2013-2015年人冠狀病毒OC43基因型分布特點(diǎn)的研究

賈寶遷 肖艷 王營(yíng) 任麗麗 王健偉

作者單位：100730中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所

2013-2015年人冠狀病毒OC43基因型分布特點(diǎn)的研究

賈寶遷 肖艷 王營(yíng) 任麗麗 王健偉

作者單位：100730中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所

目的 研究人冠狀病毒（Human Coronavirus，HCoV）OC43的基因型分布特點(diǎn)，為闡明HCoV-OC43的分子流行規(guī)律提供數(shù)據(jù)參考。方法 從2013年-2015年HCoV-OC43檢測(cè)陽(yáng)性的呼吸道樣本中提取核酸，用逆轉(zhuǎn)錄方法擴(kuò)增cDNA，利用特異性引物擴(kuò)增全長(zhǎng)纖突蛋白基因（S）、聚合酶基因（RdRp）和核蛋白基因（N）。用Mega 6.0軟件進(jìn)行序列拼接、進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建和S蛋白氨基酸比對(duì)。結(jié)果 從16份HCoV-OC43陽(yáng)性樣本中獲得全長(zhǎng)S、RdRp和N基因。其中2013年的1株為D基因型，2014年的8株均為D基因型，2015年的7株中包括3株B、3株D和1株E（CH）基因型。B和D基因型的S蛋白分別有9個(gè)和16個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變與分離年份有關(guān)，B基因型中氨基酸突變呈累加現(xiàn)象，D基因型中出現(xiàn)連續(xù)突變和回復(fù)突變。結(jié)論 HCoV-OC43表現(xiàn)為多基因型共流行，D基因型高流行?？乖鞍譙的氨基酸突變?cè)诟骰蛐土餍兄衅鹬匾饔谩１狙芯繛橥晟坪拓S富對(duì)HCoVOC43的分子流行特征的認(rèn)識(shí)提供了數(shù)據(jù)參考。

【主題詞】 人冠狀病毒OC43；基因型；突變；流行

Fund programs：Nationa1 Major Science&Techno1ogy Project for＂Contro1 and Prevention of Major Infectious Diseases of China＂ （2012ZX10004206）；New Century Exce11ent Ta1ents in University （3332013127）

人冠狀病毒（Human Coronavirus，HCoV）是常見(jiàn)的呼吸道病毒，為巢病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，是有包膜的單股負(fù)鏈RNA病毒［1］。在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的六種HCoV（229E、NL63、OC43、HKU1、SARSCoV和MERS-CoV）中，HCoV-OC43在人群中的檢出頻次最高，且由于其從1967年就被發(fā)現(xiàn)，是用于研究HCoV分子流行特點(diǎn)的重要模型［1，2］。HCoVOC43基因組全長(zhǎng)約30.7 kb。編碼包含16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白的開(kāi)放閱讀框架1ab、ORF2a、血凝素-酯酶蛋白、纖突蛋白（Spike，S）、ORF5a、小囊膜蛋白、膜蛋白和核衣殼（Nuc1eocapsid，N）蛋白［1］。其中抗原基因S、聚合酶RdRp和N蛋白的基因是HCoV進(jìn)化分析的主要功能基因［2-4］。

基因重組和基因突變是病毒進(jìn)化采用的兩種策略［5］?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn) HCoV-OC43有多種基因型［2-4，6］，由重組產(chǎn)生的新基因型不斷出現(xiàn)［2，3，6］?；谌L(zhǎng)的S、RdRp和N基因的分型研究表明，有A、B、C、D、E（中國(guó)命名，CH）和E（法國(guó)命名，F(xiàn)R）6個(gè)基因型及 F和 G分枝［2-4］。前期對(duì)我國(guó) 2005-2012年的HCoV-OC43的研究發(fā)現(xiàn)存在B、C、D基因型共流行，在2010年后出現(xiàn)重組產(chǎn)生的新 E （CH）基因型［2］。上述發(fā)現(xiàn)對(duì)初步闡釋HCoV-OC43的流行趨勢(shì)提供了重要參考，而明確病毒的流行規(guī)律還需要更長(zhǎng)的研究時(shí)間和更多的基因序列信息。因此，我們對(duì)2013年至2015年流行的HCoV-OC43開(kāi)展了進(jìn)化分析，以完善和豐富對(duì)其分子流行特點(diǎn)的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1樣本來(lái)源 HCoV-OC43陽(yáng)性的呼吸道樣本來(lái)自2013年至2015年采集自北京兒童醫(yī)院、北京協(xié)和醫(yī)院、深圳市第三人民醫(yī)院和哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院的呼吸道感染病例，樣本采集均具備知情同意。

1.2核酸提取與基因擴(kuò)增 用easyMAG全自動(dòng)核酸提取儀（法國(guó)生物梅里埃）提取總核酸，最終洗脫體積為55μ1。取6μ1總核酸為模板，用SuperScriptTMIII逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、隨機(jī)引物pN（6）和O1igod（T）（美國(guó)Invitrogen產(chǎn)品）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。取1 μ1 cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增S、RdRp和N基因的特異性引物及PCR反應(yīng)條件參考Zhang等的報(bào)道［2］。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序或者克隆測(cè)序。

1.3全基因組序列的拼接與進(jìn)化分析 獲得的測(cè)序序列在MEGA（版本6.0）軟件中進(jìn)行拼接，以GenBank中發(fā)表全序列為參考，牛冠狀病毒（Bovincoronavirus，BCoV）mebus株為外源序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)［7］。

1.4氨基酸突變位點(diǎn)分析 將本研究獲得的S蛋白氨基酸序列按照基因型分組，與GenBank中發(fā)表的序列用MEGA（版本6.0）中C1usta1W比較分析S蛋白氨基酸突變情況。B和D基因型氨基酸位點(diǎn)參比株分別為 87309-BE03（AY903459）和 HK04-02 （JN129835）。

2 結(jié)果

2.1基因擴(kuò)增結(jié)果 通過(guò)對(duì)研究期間HCoV-OC43病例樣本的基因擴(kuò)增，從其中16例病例樣本中獲得S、RdRp和N全基因序列，病例年齡分布1個(gè)月～64歲。病例的各年分布分別為2013年1例，2014 年8例，2015年 7例。序列 GenBank編號(hào)為KU745533-KU745580。

2.2序列進(jìn)化分析 將獲得的S、RdRp和N基因與GenBank中發(fā)表的參考基因序列進(jìn)行比對(duì)，以BCoV Mebus株為外源序列構(gòu)建了進(jìn)化樹(shù)。如圖1所示，在S基因進(jìn)化樹(shù)上，本研究分離的3株HCoVOC43毒株與已知的B基因型位于同一進(jìn)化分枝，12株與已知的D基因型進(jìn)化關(guān)系較近，1株與本課題組前期發(fā)現(xiàn)并命名的E（CH）基因型進(jìn)化關(guān)系較近。基于N和RdRp基因的進(jìn)化分析結(jié)果與S基因的結(jié)果相似。

2.3各基因型年分布特點(diǎn) 為進(jìn)一步明確各基因型的年度分布特點(diǎn)，將明確分型的16株樣本按采集年份繪圖。如圖2所示，2013年的1例和2014年的8例均為D基因型，2015年的7例分別為3例B、3 例D和1例E（CH）基因型。

2.4S蛋白氨基酸位點(diǎn)的突變分析 在B基因型中，與 2003年首次鑒定的毒株 87309-BE03 （AY903459）比較，其后獲得的毒株S蛋白有9個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變與分離年份相關(guān)。如表1所示，2004年后毒株均出現(xiàn)L69I突變，2006年后增加R34I和F481L，2008年后增加F31L，2010年后增加K184N、D266N和E805D，2012年的毒株增加了N470D和L504S。在各年分離的D基因型有16個(gè)位點(diǎn)的氨基酸突變與分離年份相關(guān)。如表2所示，與2004年的HK04-02（JN129835）比較，其后分離的毒株序列有4個(gè)氨基酸位點(diǎn)出現(xiàn)連續(xù)突變，包括L/R265P、G/Y/H521S、P/F535L和C/T546S；4個(gè)位點(diǎn)為回復(fù)突變N/D33N、T/K93T、D/H120D和L/S195L；8個(gè)位點(diǎn)為單向突變，包括 P22T、P38L、K90L、K184N、S263R、D266K、I267D和T276S。

●本研究獲得的毒株圖1　HCoV-OC43 S、N和RdRp基因進(jìn)化樹(shù)●Strains in this studyFig.1 Phy1ogenetic trees of HCoV-OC43 S，N and RdRp genes

圖2　HCoV-OC43陽(yáng)性樣本基因型時(shí)間分布Fig.2 Genotype distributions of HCoV-OC43 over time

3 討論

HCoV-OC43基因遺傳多樣性首次于2005年由比利時(shí)的研究小組報(bào)道［6］。2011年Lau等首次用2004-2011年在中國(guó)香港收集的29株HCoV-OC43病例樣本將HCoV-OC43分為A-D 4個(gè)基因型，2004年出現(xiàn)基因重組來(lái)源的D基因型［3］。本課題組前期對(duì)我國(guó)2005-2012年北京等地區(qū)采集的65株序列的研究，發(fā)現(xiàn)存在B、C和D基因型的共流行，2010年出現(xiàn)重組產(chǎn)生的新E基因型［2］。隨后，Kin等對(duì)2001-2013年15株來(lái)自美國(guó)和法國(guó)的序列分析，提出存在E基因型，基于RdRp和N基因分析提出存在F和G分枝［4］。但Kin等提出的E（FR）基因型與基于我國(guó)樣本發(fā)現(xiàn)的E（CH）基因型毒株序列并不在同一個(gè)進(jìn)化分枝上。本研究結(jié)果表明我國(guó)2013-2015年的HCoV-OC43仍為B、D和E（CH）基因型。這與已有的研究結(jié)果一致［2］，提示近年我國(guó)HCoV-OC43基因型的穩(wěn)定流行。

抗原基因S氨基酸突變?cè)贖CoV-OC43流行中具有重要作用［7］。以往研究發(fā)現(xiàn)B基因型中也存在S蛋白氨基酸的突變［7］。基于本研究增加的2015年B基因型序列，進(jìn)一步明確在S1區(qū)域氨基酸突變位點(diǎn)隨分離年份呈逐年累加的特點(diǎn)。在D基因型中發(fā)現(xiàn)已有報(bào)道的N33D、K90L和K184N仍存在2013年后的D基因型中［7］，但是93、120和195位出現(xiàn)回復(fù)突變，而521位點(diǎn)由Y/H連續(xù)突變到S，263R和265P僅在2015年后的D基因型中檢測(cè)到，D基因型中的回復(fù)突變和連續(xù)突變?cè)谝酝难芯恐形匆?jiàn)報(bào)道。上述從B和D基因型中發(fā)現(xiàn)的氨基酸突變位點(diǎn)和特征，對(duì)深入探討S基因在CoV進(jìn)化中的突變?nèi)萘繕O限提供了重要的數(shù)據(jù)參考。

對(duì)HCoV-OC43遺傳多樣性的研究報(bào)道來(lái)自多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，但各基因型或分枝的出現(xiàn)具有明顯的時(shí)間分布特征，包括E（FR）1983-2005年，F(xiàn)1995-1996年，B2003-2006年/2010-2015年，C2004-2006年，D2004-2015年，E（CH）2010-2015年，G2012年［2-4，6，7］。表明HCoV-OC43在全球具有相似的分子流行特征。本研究關(guān)于基因型分布特點(diǎn)的分析為完善和豐富對(duì)HCoV-OC43的分子流行特征的認(rèn)識(shí)提供了數(shù)據(jù)參考。

表1　不同時(shí)間分離的B基因型S蛋白氨基酸位點(diǎn)突變分析Tab.1 Amino acids mutations of S protein for B genotype over time

表2　不同時(shí)間分離的D基因型S蛋白氨基酸位點(diǎn)突變分析Tab.2 Amino acids mutations of S protein for D genotype over time

致謝：感謝首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院、深圳市第三人民醫(yī)院和哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院的臨床工作人員協(xié)助采集臨床樣本。

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The characteristics of genotype distributions for human coronavirus OC43 between 2013 to 2015

JiaBaoqian，Xiao Yan，Wang Ying，Ren Lili，Wang Jianwei Institute of Pathogen Biology，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100730，China

Ren Lili，Email：renliliipb@163.com

Objective To identify the characteristics of HCoV-OC43genotype in recent years. Methods Nuc1eic acids were extracted from HCoV-OC43-positive respiratory specimens co11ected from 2013 to 2015.The cDNA were generated by reverse transcription.Specific primers were used to amp1ify the fu11 1ength of spike（S），RNA dependent RNA po1ymerase（RdRp）and Nuc1eocapsid（N）genes.The sequences assemb1ing，phy1ogenic ana1yzing and amino acids a1ignments were performed by using Mega 6.0 software.Results The genes were successfu1 amp1ified from 16 HCoV-OC43 c1inica1 samp1es.Of the 16 strains，1 from 2013，a11 8 from 2014 and 3 from 2015 be1onged to genotype D，and 3 from 2015 be1onged to genotype B，and 1 from 2015 be1onged to genotype E named by China，E（CH）.The coding po1ymorphisms were found in S protein，with 9 sites in B and 17 sites in D genotypes were between chrono1ogica11y distinct strains.Accumu1ations of amino acids mutations were observed during the evo1ution of B genotype，whi1e reverse and successive changes were found in D genotypes.Conclusions Mu1tip1e genotypes of HCoVOC43 co-circu1ated，with dominant epidemic of D genotype.The genetic drift in S gene p1ays an important ro1e in the epidemic of specific genotype of HCoV-OC43.Our resu1ts provide insights to c1arify the mo1ecu1ar epidemic characteristics of HCoV-OC43.

Human Coronavirus OC43；genotype；mutation；epidemic

“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2012ZX10004206）；協(xié)和青年基金和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助（3332013127）

任麗麗，Emai1：ren1i1iipb@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.016

2016-02-24）