兒童呼吸道感染標(biāo)本人偏肺病毒的分子檢測(cè)與分型

寇宇 于新芬 李鈞 楊旭輝 周銀燕 潘勁草 謝立 孫晝 濮小英 陳樹昶

310021杭州市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科

兒童呼吸道感染標(biāo)本人偏肺病毒的分子檢測(cè)與分型

寇宇 于新芬 李鈞 楊旭輝 周銀燕 潘勁草 謝立 孫晝 濮小英 陳樹昶

310021杭州市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科

目的 了解兒科門診流感樣病例和住院嚴(yán)重急性呼吸道感染病例中人偏肺病毒（hMPV）感染狀況、病毒基因特征。方法 選取2011-2013年杭州地區(qū)哨點(diǎn)醫(yī)院，兒科呼吸道門診、住院病例共2 593例，流感樣病例采集咽拭子1 676份，住院重急性呼吸道感染病例采集氣管吸取物917份。用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)hMPV核酸，陽性樣本用RT-PCR方法對(duì)hMPV融合蛋白（F）基因片段擴(kuò)增、序列與基因分型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果作描述性統(tǒng)計(jì)和樣本率的卡方檢驗(yàn)。結(jié)果 門診檢出率6.62%（111/1 676），住院檢出率6.32（58/917），檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.086，P=0.769）。門診與住院hMPV性別檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 ＜1歲組住院患兒檢出率（6.33%，43/679）高于門診（2.79%，19/681），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.808，P=0.002）。hMPV陽性患兒平均年齡門診（31.33±18.50月）＞住院（10.41±8.28月）。冬季門診檢出率13.56%（59/435）高于住院8.06% （20/248），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.669，P=0.031）。hMPV共感染檢出率住院（31.04%，19/58）高于門診（18.01%，20/111），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.663，P=0.031）。門診和住院hMPV均以A2亞型最多，不同基因型的臨床特征不明顯。結(jié)論 門診與住院hMPV感染率無差異，hMPV陽性患兒平均年齡門診大于住院，冬季hMPV檢出率門診高于住院，門診與住院hMPV共感染主要病原不同，研究期間門診與住院基因型均以A2為主。

【主題詞】 人偏肺病毒；兒童；流感樣病例；住院嚴(yán)重急性呼吸道感染病例；分子分型

Fundprograms：ScientificandTechno1ogica1Deve1opmentProgramofChinaHangzhou （20110833B36，20120533Q24）

人類偏肺病毒 （human metapenumovirus，hMPV）是偏肺病毒屬的一種呼吸道病毒病原，于2001年首次在荷蘭呼吸道疾患兒童的鼻咽分泌物中分離。hMPV感染后可以表現(xiàn)為上、下呼吸道感染［1］，輕者表現(xiàn)為上呼吸道不適、流感樣癥狀，重者為支氣管炎和肺炎。在以往的研究中，各國(guó)學(xué)者都注重對(duì)住院患兒下呼吸道人偏肺病毒感染狀況［2］、臨床特點(diǎn)［3］及病毒分子生物特性研究，對(duì)門診及上呼吸道hMPV感染報(bào)道甚少［4］。本研究收集2011-2013年杭州地區(qū)兒科呼吸道門診ILI及住院SARI為研究對(duì)象，比較其hMPV感染特征。

1 材料與方法

1.1樣本來源 于2011年1月-2013年12月，選取杭州市的2家流感哨點(diǎn)醫(yī)院為監(jiān)測(cè)點(diǎn)，門診以流感樣病例［5］（inf1uenza-1ike i11ness，ILI）、住院以嚴(yán)重急性呼吸道感染病例［6］（Severe Acute Respiratory Infection，SARI）為研究對(duì)象。年齡為14周歲以下兒童共2593例，其中門診（ILI）1676例、兒科住院（SARI）917例。門診男性患兒991例，女性685例；住院男性患兒606例，女性311例。ILI＜1歲681例，1～3歲690例，4～6歲196例，7～14歲109例；SARI＜1歲679例，1～3歲173例，4～6歲39例，7 ～14歲26例。ILI患兒平均年齡25.44±20.37月，年齡中位數(shù) 12月，SARI患兒平均年齡12.16± 11.26月，年齡中位數(shù)6月。由于工作量和實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)等原因，門診僅收集每周一、三的就診當(dāng)日ILI病例咽拭子樣本，住院病例收集當(dāng)日白天新入院SARI痰液抽取物（或氣管吸取物）。全部觀察病例只采1次樣本，采集后及時(shí)填寫錄入信息，并于24 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室。樣本采集過程均告知患兒家屬并征得同意。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 使用QIAGEN RNeasy Mini Kit試劑盒提取樣本病毒總RNA，方法按試劑盒說明書操作，提取基因組RNA-40℃保存。用Rea1-time RTPCR方法檢測(cè)hMPV，引物、探針、擴(kuò)增條件均參照參考文獻(xiàn)［7］，儀器使用美國(guó)ABI公司的Prism 7500型上進(jìn)行。選擇熒光定量RT-PCR檢測(cè)熒光信號(hào)較強(qiáng)、Ct值較小的陽性樣本的核酸，用大連寶生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的日本TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，以隨機(jī)六聚體引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA進(jìn)行傳統(tǒng)RT-PCR，檢測(cè)hMPV融合蛋白（F）基因片段，引物、擴(kuò)增條件與參考文獻(xiàn)［8］一致，目的片段526 bp，符合片段大小的PCR產(chǎn)物經(jīng)用AxyPrep DNA Ge1 Ext ract ion Kit（Ax ygen，USA）純化、回收，送上海生物工程公司測(cè)序。

1.3其他病毒檢測(cè) 用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)流感病毒，引物和探針來自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心，包括A型和B型流感通用引物、季節(jié)性H1N1 和H3N2亞型分型引物、甲型H1N1亞型分型引物。反應(yīng)程序?yàn)?2℃逆轉(zhuǎn)錄15 min后，95℃變性30 s，然后進(jìn)入45個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（95℃變性5 s，55℃退火并延伸30 s）。呼吸道合胞病毒引物、探針和反應(yīng)條件按文獻(xiàn)［9］進(jìn)行。儀器使用美國(guó)ABI公司的Prism 7500型擴(kuò)增儀。

1.4基因分型 采用基因測(cè)序分型方法，用DNAStar軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank中公布的多株hMPV的F基因序列進(jìn)行比對(duì)，并用Mega 5.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。序列分析所用參考序列均來源NCBI 的GenBank（ht tp：//www.ncbi.n1m.nih.gov）注冊(cè)hMPV病毒株，各亞型參考株登錄號(hào)：A1：NL00-1 （AF371337），A2a：NL00-17（AY298021）、CAN97-83 （AY297749），A2b：BJ1887（DQ843659）、JPS03-240 （AY530095），B1：NL99-1（AY525842），B2：CAN98-75（AY297748）、BJ1816（DQ843658），禽肺病毒APC（AF579780）。同時(shí)將杭州地區(qū)hMPV F蛋白核苷序列提交GenBank注冊(cè)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析。計(jì)量資料采用±s表示，計(jì)數(shù)資料采用率或構(gòu)成比（%）表示。其平均年齡和感染率估計(jì)描述性統(tǒng)計(jì)方法?？ǚ綑z驗(yàn)比較兩個(gè)樣本hMPV感率和不同年齡組病毒感染，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1臨床表現(xiàn) 本次研究共選擇2593份病例，其中門診1676例ILI，臨床主要為流感樣癥狀，發(fā)熱（體溫≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者。住院的917 SARI病例，其中6～14歲40例，臨床表現(xiàn)符合流感樣癥狀，主要有呼吸困難、呼吸頻率≥25次/min；≤5歲877例臨床表現(xiàn)符合流感樣癥狀，主要為氣促：呼吸頻率大于60次/min（＜2個(gè)月的嬰兒）、呼吸頻率大于50次/min（2～11月齡嬰兒）、呼吸頻率大于40次/min（1～5歲），臨床主要診斷為急性支氣管肺炎、毛細(xì)支氣管炎、遷延性支氣管炎等。

2.2感染流行病特點(diǎn)

2.2.1門診與住院中hMPV檢出率：門診ILI樣本hMPV檢出率6.62%（111/1676），住院SARI檢出率6.32%（58/917），檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.085，P=0.769）。門診、住院男、女患兒檢出率差異無統(tǒng)計(jì)意義（χ2=0.287，P=0.592），見表1。

2.2.2門診與住院病例hMPV年齡組比較：門診hMPV感染平均年齡為（31.33±18.50）月，住院為（10.41±8.28）月。＜1歲組檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。hMPV陽性齡組構(gòu)成，門診1～3歲組最高占64.86%（72/111），住院 ＜1歲組最高占74.13%（42/58）。

2.2.3門診與住院病例hMPV感染時(shí)間比較：2011 年hMPV門診呼吸道感染的檢出高峰在2～3月，住院hMPV高峰在5～6月；2011-2012年冬門診流行高峰在11月至次年4月，住院是在12月至次年6月；2012-2013年hMPV門診流行高峰在11月至次年4月，住院是在12月至次年5月?？傮w住院兒童hMPV檢出流行高峰滯后門診2個(gè)月，見圖1，比較門診與住院hMPV冬季檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.2.4門診與住院病例hMPV共感染情況：39份hMPV與流感、呼吸道合胞病毒共混合感染樣本中，門診與住院與2種病毒共感染檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。門診hMPV病例主要與INF混合感染占60.00%（12/20），住院hMPV主要與RSV占63.15%（12/19）。

表1　呼吸道門診與住院患兒hMPV陽性資料的比較Tab.1 A comparison ana1ysis of c1inica1 features of human Metapneumovirus infections between inpatients and outpatients of respiratory tract infections

圖1　杭州地區(qū)兒科呼吸道門診和住院病例hMPV檢出情況Fig.1 Detection of human Metapneumovirus in chi1dren with respiratory tract infections in Hangzhou area

2.3門診與住院病例hMPV陽性株基因分型 門診hMPV陽性測(cè)序率為46.84%（52/111），住院hMPV陽性測(cè)序率為62.06%（36/58）。連續(xù)3年監(jiān)測(cè)杭州呼吸道感染患兒存在2種基因型的4個(gè)亞型（A1、A2A、B1、B2），門診樣本未檢出A1亞型，住院樣本未檢出B2亞型。門診（A：26，B：26）與住院（A：21，B；15）基因型別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 0.594，P=0.441）。

門診、住院hMPV陽性株基因序列相似性：門診病例hMPV陽性測(cè)序的52株F融合蛋白序列，各基因型與參考株相似性為78.4%～100%，A基因型與參考株相似性為92.9%～99.9%，B基因型與參考株相似性為91.7%～99.8%。住院病例hMPV陽性測(cè)序的36株hMPV F融合蛋白序列，各基因型與參考株相似性為81.0%～100%，A基因型與參考株相似性為93.1% ～100%，B基因型與參考株相似性為91.5%～100%。杭州地區(qū)的12株hMPV測(cè)序結(jié)果F融合蛋白部分基因序列已收錄GenBank，其中門診 ILI 6株，編號(hào)為 KF729939～KF729944；住院 SARI 6株，編號(hào)為 KF729945 ～KF729944。

2.4門診與住院hMPV基因型別及臨床診斷 88株測(cè)序的hMPV感染患兒，門診52例臨床表現(xiàn)為發(fā)熱（體溫≥38℃），伴有咳嗽、咽痛之一，由于這部分病例臨床癥狀較輕，主要以高熱為主要癥狀，基因型的臨床特征不明顯。住院的36例患兒A基因型21例，診斷急性支氣管肺炎18例、毛細(xì)支氣管炎3例；B基因型15例，診斷急性支氣管肺炎10例、遷延性支氣管炎2例、毛細(xì)支氣管炎1例、肺炎2例。

患有基礎(chǔ)性疾病情況，門診ILI由于流動(dòng)性大，未能及時(shí)收錄相關(guān)信息。住院測(cè)序分型的36例患兒有基礎(chǔ)疾病占34.37%（11/32），其中患有先天性心臟病占21.87%（7/32）。A基因型6例，患先天性心臟病4例（同時(shí)患有輕度貧血、室性早搏1例；先天喉喘鳴1例；三體綜合征、先天性腦發(fā)育異常1例）、先天性喉骨軟化癥1例、腎缺如1例；B基因型5例患兒，患有先天性心臟病3例、左側(cè)胸壁血管瘤1例，不完全川崎病1例。

3 討論

在前期的研究中，課題組曾報(bào)道杭州地區(qū)呼吸道感染患兒hMPV的檢測(cè)及流行情況，本研究主要對(duì)門診ILI和住院SARI中hMPV感染進(jìn)行比較。為期3年的監(jiān)測(cè)，杭州門診流感樣病例中6.62%感染患兒與hMPV有關(guān)，住院嚴(yán)重急性呼吸道感染病例中6.32%感染患兒與hMPV有關(guān)，這一結(jié)果高于朱汝南等［4］2004-2006年在北京開展的研究報(bào)道，1289份門診患兒的咽拭子 29份 hMPV陽性（2.25%）、2041份住院患兒的鼻咽洗液81份hMPV陽性（3.96%）的結(jié)果；杭州住院嚴(yán)重急性呼吸道感染病例患兒hMPV檢測(cè)結(jié)果低于蘇州地區(qū)［10］住院兒童hMPV的檢出率為8.9%結(jié)果?？赡苡捎诓±x擇標(biāo)準(zhǔn)不同，地理位置存在南、北方地區(qū)差異有關(guān)。在以往對(duì)hMPV的研究中，國(guó)內(nèi)外都注重對(duì)住院兒童的下呼吸道感染的研究，而對(duì)門診病例及上呼吸道hMPV感染研究甚少。本研究發(fā)現(xiàn)門診ILI中有相當(dāng)比例的hMPV感染患兒，不容忽視。

本次研究hMPV陽性患兒門診ILI平均年齡（31.33±18.50月）大于住院SARI為（10.41±8.28月）。＜1歲組住院患兒檢出率6.33%（43/679）高于門診2.79%（19/681），檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在hMPV感染的門診ILI患兒中1～3歲最多，占64.86%，住院 SARI患兒中 ＜1歲最多，占74.13%。提示門診ILI1～3歲組和住院SARI＜1歲組hMPV感染威脅更大。杭州hMPV感染大多在冬季和初春，研究表明杭州地區(qū)：不同來源病例樣本選擇季節(jié)檢出率明顯不同，冬季呼吸道門診ILI的hMPV檢出率（13.56%）高于同期住院 SARI （8.06%）患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，hMPV感染住院病例流行高峰滯后門診，可能與門診為流感樣病例就診早，住院患兒來源與分診病例。

hMPV與流感病毒、呼吸道合胞病毒共感染率住院SARI病例（32.75%）高于門診ILI（18.01%），檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。門診病例hMPV主要與INF混合感染（60.00%），可能與流感病毒高居門診呼吸道病毒流行首位有關(guān)；住院病例hMPV陽性與RSV有高比例共同感染（63.15%），與 Konig B［11］等學(xué)者發(fā)現(xiàn)有60%hMPV感染的兒童合并RSV感染，結(jié)果是相一致。

監(jiān)測(cè)期間杭州地區(qū)呼吸道門診流感樣病例和住院嚴(yán)重急性呼吸道感染病例hMPV株各存在3個(gè)基因亞型（A2、B1和B2；A1、A2和B1）流行。在前期研究中2009.11-2011.1杭州僅為B1基因亞型［12］，2011年以B1亞型為優(yōu)勢(shì) （10/12），2012年以A2亞型為優(yōu)勢(shì)流行型（8/12）［13］。門診52株測(cè)序分析A2占50.00%、B1占34.61%、B2占15.38；住院測(cè)序的36株分型A2占55.55%、B1占41.66%、A1 占2.77%。門診hMPV陽性未檢測(cè)到A1亞型，住院未檢測(cè)到B2亞型。有研究認(rèn)為，A型hMPV的致病性高于B型［14］，另一份報(bào)道則認(rèn)為兩種型別的致病性沒有差別［15］。我們對(duì)杭州地區(qū)兒童的hMPV陽性的ILI、SARI基因分型統(tǒng)計(jì)未發(fā)現(xiàn)有差異。由于缺乏臨床、影象學(xué)等資料，不能全面反映臨床與基因型的特征，這些都有待于今后的研究。

本研究仍存在一些局限性，如兒科呼吸道門診僅收集流感樣病例，觀察病例缺乏臨床資料和預(yù)后的信息。hMPV作為新發(fā)現(xiàn)的人類急性呼吸道感染的病毒病原，越來越受到人們的重視，在今后的研究中我們將逐步完善研究?jī)?nèi)容，擴(kuò)大樣品的檢測(cè)范圍、數(shù)量和檢測(cè)時(shí)間，進(jìn)行數(shù)據(jù)積累和分析，進(jìn)一步評(píng)估hMPV相關(guān)疾病的危害，對(duì)該病毒的預(yù)防和控制感染提供更多的科學(xué)依據(jù)。

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Molecular detection and typing of human Metapnenmovirus in children with respiratory tract infection

Kou Yu，Yu Xinfen，Li Jun，Yang Xuhui，Zou Yinyan，PanJincao，Xie Li，Sun Zhou，Pu Xiaoying，Cen Shuchang
Microbiology Laboratory，Hangzhou Center for Disease Contorl and Prevention，Hangzhou 310021，China

Kou Yu，Email：kouyu09@126.com

ObjectiveTo understand the infection status and mo1ecu1ar features of human metapnenmovirus（hMPV）among pediatric outpatients and inpatients.Methods A11 2 593 chi1dren with respiratory tract infections who visited the sentine1 survei11ance hospita1s from 2011 to 2013 in Hangzhou，，inc1uding 1 050 outpatients and 1 016 inpatients，were invo1ved in this study.The throat swabs were co11ected from inf1uenza-1ike i11ness（ILI）in the c1inic，and trachea1 aspirates from hospita1ized chi1dren with severe acute respiratory infection（SARI）.The specimens were tested using quantitative rea1-time reverse transcription po1ymerase chain reaction（RT-PCR）.The fusion（F）protein gene of hMPV was amp1ified for sequencing and phy1ogenetic ana1ysis.Results The positive rate was 6.62%（111/1 676）in outpatients and 6.32%（58/917）in inpatients，which showed no statistica11y significant difference by comparing the rates（χ2=0.086，P=0.769）.The positive rate in inpatient（6.33%，43/679）was higher than that in outpatient（2.79%，19/681）in chi1dren＜1 year of age（χ2=9.808，P=0.002）.The average age of hMPV-positive outpatients（31.33±18.50 months）was e1der than inpatients（（31.33±18.50 months）.The positive rate in outpatients（13.56%，59/435）was higher than that in inpatient（8.06%，20/248）in winter（χ2=4.669，P=0.031）.The co-infection rate in inpatients（31.04%，19/58）was higher than that in outpatients（18.01%，20/111）（χ2=4.663，P=0.031）.Data showed that 3 vira1 subtypes appeared in outpatient specimens，and the genotype A2 occurred most frequent1y.The c1inica1features showed no difference in a11 subtypes.ConclusionsThe rates of hMPV infection showed no significant difference between outpatients and inpatients.The average age of outpatients was o1der than the age of inpatients who infected the hMPV.The positive rate in outpatients was higher than that in inpatient in winter.The main pathogens co-infected with hMPV were different in outpatients and inpatients.The genotype A2 was predominant in the study.

Human Metapneumovirus；Chi1dren；Inf1uenza-1ike i11ness；Severe acute respiratory infection；Mo1ecu1ar typing

杭州市科技局資助項(xiàng)目（20110833B36，20120533Q24）

寇宇，Emai1：kouyu09@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.013

2015-01-04）