茶皂素對奶牛瘤胃發(fā)酵及瘤胃微生物區(qū)系的影響

嚴(yán)淑紅　趙士萍　蔣琦暉　方洛云　周　敏　閔婉平　蔣林樹*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點實驗室，北京102206；2.生命科學(xué)研究所，北京102206)

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茶皂素對奶牛瘤胃發(fā)酵及瘤胃微生物區(qū)系的影響

嚴(yán)淑紅1趙士萍1蔣琦暉1方洛云1周敏1閔婉平2蔣林樹1*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點實驗室，北京102206；2.生命科學(xué)研究所，北京102206)

本試驗旨在研究茶皂素對奶牛瘤胃發(fā)酵及瘤胃微生物區(qū)系的影響。試驗選用12頭健康狀況良好，體重相近的荷斯坦奶牛，隨機分為4組，均飼喂基礎(chǔ)飼糧，各組分別灌服0(對照)、20、30、40 g/d茶皂素，茶皂素與水混勻灌服，進行預(yù)試期14 d，正試期35 d的飼養(yǎng)試驗。正試期期間每隔7 d，在晨飼前1 h用口腔采樣器采集瘤胃液測定瘤胃發(fā)酵指標(biāo)，用實時定量PCR(qRT-PCR)法測定瘤胃微生物含量。結(jié)果表明：1)與對照組相比，茶皂素顯著降低了瘤胃液pH(30、40 g/d組)、氨態(tài)氮的濃度(20、30、40 g/d組)(P<0.05)，但均未超過正常范圍值；茶皂素顯著提高了微生物蛋白(30、40 g/d組)、丙酸(20、30、40 g/d組)和丁酸濃度(20、30、40 g/d組)(P<0.05)，30 g/d組的微生物蛋白濃度提高了20.20%；但茶皂素對總揮發(fā)性脂肪酸和乙酸濃度的影響不顯著(P>0.05)。2)與對照組相比，茶皂素各組的瘤胃液原蟲、溶纖維丁酸弧菌含量均顯著降低(P<0.05)，甲烷菌、白色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌、真菌含量沒有顯著變化(P>0.05)。綜上所述，補飼茶皂素改善了奶牛瘤胃發(fā)酵模式，并顯著影響了奶牛瘤胃微生物區(qū)系，30 g/d的劑量對奶牛較為適宜。

茶皂素；奶牛；瘤胃發(fā)酵；微生物區(qū)系

與單胃動物相比，奶牛的生理特點是具有瘤胃，瘤胃可以為多種微生物提供棲息地，而奶牛瘤胃發(fā)酵的本質(zhì)是瘤胃內(nèi)微生物對飼料纖維素、蛋白質(zhì)等物質(zhì)進行發(fā)酵、降解，以實現(xiàn)更有效的利用[1]，但瘤胃發(fā)酵同時會造成能量與氨態(tài)氮(NH3-N)的損失以及產(chǎn)生甲烷等，造成環(huán)境污染[2]。因此，選擇科學(xué)、有效的飼料添加劑調(diào)控瘤胃發(fā)酵是發(fā)掘奶牛營養(yǎng)潛力，提高飼料轉(zhuǎn)化率，改善乳品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)。

茶皂素又稱茶皂苷，是一種從茶樹種子(茶籽、茶葉籽)中提取的五環(huán)三萜類糖甙化合物[3]，由7種配基、4種糖體和2種有機羧酸組成[4]。茶皂素已廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥生產(chǎn)[5]、化工業(yè)[6]、動物養(yǎng)殖[7]等方面，研究表明，茶皂素不僅是一種天然的表面活性劑，而且具有廣泛的生物活性作用，可用作反芻動物瘤胃發(fā)酵調(diào)控劑，改善動物生產(chǎn)性能[8]。來海良等[9]研究報道，在飼糧中添加茶皂素可抑制原蟲生長，改善反芻動物的生產(chǎn)性能。Hu等[10]的體外產(chǎn)氣試驗報道，將8 mg茶皂素添加到30 mL發(fā)酵液中，瘤胃發(fā)酵液原蟲數(shù)量可減少79%。王洪榮等[11]研究報道，在山羊飼糧中添加茶皂素和絲蘭皂苷混合物可降低瘤胃液pH，降低乙酸/丙酸。Zhou[12]研究結(jié)果表明，反芻動物飼糧中添加茶皂素，總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)產(chǎn)量沒有顯著變化，甲烷產(chǎn)量減少，改變了瘤胃發(fā)酵模式。綜合來看，目前關(guān)于茶皂素對奶牛瘤胃發(fā)酵模式的調(diào)控研究還鮮見報道，尤其是對奶牛瘤胃發(fā)酵及瘤胃微生物區(qū)系的影響。因此，本試驗對泌乳期奶牛灌服茶皂素，研究其對奶牛瘤胃發(fā)酵與瘤胃微生物區(qū)系的影響，為茶皂素作為奶牛瘤胃發(fā)酵添加劑提供試驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗動物與管理

本試驗于2014年8月至2014年9月在北京市三元綠荷奶牛養(yǎng)殖中心南口二分場進行。選取12頭體況良好、體重為(550±30) kg，日產(chǎn)奶量約為35 kg/d，胎次為2～4胎的健康荷斯坦奶牛。按產(chǎn)奶量、胎次、泌乳期等相近原則隨機分為4組，每組3頭奶牛。試驗期間，飼喂飼糧參考牛場的全混合日糧(total mixed ration,TMR)飼喂方案，試驗牛每天07：30、14：30、21：30飼喂和擠奶。TMR飼喂后，試驗牛自由運動和飲水。TMR組成及營養(yǎng)水平表1。

1.2試驗設(shè)計

對照組和試驗組均飼喂TMR，由于茶皂素適口性差，試驗牛不能固定采食，因此選擇每天晨飼前灌服茶皂素，20、30、40 g茶皂素事先分別溶于200 mL水中。試驗組分別于晨飼前通過灌服20、30、40 g/d茶皂素，整個試驗期共49 d，其中預(yù)試期14 d，正試期內(nèi)每7 d于晨飼前1 h采集瘤胃液。

1.3樣品采集和測定

1.3.1瘤胃液的采集

晨飼前1 h用口腔采樣器采集瘤胃液，4層紗布過濾后用便攜pH測定儀測定瘤胃液pH。其他樣品存入液氮中用于其他瘤胃發(fā)酵指標(biāo)和微生物區(qū)系的測定。

1.3.2瘤胃液NH3-N、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)、微生物蛋白(MCP)濃度的測定

瘤胃液解凍后5 000×g離心10 min，收集上清液用于NH3-N、VFA和MCP濃度的測定。瘤胃液NH3-N濃度采用分光光度計，按照Broderick等[13]的方法測定。瘤胃液MCP濃度采用比色法按照周奕毅[14]的方法測定。瘤胃液VFA濃度以2-乙基丁酸(2-EB)為內(nèi)標(biāo)采用氣相色譜法，按照胡偉蓮等[15]方法測定。

表1　TMR組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of the diet：Fe 3 000 mg，Cu 4 560 mg，Mn 4 590 mg，Zn 12 100 mg，Se 200 mg，I 270 mg，Co 60 mg，VA 2 000 000 IU，VD3450 000 IU，VE 10 000 IU，煙酸 nicotinic acid 3 000 mg。

2)泌乳凈能為計算值，其他營養(yǎng)水平為實測值。NELwas a calculated value, while other nutrient levels were measured values.

1.3.3瘤胃液中瘤胃微生物含量的測定

1.3.3.1瘤胃微生物總DNA的提取

采用珠磨-十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取總DNA[16]，取1.5 mL瘤胃液1 000×g離心棄上清液，加入800 μL CTAB緩沖液和滅菌鋯珠(0.3 g 0.1 mm,0.1 g 0.5 mm)后置于珠磨儀上破碎2 min，70 ℃水浴20 min后13 000×g離心10 min，取500 μL上清液與500 μL飽和酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)混合后13 000×g離心10 min，取300 μL上清液與280 μL異丙醇混勻后室溫靜置5 min沉淀DNA，離心后用TE緩沖液溶解DNA，用微量紫外可見分光光度計測定提取的總DNA濃度和純度，-20 ℃保存。

1.3.3.2實時定量PCR(qRT-PCR)的反應(yīng)條件及引物的設(shè)計與合成

qRT-PCR的反應(yīng)條件參照SYBR Premix Ex TaqTM試劑建立20 μL反應(yīng)體系及反應(yīng)條件[17]。qRT-PCR的引物參照文獻[18-20]報道的瘤胃總細菌總菌(total bacteria)、真菌(fungi)、甲烷菌(methanogen)、原蟲(protozoa)、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)、黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)引物序列(表2)。

從瘤胃微生物總DNA中擴增細菌16S rDNA檢測引物特異性。qRT-PCR反應(yīng)體系： Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0) 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 0.5 μL，滅菌雙蒸水8.5 μL，總體積為20 μL。qRT-PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃變性7 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ l min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 延伸7 min。

表2　qRT-PCR引物信息

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)qRT-PCR測得的閾值循環(huán)(Ct)和以下公式將目標(biāo)菌含量表示為相對于瘤胃總菌16S rDNA的百分比：

目標(biāo)菌含量(%)=100×2-(Ct目標(biāo)菌-Ct總細菌)[17]。

使用Excel整理試驗數(shù)據(jù)，采用SAS 9.2軟件中的one-way ANOVE進行單因素方差分析，采用Duncan氏法進行平均值的多重比較，P<0.05為差異顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié)　果

2.1茶皂素對瘤胃發(fā)酵的影響

灌服茶皂素后所得瘤胃發(fā)酵參數(shù)如表3所示。與對照組相比，添加30、40 g/d茶皂素均顯著降低了瘤胃液pH(P<0.05)，添加20、30、40 g/d茶皂素均顯著降低了瘤胃液NH3-N濃度(P<0.05)，添加40 g/d茶皂素顯著降低了瘤胃液乙酸/丙酸(P<0.05)，添加30、40 g/d茶皂素均顯著提高了瘤胃液MCP濃度(P<0.05)，30 g/d茶皂素組與對照組相比MCP提高了20.20%，添加20、30、40 g/d茶皂素均顯著提高了瘤胃液丙酸和丁酸濃度(P<0.05)，TVFA和乙酸濃度各組間差異不顯著(P>0.05)。

表3　茶皂素對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05)，while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)． The same as below.

由圖1至圖3可見，茶皂素在各個時間點均可以降低瘤胃液pH、NH3-N濃度，可升高MCP濃度，但pH、NH3-N濃度均未超出正常的生理范圍，并且隨著時間的變化，變化規(guī)律并不一致。其中pH、NH3-N濃度變化沒有明顯的規(guī)律，MCP產(chǎn)量在30 g/d組最高。

由圖4至圖8可見，茶皂素可升高各時間點丙酸、丁酸濃度，總體上降低乙酸/丙酸，而TVFA、乙酸濃度沒有明顯變化。隨著時間的變化，丙酸、丁酸濃度有先增加后降低，再升高的趨勢，而乙酸/丙酸沒有明顯的變化規(guī)律，在40 g/d茶皂素組相對較低。

圖1　茶皂素對瘤胃液pH的影響

圖2　茶皂素對瘤胃液MCP濃度的影響

圖3　茶皂素對瘤胃液NH3-N濃度的影響

圖4　茶皂素對瘤胃液總揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響

圖5　茶皂素對瘤胃液乙酸濃度的影響

圖6　茶皂素對瘤胃液丙酸濃度的影響

圖8　茶皂素對瘤胃液丁酸濃度的影響

2.2瘤胃微生物DNA的反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果

利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物進行檢測的結(jié)果見圖9。每個擴增產(chǎn)物均與預(yù)期擴增片段大小相符，并且擴增所得的目的片段均呈1條的亮帶，無雜帶和拖尾現(xiàn)象，說明設(shè)計的引物及提取的基因組DNA均可用于qRT-PCR。

2.3茶皂素對瘤胃微生物含量的影響

灌服茶皂素后對瘤胃微生物含量的影響如表4所示。與對照組相比，添加20、30、40 g/d茶皂素組與對照組相比均顯著降低了瘤胃液原蟲、溶纖維丁酸弧菌含量(P<0.05)，對真菌、甲烷菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌含量沒有顯著影響(P>0.05)。

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2：總菌(130 bp)；3、4：原蟲(250 bp)；5、6：真菌(120 bp)；7、8：黃色瘤胃球菌(190 bp)；9、10：白色瘤胃球菌(270 bp)；11、12：甲烷菌(140 bp)；13、14：產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(134 bp)；15、16：溶纖維丁酸弧菌(136 bp)。

M: DNA molecular weight marker; lanes l and 2: total bacteria (130 bp); lanes 3 and 4: protozoa (250 bp); lanes 5 and 6: fungi (120 bp); lanes 7 and 8:Ruminococcusflavefaciens(190 bp); lanes 9 and 10:Ruminococcusalbus(270 bp); lanes 11 and 12: methanogens (140 bp); lanes 13 and 14:Fibrobactersuccinogenes(134 bp); lanes 15 and 16:Butyrivibriofibrisolvens(136 bp).

圖9　瘤胃細菌、真菌和原蟲DNA反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果

由圖10至圖16可知，茶皂素對各個時間點的原蟲、溶纖維丁酸弧菌均有明顯的抑制作用，真菌、甲烷菌、白色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌含量沒有明顯變化。隨著時間的變化，真菌、白色瘤胃球菌含量有先升高后下降的趨勢，其他各菌沒有明顯的變化規(guī)律，但隨著茶皂素劑量的增加，原蟲、溶纖維丁酸弧菌含量下降明顯，黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、甲烷菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌含量變化趨勢沒有明顯的規(guī)律。

3　討　論

3.1茶皂素對奶牛瘤胃發(fā)酵的影響

瘤胃液pH是評價瘤胃發(fā)酵狀況的基本指標(biāo)，主要受到飼糧精粗比等因素的影響[21]。瘤胃是瘤胃微生物發(fā)酵的直接場所，pH過高或過低對于瘤胃微生物正常生長、發(fā)育及發(fā)酵均有不利的影響[22]。原蟲、厭氧性真菌、細菌生存的最適pH分別為5.8、7.5和6～7，而正常的奶牛瘤胃液的pH在5.5～6.8變化，最佳pH在6.0～6.3[23]，可見中性至弱酸性環(huán)境是奶牛瘤胃微生物生存的最佳環(huán)境。研究證明，在反芻動物的飼糧中添加茶皂素，可顯著影響瘤胃液pH。周奕毅[14]報道添加茶皂素，可顯著降低湖羊瘤胃液pH，這與葉均安等[24]、Hu等[25]的研究結(jié)果一致。本試驗發(fā)現(xiàn)，添加30、40 g/d茶皂素均顯著降低了奶牛瘤胃液pH，但各試驗組瘤胃液pH在6.32～6.42內(nèi)波動，且均處于正常生理范圍之內(nèi)，因此對奶牛瘤胃微生物正常代謝不會產(chǎn)生不利影響。瘤胃液pH變化的原因可能是去除瘤胃原蟲影響了淀粉和可溶性糖的爆發(fā)性發(fā)酵，其產(chǎn)物丁酸、乳酸增多，而瘤胃壁的吸收速度較慢[26]，因此原蟲數(shù)量的降低可造成瘤胃液pH的下降。

圖10　茶皂素對瘤胃液原蟲含量的影響

圖11　茶皂素對瘤胃液真菌含量的影響

圖12　茶皂素對瘤胃液黃色瘤胃球菌含量的影響

反芻動物瘤胃中有55%～95%的碳水化合物經(jīng)過瘤胃發(fā)酵，分解轉(zhuǎn)化為丙酮酸，進一步分解為VFA。VFA是反芻動物重要能量來源，為反芻動物提供70%～80%的能量，瘤胃代謝活動水平就是以VFA濃度及組成比例作為衡量指標(biāo)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，在反芻動物的飼糧中添加茶皂素，可以改變其瘤胃發(fā)酵模式。葉均安[27]研究報道，茶皂素在湖羊體外試驗中，能顯著增加丙酸濃度。林波等[28]研究報道，茶皂素通過改變瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的VFA組成調(diào)控瘤胃發(fā)酵模式，其正效應(yīng)的原理主要是由于降低了乙酸/丙酸，這與張婷婷[29]瘤胃發(fā)酵研究一致。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，對奶牛灌服茶皂素，顯著增高了丙酸與丁酸濃度，降低了乙酸/丙酸，TVFA濃度無顯著變化。由此可見，茶皂素可以通過改變奶牛瘤胃發(fā)酵模式，提供更多能量，改善飼料轉(zhuǎn)化率。

圖13　茶皂素對瘤胃液甲烷菌含量的影響

圖14　茶皂素對瘤胃液產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌含量的影響

NH3-N是奶牛瘤胃代謝過程中重要的產(chǎn)物，其濃度是瘤胃內(nèi)環(huán)境好壞的重要指標(biāo)。在瘤胃微生物中，約有80%的細菌是以NH3-N為生長的唯一氮源，而瘤胃原蟲不能利用NH3-N合成所需的蛋白質(zhì)，但可以產(chǎn)生大量的NH3-N[30]。有研究表明，茶皂素可以通過抑制原蟲的活性降低瘤胃NH3-N的濃度[31]。葉均安[27]報道，在體外培養(yǎng)時添加0.25%、0.50%和1.00%的茶皂素，可不同程度地降低培養(yǎng)底物中的NH3-N濃度。苑文珠[32]報道，在湖羊瘤胃培養(yǎng)液中添加茶皂素，可顯著降低培養(yǎng)底物中的NH3-N濃度。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，對奶牛灌服不同濃度茶皂素，均顯著降低了NH3-N的濃度，但均在正常范圍內(nèi)。韓正康等[33]認為，當(dāng)瘤胃液NH3-N濃度為8.5 mg/dL時，瘤胃微生物合成蛋白質(zhì)的能力達到飽和，即使超過這一濃度也不會提高MCP產(chǎn)量。NH3-N濃度過高，NH3-N會被瘤胃壁吸收，導(dǎo)致血漿中尿素氮濃度過高，加重機體對氮的代謝負擔(dān)[34]。奶牛灌服茶皂素，能降低NH3-N濃度，會減輕其對瘤胃微生物的負效應(yīng)[35]。

圖15　茶皂素對瘤胃液白色瘤胃球菌含量的影響

圖16　茶皂素對瘤胃液溶纖維丁酸弧菌含量的影響

MCP是反芻動物主要的氮源供應(yīng)者[36]，能提供動物營養(yǎng)所需的40%～80%的氮源量。因此，MCP代謝的好壞決定了瘤胃微生物區(qū)系的營養(yǎng)代謝水平[37]。瘤胃微生物中細菌可利用瘤胃發(fā)酵產(chǎn)物合成MCP，隨食糜進入真胃為機體提供一半以上所需的反芻動物蛋白質(zhì)。原蟲不能自身合成蛋白質(zhì)，只能靠吞噬細菌作為氮源，而在其自溶前到達真胃的比例很小[38]。因此去除原蟲，無疑將會降低蛋白質(zhì)的瘤胃發(fā)酵作用，增加蛋白質(zhì)的利用效率。Bird等[39]研究證實，去除原蟲可明顯提高十二指腸中總氮、非NH3-N、各類氨基酸以及總氨基酸的流通率，使瘤胃MCP的排出量提高20%。苑文珠等[40]研究報道，飼糧添加茶皂素到湖羊瘤胃培養(yǎng)液中，可抑制原蟲活性，提高MCP的產(chǎn)量，0.8%的劑量效果最佳，與胡偉蓮[41]對波爾山羊研究結(jié)果一致。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛飼養(yǎng)過程，輔以灌服茶皂素，MCP濃度顯著升高，而茶皂素對奶牛瘤胃液MCP濃度的影響機制還有待深入研究。

3.2茶皂素對奶牛瘤胃微生物區(qū)系的影響

反芻動物瘤胃中棲息著大量、種類多樣的微生物，主要有瘤胃原蟲、細菌和真菌[42]，而瘤胃發(fā)酵的實質(zhì)為瘤胃微生物幫助動物機體消化纖維素、半纖維素等植物物質(zhì)，因此，瘤胃微生物及其之間的關(guān)系成了瘤胃發(fā)酵調(diào)控的研究的重要部分。

目前對于原蟲去留有2種觀點，一種認為瘤胃原蟲可降解纖維素，并具有穩(wěn)定pH的作用，因此有保留的必要性；另一種則認為，瘤胃原蟲吞噬細菌占瘤胃微生物關(guān)系的主導(dǎo)地位，并且其自溶而亡，無法為宿主提供大量MCP，所以去除原蟲對動物生產(chǎn)更有利。研究發(fā)現(xiàn)，茶皂素對反芻動物瘤胃原蟲具有顯著抑制作用。葉均安等[43]發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)底物中分別添加0.25%、0.50%和1.00%茶皂素，瘤胃原蟲生長受到可不同程度地抑制，瘤胃發(fā)酵狀況得到改善。郭興鳳等[44]證實茶皂素能顯著降低瘤胃液原蟲數(shù)量，將10、20、30、40 g茶皂素分別添加到每千克培養(yǎng)基上可使瘤胃原蟲數(shù)量分別降低19%、25%、45%和79%。Daiz等[45]在綿羊飼糧(315 g/只)中分別添加25和50 g的植物皂素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，原蟲數(shù)量分別降低了57%和84%。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，對奶牛灌服茶皂素，奶牛瘤胃液原蟲含量顯著降低。分析茶皂素的抗蟲作用原理可能是，茶皂素通過與瘤胃原蟲隔膜表面膽固醇復(fù)合，使其無法修復(fù)或脫落，導(dǎo)致細胞膜破壞，使細胞內(nèi)容物滲漏，達到抗蟲效果[46]。

細菌與真菌在反芻動物降解飼糧中纖維物質(zhì)過程中發(fā)揮了80%的作用。有研究報道，在體外，瘤胃液真菌纖維素分解酶活性比瘤胃主要纖維素分解細菌產(chǎn)生的酶活性高[47]，但是由于真菌相對于細菌繁殖速度來說較慢，使得真菌在瘤胃發(fā)酵中并不占主導(dǎo)地位，瘤胃細菌在纖維消耗中占主要地位。瘤胃內(nèi)纖維降解細菌主要是產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌和溶纖維丁酸弧菌[48]。Mao等[37]發(fā)現(xiàn)添加茶皂素對黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量均無影響。張婷婷等[49]研究報道，添加茶皂素對真菌數(shù)量幾乎沒有影響。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，茶皂對瘤胃細菌和真菌的影響作用具有選擇性，奶牛灌服茶皂素，溶纖維丁酸弧菌含量顯著減少，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌含量沒有顯著變化，真菌含量有減少的趨勢，但差異不顯著。對于這種結(jié)果的原因，可能是因為琥珀酸絲狀桿菌為革蘭氏陰性菌，其細胞壁有雙層膜，Wang等[50]報道革蘭氏陰性菌要比瘤胃球菌這種革蘭氏陽性菌對外界物質(zhì)有著更高的耐受力。雖然黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌是革蘭氏陽性菌，但這2種細菌的細胞膜外也有類似于革蘭氏陰性細菌的脂多糖層[51]，可以阻止茶皂素這樣的外源物質(zhì)。

反芻動物瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生甲烷的來源有2個，一個是原蟲自身代謝過程產(chǎn)生，另一個是甲烷菌產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，反芻動物瘤胃內(nèi)，有10%～20%的甲烷菌是和原蟲共生的[52]，這部分甲烷菌依附于原蟲表面既有利于產(chǎn)生甲烷，又有利于原蟲的生長，兩者為互利共生關(guān)系。Vogels等[53]研究表明，原蟲數(shù)量的減少，以及產(chǎn)甲烷菌合成甲烷的原料氫氣產(chǎn)量的降低，都抑制了甲烷的產(chǎn)生。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛瘤胃中添加茶皂素，甲烷菌的含量差異不顯著，但Guo等[54]研究發(fā)現(xiàn)，茶皂素抑制了甲烷菌的甲烷合成關(guān)鍵酶基因mcrA的表達，降低了甲烷菌的活性。研究分析可知，茶皂素對甲烷菌的影響方式可能是通過2種方式，一種是通過抑制與其共生的瘤胃原蟲，進而影響甲烷菌；另一種是直接作用于甲烷菌，降低其活性，但對其數(shù)量無顯著影響。茶皂素對甲烷產(chǎn)量的影響機理有待深入研究。

4　結(jié)　論

① 茶皂素可顯著降低奶牛瘤胃液pH、NH3-N濃度，但均未超出正常生理范圍，可顯著提高牛奶瘤胃液丙酸、丁酸、MCP濃度，降低乙酸/丙酸，TVFA濃度無顯著變化。

② 茶皂素可顯著降低奶牛瘤胃液原蟲、溶纖維丁酸弧菌含量，而對瘤胃液真菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、甲烷菌含量無顯著影響。

③ 綜合認為，30 g/d茶皂素的劑量對奶牛較為適宜。

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(責(zé)任編輯王智航)

, professor, E-mail： kjxnb@vip.sina.com

Effects of Tea Saponin on Rumen Fermentation and Rumen Microflora of Dairy Cows

YAN Shuhong1ZHAO Shiping1JIANG Qihui1FANG Luoyun1ZHOU Min1MIN Wanping2JIANG Linshu1*

(1. Key Laboratory for Dairy Cow Nutrition,College of Animal Science and Technology, Beijing University of Agriculture,Beijing 102206, China; 2. Institute of Life Sciences, Beijing 102206, China)

This experiment was conducted to study the effects of tea saponin on rumenfermentation and rumen microflora of dairy cows. Twelve healthy Holstein cows with similar weight were used, and randomly divided into four groups, all were fed a basal diet and drenched with 0 (control), 20, 30 and 40 g/d of tea saponin in different groups. Tea saponin and water were mixed for drenching. Pre experimental period went 14 days, and the trial period went 35 days. Rumen fluid was collected with oral sampler at 1 h before morning feeding every 7 days during the trail period for determination of rumen fermentation parameters and rumen microorganisms (real-time quantitative PCR method). The results showed as follows: 1) compared with control group, tea saponin significantly reduced rumen fluid pH (30 and 40 g/d groups), ammonia nitrogen concentration (20, 30 and 40 g/d groups) (P<0.05), which were not exceeded the normal range values, but significantly increased microbial protein (30 and 40 g/d groups), propionic acid (20, 30 and 40 g/d groups) and butyric acid concentrations (20, 30 and 40 g/d groups) (P<0.05), and microbial protein concentration of 30 g/d tea saponin group increased 20.20%; however, tea saponin did not significantly affected total volatile fatty acid and acetic acid concentrations (P>0.05). 2) Compared with control group, the contents of rumen fluid protozoa andButyrivibriofibrisolvensof tea saponin groups were significantly decreased (P<0.05), but no significant changes on methanogens,Ruminococcusalbus,Fibrobactersuccinogenes,Ruminococcusflavefaciensand fungi contents were found (P>0.05). In conclusion, the supplementation of tea saponin can improve the pattern of rumen fermentation and has a significant effect on rumen microbial flora, and the optimal level for dairy cows is 30 g/d.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(8)：2485-2496]

tea saponin; dairy cow; rumen fermentation; microflora

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.08.020

2016-02-02

2014年度北京市教育委員會“北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進與培養(yǎng)計劃項目(CIT&TCD20130324)”;北京市農(nóng)業(yè)局“北京市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系奶牛創(chuàng)新團隊”

嚴(yán)淑紅(1987—)，女，山東日照人，碩士研究生，研究方向為反芻動物營養(yǎng)與免疫。E-mail： yanshuhong20096@163.com

蔣林樹，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail： kjxnb@vip.sina.com

S816.7;S823

A

1006-267X(2016)08-2485-12