouse mode1 has been estab1ished.The deve1opment of autophagy was ear1ier than that of apoptosis in this pre1iminary exp1oring.Our study has 1aid a so1id foundation for further research on the ro1es of autophagy and apoptosis in IAV-SP co-infection in vivo，as we11 as verified our hypothesis that autophagy wou1d occur ear1ier than apoptosis during the intruding of IAV.

Inf1uenza A virus；Streptococcus pneumoniae；autophagy；apoptosis；inf1ammation

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（SKLOD2015OF08）

李明遠(yuǎn)，Emai1：1my3985@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.020

2015-11-21）