重組病毒MVA-S的構(gòu)建及其在小鼠中的免疫效果

臧晚春 潘瑞 陳國敏 畢勝利 曾毅

102206北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

重組病毒MVA-S的構(gòu)建及其在小鼠中的免疫效果

臧晚春 潘瑞 陳國敏 畢勝利 曾毅

102206北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的 構(gòu)建表達(dá)HBsAg重組MVA病毒，鑒定其抗原性并探討不同免疫策略對免疫效果的影響。方法 通過基因克隆的方法構(gòu)建攜帶目的基因的重組pSC11質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒與MVA病毒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后，發(fā)生同源重組，經(jīng)數(shù)輪藍(lán)白斑篩選后，獲得攜帶目的基因的重組病毒MVA-S。通過PCR和Western B1ot鑒定目的基因的表達(dá)。分別采用單獨(dú)免疫和聯(lián)合免疫的策略免疫BALB/c小鼠，通過ELISpot檢測細(xì)胞免疫水平。結(jié)果 PCR和Western B1ot證實(shí)MVA-S攜帶目的基因并具有抗原性。ELISpot結(jié)果顯示MVA-S能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫，MVA-S與DNA-S疫苗單獨(dú)免疫效果無統(tǒng)計學(xué)差異；DNA-S疫苗和MVA-S聯(lián)合免疫效果強(qiáng)于DNA-S疫苗單獨(dú)免疫；等劑量DNA-S疫苗初始免疫，高劑量MVA-S加強(qiáng)免疫效果更強(qiáng)；2種DNA疫苗（pVR-S、pcDNA-S）分別初始免疫、等劑量MVA-S加強(qiáng)免疫，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 研究成功構(gòu)建了表達(dá)目的基因的重組病毒MVA-S，該重組病毒可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫，聯(lián)合免疫效果更強(qiáng)。

【主題詞】 痘苗病毒安卡拉株；乙肝表面抗原；聯(lián)合免疫

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染可造成急性或慢性肝臟疾病，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（Wor1d Hea1th Organization，WHO）公布數(shù)據(jù)，每年約有78萬人死于急性或慢性乙型肝炎［1］。目前藥物治療不能徹底清除感染者體內(nèi)HBV復(fù)制，且有藥物副作用、耐藥性等缺點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)慢性乙肝患者體內(nèi)HBV免疫耐受狀態(tài)與T細(xì)胞耗竭有關(guān)［2］，因此研究者提出治療型疫苗概念，通過疫苗呈遞抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫，打破免疫耐受狀態(tài)，從而清除HBV［3］。痘苗病毒安卡拉株（Modified vaccinia Ankara，MVA）為絨毛尿囊膜痘苗病毒安卡拉株（Chorioa11antois vaccinia virus Ankara，CVA）在雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）中連續(xù)傳代571次獲得，曾在全球消滅天花運(yùn)動中廣泛應(yīng)用，因其外源基因容量大、復(fù)制缺陷性、高安全性等特點(diǎn)，成為理想疫苗載體之一，諸多以MVA為載體，針對感染性疾病如HIV/ AIDs、瘧疾、結(jié)核、丙肝、癌癥等的候選疫苗已開展臨床前實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)［4］。

本研究構(gòu)建了表達(dá)HBsAg基因的重組MVA-S病毒，鑒定外源基因攜帶與表達(dá)后，探討了單獨(dú)免疫和聯(lián)合免疫策略下小鼠的免疫效果。

1 材料與方法

1.1材料 表達(dá)HBsAg的pVR-S和pcDNA-S質(zhì)粒由陳國敏教授構(gòu)建，pSC11穿梭質(zhì)粒為本室保存；pS-、pS+和TKR-、TKL+引物對分別擴(kuò)增目的基因和病毒 TK區(qū)基因，為陳國敏教授設(shè)計，合成由Invitrogen公司完成；Mouse γ-IFN ELISpot試劑盒為Mabtech公司產(chǎn)品。MVA毒株和BHK-21細(xì)胞為本室保存，CEF為本所董婕老師饋贈；4～6周齡BALB/c小鼠購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2方法

1.2.1重組質(zhì)粒pSC11-S構(gòu)建：用PCR方法擴(kuò)增HBsAg基因片段。將目的基因和pSC11質(zhì)粒經(jīng)Sa1 I和Bg1 II雙酶切后用T4連接酶連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在含X-ga1和氨芐青霉素的LB平板上挑取單克隆，得到重組質(zhì)粒pSC11-S，測序鑒定。

1.2.2重組病毒MVA-S構(gòu)建：pSC11-S轉(zhuǎn)染已感染MVA的BHK-21細(xì)胞，48 h后凍融裂解細(xì)胞收獲病毒。以10倍病毒稀釋液感染 CEF，48 h后加37℃預(yù)熱的中性紅和X-ga1低熔點(diǎn)瓊脂糖膠，約2 h后挑取最大稀釋度的藍(lán)色克隆，重復(fù)篩選至第3代時開始采用PCR鑒定，篩選至10代以后，連續(xù)3次PCR和Western B1ot鑒定獲得重組病毒MVA-S，擴(kuò)增純化。

1.2.3重組病毒MVA-S的鑒定：取MVA-S病毒液感染BHK-21細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，凍融3次后胰酶消化，用酚氯仿法提DNA，引物分別用pS+和pS-、TKL+和pS-、pS+和TKR-、TKL+和TKR-，擴(kuò)增鑒定MAV-S。用上樣buffer處理病毒感染的細(xì)胞，同法處理等量未感染病毒的細(xì)胞，作為陰性對照，進(jìn)行SDS-PAGE膠電泳，電泳完畢后將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜，5%脫脂奶4℃下過夜封閉，鼠HBsAg單抗（1∶100稀釋）4℃下過夜孵育，TBST振蕩洗膜3次后，加ALP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1∶1000稀釋）室溫孵育2 h，TBST振蕩洗膜3次，按顯色試劑盒說明書顯色。

1.2.4重組MVA-S病毒大量擴(kuò)增與純化：用MVAS病毒液感染BHK-21細(xì)胞，大量擴(kuò)增重組病毒，超聲破碎細(xì)胞大約30 s，4℃下12000 rpm離心5 min，收集上清。SW41超離管中加一半體積的36%蔗糖溶液，小心緩慢加入等體積病毒液，4℃下30000×g離心1 h，棄上清，用1 m1 10 mmo1/L Tris-HC1 pH9.0重懸病毒沉淀，凍存于-80℃，用噬斑法測定滴度。1.2.5 重組病毒MVA-S免疫小鼠：4～6周齡SPF級雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分組，每組5只。單獨(dú)免疫策略：2×pVR-S、2×pcDNA-S、2×MVA-S、2×TE（空白對照），質(zhì)粒100 μg/只/次，MVA-S 8.4×107pfu/只/次，于第1、3周免疫，第4周處死小鼠取脾細(xì)胞。聯(lián)合免疫策略：2×pcDNA-S/1×低劑量MVA-S（DDMS-L）、2×pcDNA-S/1×中劑量MVA-S （DDMS-M）、2×pcDNA-S/1×高劑量 MVA-S （DDMS-H）、2×pVR-S/1×低劑量MVA-S（PPMSL）、2×pVR-S/1×中劑量MVA-S（PPMS-M）、2× pVR-S/1×高劑量MVA-S（PPMS-H），以同樣DNA疫苗初免、MVA加強(qiáng)作為對照。質(zhì)粒劑量同單獨(dú)免疫，于第1、5周免疫，MVA-S低、中、高劑量分別為8.4×107pfu/只/次、1.8×108pfu/只/次、3.6×108pfu/只/次，對照組MVA劑量同相應(yīng)劑量組MVA-S，于第7周免疫，第8周處死小鼠取脾細(xì)胞。

1.2.6ELISpot檢測細(xì)胞免疫反應(yīng)：小鼠處死后無菌操作取出脾臟，分離脾細(xì)胞。ELISpot樣品檢測孔中加入50 μ1濃度為10 μg/m1三肽混合物，陽性刺激孔中加入50 μ1含0.05 μg/m1 PMA和10 μg/m1離子霉素的10%FBS 1640培養(yǎng)基，陰性孔不加刺激物。每孔加入5×105個脾細(xì)胞（sp1enocytes），孵育48 h，顯色40 min，其余操作同說明書。使用AID EL1ispot Reader計數(shù)儀計數(shù)孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)，計算樣品孔與陰性孔斑點(diǎn)均值差，并將其換算成106個脾細(xì)胞形成斑點(diǎn)數(shù)（SFC/106sp1enocytes）。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件對各組百萬脾細(xì)胞形成斑點(diǎn)數(shù)進(jìn)行分析，多組比較采用隨機(jī)區(qū)組方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒pSC11-S鑒定 重組質(zhì)粒pSC11-S 經(jīng)Sa1 I和Bg1 II酶切和測序分析目的基因的連接位點(diǎn)和序列正確。

2.2重組病毒 MVA-S鑒定 未感染病毒正常CEF鋪膠后，細(xì)胞被中性紅著紅色；感染MVA母病毒的CEF不能被中性紅著色，顯白斑；由于重組病毒MVA-S攜帶LacZ基因，經(jīng)X-ga1誘導(dǎo)后感染重組病毒MVA-S的CEF顯藍(lán)斑。重組病毒經(jīng)連續(xù)藍(lán)白斑篩選至10代后，采用PCR方法擴(kuò)增目的基因片段，Western B1ot方法檢測目的基因的表達(dá)，結(jié)果顯示目的基因插入方向正確，并有目的蛋白表達(dá)。

2.3ELISpot結(jié)果

2.3.1單獨(dú)免疫：2×MVA-S組與2×MVA組SFC/ 106sp1enocytes差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.56，P= 0.012）；2×pVR-S組與2×TE組SFC/ 106sp1enocytes差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.67，P= 0.0063）；2×pcDNA-S組與 2×TE組SFC/ 106sp1enocytes差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.40，P= 0.009）。2×MVA-S、2×pcDNA-S以及2×pVR-S組之間隨機(jī)區(qū)組方差分析結(jié)果表明三組的SFC/106sp1enocytes差別無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.68，P= 0.580），見圖1。

2.3.2聯(lián)合免疫：各聯(lián)合免疫實(shí)驗(yàn)組與對照組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，t檢驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.3.3相同DNA疫苗初始免疫，使用不同劑量MVA-S加強(qiáng)免疫：DDMS-L、DDMS-M、DDMS-H三劑量組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.30，P=0.004），兩兩比較結(jié)果顯示DDMS-L和DDMS-M劑量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-1.28，P=0.675），DDMS-M 和DDMS-H劑量組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t= -2.93，P=0.038），DDMS-L和DDMS-H劑量組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-4.21，P=0.004）。PPMSL、PPMS-M、PPMS-H三劑量組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=12.67，P=0.001），兩兩比較結(jié)果顯示PPMS-L 和PPMS-M劑量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t= -1.80，P=0.289），PPMS-M和PPMS-H劑量組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-3.167，P=0.024），PPMSL和 PPMS-H劑量組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t= -4.97，P=0.001），見圖2。

Note：?：P＜0.05；??：P＜0.01圖1　單獨(dú)免疫組ELISpot斑點(diǎn)形成數(shù)Fig.1 ELISpot of sing1e immunization strategy

表1　2×DNA/1×MVA-S與2×DNA/1×MVA組t檢驗(yàn)Tab.1 t test of 2×DNA/1×MVA-S group and 2×DNA/1×MVA group

Note：?：P＜0.05；??：P＜0.01圖2　不同劑量MVA-S疫苗加強(qiáng)免疫斑點(diǎn)數(shù)Fig.2 SFC of different MVA-S doses boost groups

（4）不同質(zhì)粒載體、相同外源基因的DNA疫苗初始免疫，相同劑量MVA-S加強(qiáng)免疫：等劑量MVAS下，不同載體DNA疫苗組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2　不同DNA疫苗初始免疫以及相同MVA-S加強(qiáng)免疫效果比較（t檢驗(yàn)）Tab.2 t test of efficacy among different DNA primes with same MVA-S boost groups

3 討論

目前乙肝治療型疫苗研究中，以我國聞玉梅院士團(tuán)隊(duì)研發(fā)的 “乙克”和古巴“NASVAC”領(lǐng)先臨床試驗(yàn)，前者臨床III期試驗(yàn)結(jié)果顯示“乙克”實(shí)驗(yàn)組和鋁佐劑對照組受試者的血清HBV DNA水平和肝功指標(biāo)正?；什町悷o統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）［5］，NASVAC臨床III期試驗(yàn)尚未發(fā)布試驗(yàn)結(jié)果。其他治療型疫苗，如抗原抗體復(fù)合物疫苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗仍處于臨床前期實(shí)驗(yàn)或臨床I期試驗(yàn)階段［6-9］。本研究在本室研究基礎(chǔ)上［10］，構(gòu)建了表達(dá)HBsAg的重組病毒MVA-S可引起小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，該疫苗用于DNA疫苗初始免疫后加強(qiáng)免疫，可產(chǎn)生更強(qiáng)免疫效果，這一結(jié)果符合既往聯(lián)合免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果［11］，聯(lián)合免疫效果優(yōu)于單獨(dú)免疫的原因可能為前者能引起更高水平的CD8+T細(xì)胞免疫、Th1型CD4+T細(xì)胞免疫，有研究提出聯(lián)合免疫可以減弱抗載體反應(yīng)。聯(lián)合免疫亦存在缺點(diǎn)，免疫效果可受多種因素影響，如劑量、間隔、載體類型、抗載體反應(yīng)等等［12］。本研究高劑量組MVA-S （3.6×108pfu/只）加強(qiáng)免疫效果明顯高于中劑量和低劑量組，其原因可能是低劑量免疫傾向于引起免疫記憶，而高劑量引起免疫效應(yīng)［13］。本實(shí)驗(yàn)同時研究了相同MVA-S、不同DNA疫苗初始免疫效果差異，結(jié)果表明DNA疫苗載體對免疫效果影響無統(tǒng)計學(xué)意義，但實(shí)驗(yàn)并未研究不同病毒載體對免疫效果的影響，而加強(qiáng)免疫用病毒載體可能對免疫效果影響更大。有研究表明使用不同病毒載體疫苗可能獲得更強(qiáng)免疫效果，如DNA/MVA/Adv三種載體HIV疫苗序貫免疫小鼠獲得的免疫效果強(qiáng)于DNA/Adv兩種疫苗聯(lián)用的免疫效果［14］，后續(xù)研究可以比較表達(dá)HBsAg的不同病毒載體疫苗加強(qiáng)免疫效果。此外，本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)不同DNA疫苗免疫間隔影響最終免疫效果，間隔1周免疫效果不一定最好，要獲得理想的免疫間隔，還需要更多實(shí)驗(yàn)。

［1］ 乙 型 肝 炎.http：//www.who.int/mediacentre/factsheets/ fs204/zh/.

［2］ Miche1 ML，Deng Q，Mancini-Bourgine M.Therapeutic vaccines and immune-based therapies for the treatment of chronic hepatitis B：perspectives and cha11enges.J Hepato1，2011，54：1286-96. doi：10.1016/j.jhep.2010.12.031.

［3］ Mancini-BourgineM，Miche1ML.Therapeuticvaccination against chronic hepatitis B virus infection.J C1in Viro1，2005，60：257-65.doi：10.1016/S1386-6532（05）80019-8.

［4］ Sanchez-Sampedro L，Perdiguero B，Mjias-Perez E，et a1.The evo1ution of poxvirus vaccines.Viruses，2015，7：1726-803. doi：10.3390/v7041726.

［5］ Xu DZ，Wang XY，Shen XL，et a1.Resu1ts of a phase III c1inica1tria1withanHBsAg-HBIGimmunogeniccomp1ex therapeutic vaccine for chronic hepatitis B patients：experiences and findings.J Hepato1，2013，59：450-6.doi：10.1016/j. jhep.2013.05.003.

［6］ Li J，Ge J，Ren S，et a1.Hepatitis B surface antigen（HBsAg）and core antigen（HBcAg）combine CpG o1igodeoxynuc1etides as a nove1 therapeutic vaccine for chronic hepatitis B infection. Vaccine，2015，33：4247-54.doi：10.1016/j.vaccine.2015. 03.079.

［7］ Cavenaugh JS，Awi D，Mendy M，et a1.Partia11y randomized，non-b1inded tria1 of DNA and MVA therapeutic vaccines based on hepatitis B virus surface protein for chronic HBV infection.PLoS One，2011，6：e14626.doi：10.1371/journa1.pone.0014626.

［8］ Yang SH，Lee CG，Park SH，et a1.Corre1ation of antivira1 T-ce11 responses with suppression of vira1 rebound in chronic hepatitis B carriers：a proof-of-concept study.Gene Ther，2006，13：1110-7.doi：10.1038/sj.gt.3302751.

［9］ MartinP，DuboisC，JacquierE，eta1.TG1050，an immunotherapeutic to treat chronic hepatitis B，induces robust T ce11s and exerts an antivira1 effect in HBV-persistent mice.Gut，2015，64：1961-71.doi：10.1136/gutjn1-2014-308041.

［10］ 陳丹瑛，汪孟冉，何小周，等.HIV-1中國流行株CRF01_AE env基因改造及其重組DNA疫苗的構(gòu)建.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2014，28：227-229.doi：10.3760/cma.j.issn. 1003-9279.2014.03.023.

［11］ Dep1a E，Van Der AA A，Livingston B D，et a1.Rationa1 design of a mu1tiepitope vaccine encoding T-1ymphocyte epitopes for treatment of chronic hepatitis B virus infections.Journa1 of viro1ogy，2008，82：435-50.doi：10.1128/jvi.01505-07.

［12］ Kardani K，Bo1hassani A，Shahbazi S.Prime-boost vaccine strategy against vira1 infections：Mechanisms andbenefits. Vaccine，2016，34：413-23.doi：10.1016/j.vaccine.2015. 11.062.

［13］ Vaccineimmuno1ogy.http：//www.who.int/immunization/ documents/E1sevier_Vaccine_immuno1ogy.pdf？ua=1.

［14］ Zhang L，Yang L，F(xiàn)eng X，et a1.Combined immunization of mice with DNA，rMVA and rAd5 expressing HIV-1 structura1 genes from different subtypes.Curr HIV Res，2012，10：498-503.10.2174/157016212802429776.

Construction of recombinant MVA-S and its immune effect in mice

Zang Wanchun，Pan Rui，ChenGuomin，Bi Shengli，Zeng Yi State Key Laboratory for Infectious Disease Control and Prevention，National Institute for Viral Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China

Chen Guomin，Email：guominch2013@163.com；Zeng Yi，Email：zengyicdc@ sina.com

Objective To construct the recombinant modified vaccinia Ankara vaccine expressing HBsAg and investigate its antigenicity and immune effect by different strategies.Methods Target gene was c1oned into p1asmid pSC11，the recombinant p1asmid pSC11-S was transfected into BHK-21 ce11s that infected with MVA.Homo1ogous recombination occurred between MVA and pSC11-S.The recombinant virus MVA-S was se1ected by severa1 rounds of b1ue/c1ear p1aques.Target gene was identified by PCR.The expression of target gene was ana1yzed by Western B1ot.The BALB/c mice were immunized with sing1e immunization and consecutive immunization strategy.The 1eve1 of specific ce11u1ar response was measured by ELISpot assays.Results The recombinant virus expressing target gene was confirmed by PCR and Western B1ot showed that MVA-S cou1d e1icit specific ce11u1ar response.There were no significant differences among two kinds of DNA vaccine and recombinant MVA-S.The prime/boost regimen cou1d induce higher ce11u1ar response than sing1e DNA vaccine immunization.High doses of MVA-S boost with the same DNA vaccine prime cou1d induce highest response.There was no significant difference between different DNA vaccines （pVR-S，pcDNA-S）fo11owed by same MVA-S boost.ConclusionsMVA-S expressing target was constructed successfu11y，and it cou1d induce specific ce11u1ar immune response which was higher with the strategy of DNA prime/MVA-S boost than that of sing1e immunization.

Modified vaccinia Ankara；HBsAg；Consecutive immunization

陳國敏，Emai1：guominch2013@163.com；曾毅，Emai1：zengyicdc@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.010

2015-12-24）