飼料中膽固醇含量對淡水養(yǎng)殖凡納濱對蝦生長性能、抗弧菌和抗亞硝態(tài)氮脅迫能力的影響

王鑫磊　李　航　黃旭雄,2,3*　趙利斌　閆明磊　趙陸敏　鄭曉龍

(1.上海海洋大學農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海201306；2.上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海201306；3.水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心(ZF1206)，上海201306)

?

飼料中膽固醇含量對淡水養(yǎng)殖凡納濱對蝦生長性能、抗弧菌和抗亞硝態(tài)氮脅迫能力的影響

王鑫磊1李航1黃旭雄1,2,3*趙利斌1閆明磊1趙陸敏1鄭曉龍1

(1.上海海洋大學農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海201306；2.上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海201306；3.水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心(ZF1206)，上海201306)

為研究飼料中膽固醇含量對淡水養(yǎng)殖條件下凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)生長性能、抗弧菌和抗亞硝態(tài)氮脅迫能力的影響，在10%魚粉的基礎(chǔ)上設(shè)計膽固醇添加量分別為0(C0組)、1(C1組)、2(C2組)、3(C3組)和4 g/kg(C4組)的等氮等能飼料(實測飼料中膽固醇含量依次為0.78、1.57、2.45、3.43和4.18 g/kg)，分別投喂初始體重為(0.160±0.002) g的凡納濱對蝦50 d。每種飼料投喂4個網(wǎng)箱，每個網(wǎng)箱養(yǎng)殖凡納濱對蝦50尾。養(yǎng)殖試驗結(jié)束后檢測對蝦的生長性能、肌肉常規(guī)組成以及急性哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)感染及亞硝態(tài)氮脅迫下的死亡情況。結(jié)果表明：凡納濱對蝦的特定生長率和存活率不受飼料膽固醇含量的顯著影響(P>0.05)，但C0組對蝦的飼料系數(shù)顯著高于C2、C3和C4組(P<0.05)。隨飼料膽固醇含量的增加，對蝦肌肉中粗蛋白質(zhì)含量逐漸升高，C3、C4組顯著高于C0組(P<0.05)；肌肉中粗脂肪含量先升高后降低，C2組顯著高于其他組(P<0.05)。肝胰腺和肌肉中膽固醇含量隨飼料膽固醇含量的增加而顯著升高(P<0.05)，血清中膽固醇含量先升高后降低，且C2組顯著高于C0組(P<0.05)。急性感染哈維氏弧菌后，隨飼料膽固醇含量的增加，同一時間點各組對蝦累積死亡率均先降低后升高，C2組在感染24、36、48、72和96 h后的累積死亡率均最低。在8.5～9.0 mg/L亞硝態(tài)氮急性脅迫下，96 h后對蝦累積死亡率與飼料中膽固醇含量呈負相關(guān)，且C0和C1組顯著高于C2、C3和C4組(P<0.05)。綜上所述，淡水養(yǎng)殖條件下，1.57 g/kg的飼料膽固醇含量即可滿足凡納濱對蝦生長的需求，但2.45 g/kg的飼料膽固醇含量可使對蝦獲得最佳的抗弧菌能力和理想的抗亞硝態(tài)氮脅迫能力。

淡水；凡納濱對蝦；膽固醇；生長性能；抗弧菌能力；抗亞硝態(tài)氮脅迫能力

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)是一種世界性養(yǎng)殖的經(jīng)濟對蝦，對鹽度的適應范圍非常廣，經(jīng)逐級馴化后可在淡水環(huán)境中養(yǎng)殖。2013年中國養(yǎng)殖凡納濱對蝦的產(chǎn)量高達142.99萬t，其中43%的產(chǎn)量來自于淡水養(yǎng)殖[1]。然而，鹽度也會改變凡納濱對蝦的新陳代謝和滲透壓調(diào)節(jié)狀態(tài)[2-3]，從而可能影響對蝦體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消耗及其對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的需求。膽固醇又稱膽甾醇，是動物體內(nèi)重要的甾醇，是一種環(huán)戊烷多氫菲的衍生物。膽固醇是動物細胞膜的主要結(jié)構(gòu)性成分之一，可降低細胞膜的流動性和質(zhì)子及鈉離子對細胞膜的通透性[4]。細胞膜中的膽固醇在胞內(nèi)轉(zhuǎn)運過程中也發(fā)揮重要作用，且參與細胞間信號的傳遞[5]。此外，膽固醇還是類固醇激素如雌激素、雄性激素、蛻皮激素、腎上腺皮質(zhì)激素等及維生素D的前體，在生物體中具有重要的生理功能[6]。蝦類等節(jié)肢動物不能利用乙酸合成膽固醇[7]，因此需要在飼料中補充膽固醇以滿足其正常代謝需求。有關(guān)海水養(yǎng)殖條件下凡納濱對蝦對膽固醇的需求已有報道[8-12]，飼料中膽固醇不足和過量均會造成凡納濱對蝦生長性能的下降[8-10]。然而，Gong等[13]認為，飼料中過量添加膽固醇和磷脂可以改善凡納濱對蝦的滲透壓調(diào)節(jié)能力，從而提高凡納濱對蝦在低鹽度水體中的養(yǎng)殖成活率和生長速度。在淡水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，飼料中額外添加膽固醇是否能夠改善凡納濱對蝦的生長性能尚有待證實。近些年，人工養(yǎng)殖凡納濱對蝦病害頻發(fā)，營養(yǎng)調(diào)控被認為是提高凡納濱對蝦免疫機能及抗病能力的重要措施[14]。有關(guān)飼料中膽固醇對凡納濱對蝦影響的報道多集中在生長速度、存活率和飼料系數(shù)等指標上，尚未見飼料中膽固醇對凡納濱對蝦抗感染能力和抗環(huán)境脅迫能力影響的報道。此外，由于魚粉資源短缺，低魚粉飼料是蝦類等偏肉食性養(yǎng)殖動物配合飼料研發(fā)的熱點。研究表明，凡納濱對蝦飼料中魚粉使用量可以降到6%而不影響其正常生長[15]，根據(jù)生長階段和養(yǎng)殖模式，凡納濱對蝦商業(yè)性配合飼料中魚粉用量一般在10%～25%。在當前凡納濱對蝦養(yǎng)殖深受病害制約的形勢下，研究在魚粉含量為10%的生產(chǎn)性飼料中添加膽固醇對淡水綠水(有藻類存在)養(yǎng)殖條件下凡納濱對蝦生長、抗弧菌和抗脅迫能力的影響，具有現(xiàn)實的生產(chǎn)指導意義。

1　材料與方法

1.1飼料制備

按照表1飼料配方，制作5種不同膽固醇含量的等氮等能飼料。將各種原料破碎過80目篩后采用逐級擴大的方法混勻，添加油脂后加水制成面團狀，用絞肉機制成直徑為1.5 mm的條狀，90 ℃熟化20 min，在陰涼避光處風干后，破碎成適合試驗對蝦攝食的粒徑，真空包裝，-20 ℃保存待用。

表1　試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表1項目Items飼料DietsC0C1C2C3C4營養(yǎng)水平Nutrientlevels6)粗蛋白質(zhì)Crudeprotein418.42413.73409.91410.64409.13粗脂肪Crudelipid73.9974.0576.3279.6477.83粗灰分Ash98.1398.8596.5597.2797.83膽固醇Cholesterol0.781.572.453.434.18

1)每千克礦物質(zhì)預混料含有Contained the following per kg of mineral premix：Ca 10.5 g，K 90 g,Mg 12 g,Fe 1.0 g,Cu 3.0 g,Zn 10 g,Mn 3.8 g，Co 0.8 g,Se 20 mg。

2)每千克維生素預混料含有Contained the following per kg of vitamin premix:VA 8 000 000 IU,VD 2 000 000 IU,VE 50 g,VK 10 g,VB15 g,VB215 g,VB68 g,VB120.02 g,煙酰胺nicotinamide 40 g,D-泛酸鈣 calciumD-pantothenate 25 g,葉酸 folic acid 2.5 g,生物素 biotin 0.08 g,肌醇 inositol 100 g。

3)維生素C單磷酸酯純度為35%。L-ascorbate-2-monophosphate purity reached 35%.

4)酵母提取物組成 The composition of yeast extract:丙氨酸 Ala 3.16%,精氨酸 Arg 3.79%,天冬氨酸 Asp 3.75%,半胱氨酸 Cys 1.41%,谷氨酸 Glu 7.51%,甘氨酸 Gly 2.63%,組氨酸 His 3.15%,異亮氨酸 Ile 2.17%,亮氨酸 Leu 5.24%,賴氨酸 Lys 4.90%,蛋氨酸 Met 0.47%,苯丙氨酸 Phe 2.75%,脯氨酸 Pro 1.45%,絲氨酸 Ser 2.59%,蘇氨酸 Thr 2.39%,酪氨酸 Tyr 1.20%,色氨酸 Trp 0.60%,纈氨酸 Val 3.90%。

5)膽固醇純度≥95%。Cholesterol purity≥95%.

6)營養(yǎng)水平為實測值。Nutrient levels were measured values.

1.2養(yǎng)殖管理

試驗用凡納濱對蝦蝦苗購自上海彰顯漁業(yè)專業(yè)合作社的淡化苗(養(yǎng)殖水體鹽度為5)，將購買的蝦苗放養(yǎng)在溫室大棚中水體鹽度為5的水泥池中，每天早晨加淡水20 cm直至水深達到110 cm，之后每天換水30 cm，直至表觀鹽度為0。淡化期間投喂商用蝦片，所進淡水均經(jīng)200目篩絹過濾。蝦苗暫養(yǎng)30 d，待幼蝦規(guī)格達到(0.160±0.002) g時，挑選體質(zhì)健康、規(guī)格整齊的對蝦1 000尾，隨機分配到溫室大棚中懸掛在同一水池(5.0 m×11.0 m×1.2 m)的20個網(wǎng)箱(1.0 m×1.0 m×1.2 m)內(nèi)，每個網(wǎng)箱50尾幼蝦。試驗蝦分別投喂5種試驗飼料，每種試驗飼料投喂4個網(wǎng)箱，日投喂4次，分別在05:30、10:30、16:30和22:30投喂，日投喂量為蝦體重的5%～8%，并根據(jù)天氣和攝食情況進行調(diào)整。養(yǎng)殖試驗持續(xù)50 d。為了維持養(yǎng)殖試驗期間水體藻相和水質(zhì)條件穩(wěn)定，試驗開始時水體中接種耐高溫的四尾柵藻(Scenedesmusquadricauda)和多芒藻(Golenkiniaradiata)，試驗期間每5 d換1次水，進水均用200目篩網(wǎng)過濾，維持水體透明度20～40 cm。養(yǎng)殖期間連續(xù)充氣保持溶解氧濃度>6 mg/L，氨氮濃度<0.2 mg/L，pH為7.8～8.3，水溫(30±2) ℃，表觀鹽度為0。

1.3樣品的采集及指標測定

1.3.1生長性能測定

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，停食24 h，逐個網(wǎng)箱稱重、計數(shù)。然后從每個網(wǎng)箱隨機取蛻皮間期的對蝦8尾，先用1 mL注射器于圍心腔處取血淋巴于1.5 mL離心管中；然后在冰盤上解剖并分別取肝胰腺和肌肉組織，冰盒保存帶回實驗室。血淋巴經(jīng)4 ℃、10 000 r/min離心20 min取血清，將血清和肝胰腺樣品保存在-80 ℃中用于后續(xù)檢測分析。

存活率(SR)、飼料系數(shù)(FCR)和特定生長率(SGR)的計算公式如下：

存活率=100×Nf/Ni；

飼料系數(shù)=Wd/(Wf-Wi)；

特定生長率=100×(lnWf/Nf-lnWi/Ni)/t。

式中：Nf為試驗結(jié)束時整個網(wǎng)箱蝦的尾數(shù)；Ni為試驗開始時整個網(wǎng)箱蝦的尾數(shù)；Wd為每個網(wǎng)箱從試驗開始到試驗結(jié)束所投喂飼料的干重(g)；Wf為試驗結(jié)束時每個網(wǎng)箱中蝦總重(g)；Wi為試驗開始時每個網(wǎng)箱中蝦總重(g)；t為養(yǎng)殖試驗的天數(shù)(d)。

1.3.2飼料及肌肉常規(guī)組成分析

飼料和蝦體肌肉中水分含量采用105 ℃烘箱干燥恒重法測定，粗脂肪含量采用氯仿-甲醇法測定，粗灰分含量采用550 ℃馬弗爐灼燒法測定，粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法(KjeltecTM2300定氮儀,瑞典)測定。

1.3.3飼料、肌肉、肝胰腺和血清中膽固醇含量測定

飼料、肝胰腺、肌肉和血清中膽固醇含量的測定參照文獻[16]的方法進行，具體操作如下：準確稱取冷凍干燥樣品0.200 0～0.500 0 g(血清0.1 mL)于25 mL比色管中，加入0.5 mL的50%氫氧化鉀溶液后立即渦旋混勻；然后加入2 mL的無水乙醇，密封并渦旋混勻后，在超聲波振蕩儀中65 ℃水浴振蕩30 min；取出冷卻至室溫后依次加入0.5 mL 14%三氟化硼甲醇溶液和2 mL無水乙醇，混勻。繼續(xù)在65 ℃水浴中超聲波振蕩30 min；取出冷卻后依次加入3 mL 5%氯化鈉溶液和10 mL石油醚，渦旋振蕩混勻2 min；靜置分層，取上層石油醚溶液4 mL轉(zhuǎn)移到10 mL玻璃試管中，50 ℃真空干燥后加入4 mL甲醇超聲波振蕩溶解，溶液用0.22 μm的針式過濾器過濾后，采用Waters e2695型液相色譜儀聯(lián)合Waters 2998光電二極管陣列檢測器分析膽固醇含量。色譜柱為Waters XbridgeTMC18，5 μm ×4.6 mm×250 mm。參照李黎等[17]的測定條件，流動相為100%甲醇，檢測波長205 nm，流速1.00 mL/min，柱箱溫度38 ℃，進樣50 μL，時間15 min。將膽固醇標準品(Aladdin，純度≥99%)用色譜純甲醇配制成濃度分別為0.001、0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200和0.500 mg/mL的標準溶液，上機檢測并繪制標準曲線，計算回歸方程。用外標法計算各個樣品中的膽固醇含量。

1.4哈維氏弧菌人工急性感染試驗

試驗所用哈維氏弧菌來自上海海洋大學病原庫。待50 d的養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，每組隨機取蛻皮間期的對蝦30尾，分成3個重復，每個重復10尾，以重復為單位暫養(yǎng)于容積為50 cm×30 cm×80 cm的網(wǎng)箱中，每尾蝦腹部注射20 μL 2.5×107CFU/mL的哈維氏弧菌菌液。15個網(wǎng)箱懸掛在同一水泥池中，養(yǎng)殖水體表觀鹽度為0，水溫為27～28 ℃，并持續(xù)曝氣。人工急性感染后連續(xù)觀察對蝦死亡情況，統(tǒng)計各組感染24、36、48、72和96 h后的累積死亡率。

1.5亞硝態(tài)氮人工急性脅迫試驗

50 d的養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，每組另隨機取蛻皮間期的對蝦30尾，分成3個重復，每個重復10尾，以重復為單位暫養(yǎng)于容積為50 cm×30 cm×80 cm的網(wǎng)箱中，所有網(wǎng)箱懸掛于亞硝態(tài)氮濃度為8.5～9.0 mg/L的同一水泥池(2.8 m×4.5 m×1.5 cm)中，每6 h測定水體亞硝態(tài)氮濃度1次。脅迫期間養(yǎng)殖水體表觀鹽度為0，水溫27～28 ℃，并持續(xù)曝氣。人工急性脅迫后連續(xù)觀察對蝦死亡情況，統(tǒng)計各組脅迫24、36、48、72和96 h后的累積死亡率。

1.6數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果用平均值±標準差(mean±SD)的方式表示，使用SPSS 18.0分析軟件對試驗結(jié)果與飼料膽固醇含量之間的關(guān)系進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，若方差分析差異顯著，則再用Duncan氏法進行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2　結(jié)　果

2.1飼料中膽固醇含量對凡納濱對蝦生長性能的影響

由表2可知，50 d養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，隨著飼料中膽固醇含量的增加，各組間存活率無顯著差異(P>0.05)；終末體重隨著飼料中膽固醇含量的增加呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，且C4組顯著高于C0組(P<0.05)；飼料系數(shù)隨著飼料中膽固醇含量的增加呈現(xiàn)降低的趨勢，C2、C3和C4組顯著低于C0組(P<0.05)；特定生長率隨著飼料中膽固醇含量的增加呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，但各組間沒有顯著差異(P>0.05)。

2.2飼料中膽固醇含量對凡納濱對蝦肌肉常規(guī)組成及組織中膽固醇含量的影響

由表3可知，攝食不同膽固醇含量飼料后，各組對蝦肌肉水分含量無顯著差異(P>0.05)；肌肉粗蛋白質(zhì)含量總體上隨著飼料膽固醇含量的增加逐漸增加，C2和C4組顯著高于C0和C1組(P<0.05)；肌肉粗脂肪含量隨著飼料膽固醇含量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且C2組顯著高于其他組(P<0.05)；C2組肌肉粗灰分含量顯著低于C3和C4組(P<0.05)。

表2　攝食不同膽固醇含量飼料的凡納濱對蝦的生長性能

同行數(shù)據(jù)肩標相同或無小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with the same or no small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表3　攝食不同膽固醇含量飼料的凡納濱對蝦的肌肉常規(guī)組成(干物質(zhì)基礎(chǔ))

由表4可知，對蝦肝胰腺及肌肉中膽固醇含量隨著飼料中膽固醇含量的增加呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(P<0.05)；而血清中膽固醇含量則隨飼料膽固醇含量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的變化，C2組對蝦血清膽固醇含量顯著高于C0組(P<0.05)。

表4　攝食不同膽固醇含量飼料的凡納濱對蝦的不同組織中膽固醇含量

2.3飼料中膽固醇含量對凡納濱對蝦抗弧菌能力的影響

圖1所示為攝食不同膽固醇含量飼料的凡納濱對蝦在人工急性感染哈維氏弧菌96 h內(nèi)的累積死亡率曲線。各組對蝦感染哈維氏弧菌后的累積死亡率隨著飼料中膽固醇含量的增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，C2組對蝦感染24和36 h后的累積死亡率顯著低于C0、C3和C4組(P<0.05)。C2組對蝦感染48、72和96 h后的累積死亡率顯著低于其他組(P<0.05)。對蝦感染24、48、72和96 h后的累積死亡率在C0、C3和C4組間沒有顯著差異(P>0.05)。

2.4飼料中膽固醇含量對凡納濱對蝦抗亞硝態(tài)氮脅迫能力的影響

圖2所示為攝食不同膽固醇含量飼料的凡納濱對蝦在人工亞硝態(tài)氮脅迫96 h內(nèi)的累積死亡率曲線。在亞硝態(tài)氮濃度為8.5～9.0 mg/L的脅迫條件下，脅迫48 h前各組累積死亡率無顯著差異(P>0.05)；脅迫72 h時C3和C4組的累積死亡率顯著低于C1組(P<0.05)；脅迫96 h時C0和C1組累積死亡率較高，顯著高于C2、C3和C4組(P<0.05)，同時C2組顯著高于C3組(P<0.05)。

同一時間點，數(shù)據(jù)點標注相同或無小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

In the same time point, data points with the same or no small letters mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.

圖1攝食不同膽固醇含量飼料的凡納濱對蝦感染哈維氏弧菌后的累積死亡率曲線

Fig.1Cumulative mortality curves ofLitopenaeusvannameifed diets containing different

cholesterol contents experiencedVibrioharveyichallenge (n=3)

圖2　攝食不同膽固醇含量飼料的凡納濱對蝦亞硝態(tài)氮脅迫后的累積死亡率曲線

3　討　論

3.1飼料中膽固醇含量對凡納濱對蝦生長性能的影響

飼料中膽固醇含量對凡納濱對蝦生長和存活的影響已有報道。Duerr等[8]在鹽度為35的海水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的研究表明，凡納濱對蝦獲得最佳生長所需的膽固醇含量為2.3～4.2 g/kg飼料(磷脂添加量為10 g/kg飼料)，低于或高于此范圍對蝦的生長均會受到抑制。用半純化飼料在鹽度為25的海水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中養(yǎng)殖凡納濱對蝦幼蝦，其獲得最佳生長所需的膽固醇含量與飼料中的磷脂添加量呈負相關(guān)：飼料中磷脂的添加量分別為50、30、15和0 g/kg時，凡納濱對蝦獲得最佳生長所需的飼料膽固醇含量分別為0.5、1.3、1.4和3.5 g/kg飼料[9]。在鹽度為30的海水養(yǎng)殖條件下，凡納濱對蝦獲得最佳生長所需的飼料膽固醇含量為1.10～1.55 g/kg飼料(磷脂添加量為5 g/kg飼料)[11]。在海水養(yǎng)殖條件下，飼料中膽固醇含量超過9.2 g/kg對凡納濱對蝦的生長有抑制作用[10]。盡管不同學者得出的凡納濱對蝦膽固醇需求量并不完全一致，但海水養(yǎng)殖條件下凡納濱對蝦獲得最佳生長所需的飼料膽固醇含量基本在0.5～4.2 g/kg飼料，與日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)(膽固醇需求5 g/kg飼料)[18]、長毛對蝦(Penaeuspenicillatus)(膽固醇需求5～10 g/kg飼料)[19]、斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)(膽固醇需求2～8 g/kg飼料)[20]等海水蝦類的膽固醇需求基本相當。飼料中過量添加膽固醇和磷脂可以改善凡納濱對蝦的滲透壓調(diào)節(jié)能力，從而提高凡納濱對蝦在低鹽度水體中的養(yǎng)殖成活率和生長速度[13]。然而，研究發(fā)現(xiàn)，在鹽度為4的水體中分別在室內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)和室外池塘中養(yǎng)殖凡納濱對蝦幼蝦，與未添加膽固醇(同時未額外添加磷脂)組相比，飼料中膽固醇添加量為2和4 g/kg的組(同時磷脂添加量分別為5和10 g/kg飼料)的生長性能均無顯著改善[21]。本研究中，各組飼料中膽固醇含量介于0.78～4.18 g/kg，對蝦的生長速度無顯著差異，經(jīng)過50 d的養(yǎng)殖，各組凡納濱對蝦均達到了商品規(guī)格。這表明，在淡水養(yǎng)殖條件下，飼料中添加膽固醇并不能顯著改善凡納濱對蝦在淡水中的生長性能。

本研究中，在淡水綠水(有藻類存在)養(yǎng)殖條件下，各組存活率均較高且組間無顯著差異，這與前人研究結(jié)果[8-11,21]相符。上述結(jié)果表明，無論在海水、半咸水或淡水試驗條件下。凡納濱對蝦的養(yǎng)殖存活率并不會因飼料中膽固醇含量的增加而提高或降低。推測其原因有二：一是凡納濱對蝦對飼料膽固醇缺乏或過量的敏感性相對其他營養(yǎng)素要小，可能機體具有較強的膽固醇調(diào)節(jié)機制，導致飼料膽固醇含量的變化對凡納濱對蝦存活率的影響作用較小。二是養(yǎng)殖系統(tǒng)中存在的藻類及飼料植物蛋白質(zhì)中存在的植物甾醇平衡了飼料膽固醇的作用。植物蛋白質(zhì)及微藻中往往含有豐富的植物甾醇，如麥角固醇、豆甾醇和β-谷甾醇等[22]。植物甾醇與膽固醇結(jié)構(gòu)相似，一方面，雖然有報道稱日本對蝦體內(nèi)不能從乙酸開始合成膽固醇，但可以通過脫烷烴作用將C28和C29固醇轉(zhuǎn)化成膽固醇[23-24]；另一方面，植物甾醇具有抑制膽固醇的吸收、促進膽固醇的降解代謝和抑制膽固醇的生化合成等作用[25]。研究發(fā)現(xiàn)，攝食添加1 g/kg膽固醇飼料的美洲螯龍蝦(Homarusamericanus)的全蝦總甾醇和膽固醇含量較攝食添加1 g/kg膽固醇和1 g/kg植物甾醇飼料的美洲螯龍蝦低[26]。

在本研究中，C2、C3和C4組的飼料系數(shù)顯著低于C0組，表明飼料中膽固醇含量會影響凡納濱對蝦的飼料效率。類似的結(jié)果在海水養(yǎng)殖的凡納濱對蝦及日本囊對蝦中也被證實。凡納濱對蝦在飼料膽固醇含量為0.061～0.155 g/kg時，隨著飼料中膽固醇含量的增加其飼料系數(shù)逐漸降低[11]。在飼料膽固醇含量為0.4～4.3 g/kg時，日本囊對蝦飼料轉(zhuǎn)化率隨飼料膽固醇含量的增加而升高[27]。在包含β-谷甾醇的飼料中添加少量的膽固醇可以提高日本囊對蝦的飼料轉(zhuǎn)化率[28]。在甾醇添加總量為10 g/kg的基礎(chǔ)上，隨著膽固醇和β-谷甾醇的比值降低，日本對蝦的飼料轉(zhuǎn)化率逐漸降低[29]。

3.2飼料中膽固醇含量對組織中膽固醇含量及肌肉常規(guī)組成的影響

本研究表明，從膽固醇的組織分布看，肌肉中膽固醇含量要高于肝胰腺。用膽固醇被14C標記的飼料飼喂食用對蝦(Penaeusesculentus)，72 h后有47%在肌肉中，有40%在肝胰腺中[30]?？紤]到肌肉和肝胰腺組織占全蝦的比例，這表明膽固醇被攝入后主要沉積在肌肉中。凡納濱對蝦肌肉和肝胰腺中膽固醇含量隨飼料中膽固醇含量的增加而顯著增加，但血清中膽固醇含量隨飼料中膽固醇含量的增加先升高后降低。在飼料膽固醇含量為0.4～4.3 g/kg時，日本囊對蝦全蝦膽固醇含量與其所攝食飼料的膽固醇含量呈正相關(guān)[27]。斑節(jié)對蝦全蝦的膽固醇含量隨著飼料中膽固醇含量的增加而增加[20]。然而，在磷脂和膽固醇對于凡納濱對蝦交互作用的研究中卻表明飼料膽固醇含量對肝胰腺和肌肉中膽固醇含量均無顯著影響，但磷脂及磷脂和膽固醇的交互作用對肌肉中膽固醇含量有顯著影響[9]。這或許與磷脂在參與膽固醇運輸中起著重要作用有關(guān)[31]，磷脂含量的改變導致機體膽固醇運輸能力發(fā)生變化。從食品營養(yǎng)角度來說，人體過量攝取膽固醇會引起一系列心血管疾病，而甲殼類肌肉中的膽固醇含量比魚類更高[32]。本研究結(jié)果可以看出，適當降低飼料中的膽固醇含量，可以在不影響?zhàn)B殖對蝦生長的情況下，獲得相對低膽固醇含量的對蝦產(chǎn)品。

長毛對蝦肌肉粗脂肪含量會隨著飼料膽固醇添加量的增加而增加[19]；隨著飼料膽固醇含量增加，凡納濱對蝦全蝦粗脂肪含量也隨之升高[10]。但是，也有研究表明飼料膽固醇含量顯著影響凡納濱對蝦肌肉的粗脂肪含量，但它們之間不存在正相關(guān)性[9]。本研究中，對蝦肌肉中粗脂肪含量隨飼料中膽固醇含量的升高呈先升后降的變化；而肌肉中粗蛋白質(zhì)含量總體上隨著飼料中膽固醇含量的增加而逐漸增加，表現(xiàn)為肌肉粗蛋白質(zhì)含量與肌肉膽固醇含量呈正相關(guān)。推測其原因可能與淡水養(yǎng)殖環(huán)境下凡納濱對蝦的滲透壓調(diào)節(jié)機制有關(guān)。淡水中凡納濱對蝦內(nèi)環(huán)境的滲透壓要高于外環(huán)境，細胞需要阻止外界水分子進入或?qū)⑦M入細胞的水分子主動排出，膽固醇作為細胞膜的成分可以通過抑制脂肪鏈的運動和磷脂頭部集團的旋轉(zhuǎn)來阻止水分和鈉離子的滲透，從而節(jié)省因主動向外泵水而消耗的ATP和能量[33-34]，使得能量更多用于蛋白質(zhì)合成。同時，肌肉是甲殼動物最大的氨基酸庫[35]，游離氨基酸在甲殼動物滲透壓調(diào)節(jié)中也起著重要的作用[3]，膽固醇的滲透壓調(diào)節(jié)作用使得機體無需產(chǎn)生更多的游離氨基酸用于平衡內(nèi)外滲透壓差，也是淡水環(huán)境中凡納濱對蝦肌肉粗蛋白質(zhì)含量與肌肉膽固醇含量呈正相關(guān)的可能原因。

3.3飼料中膽固醇含量對凡納濱對蝦抗弧菌及抗亞硝態(tài)氮脅迫能力的影響

飼料膽固醇含量對于水產(chǎn)動物抗菌能力的研究未見公開報道。在本研究中隨著飼料膽固醇含量的增加，對蝦肌肉和肝胰腺中膽固醇含量也隨之增加，但在弧菌急性感染下對蝦的累積死亡率隨膽固醇含量的升高呈現(xiàn)先降低后升高的變化，飼料膽固醇含量為2.45 g/kg時表現(xiàn)出最強的抗弧菌能力，過高或過低的飼料膽固醇含量均會削弱凡納濱對蝦的抗弧菌能力。機體對營養(yǎng)物質(zhì)的生理反應與營養(yǎng)物質(zhì)水平的關(guān)系呈拋物線關(guān)系，隨營養(yǎng)物質(zhì)的增加，生理反應在達到某個頂點后會反轉(zhuǎn)[36]。機體的抗菌能力與體內(nèi)多種效應因子如溶菌酶、一氧化氮及超氧陰離子等有關(guān)。一氧化氮可以迅速并有效地殺死凡納濱對蝦體內(nèi)的哈維氏弧菌[37]。在對小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，增加飼料膽固醇含量可以使小鼠紅細胞中黃嘌呤氧化酶活性顯著增加，而黃嘌呤氧化酶活性的增加會使機體產(chǎn)生更多的超氧陰離子，發(fā)揮出更強的殺菌效果；但與此同時，過高的膽固醇含量也會抑制紅細胞一氧化氮合成酶的活性，一氧化氮合成酶能催化L-精氨酸轉(zhuǎn)化成L-瓜氨酸，并生成一氧化氮參與抑菌作用[38]。飼料膽固醇含量為2.45 g/kg時凡納濱對蝦表現(xiàn)出最強的抗弧菌能力應該是體內(nèi)各種免疫抗菌效應因子綜合效能的表現(xiàn)。

亞硝態(tài)氮是養(yǎng)殖水體中脅迫并毒害凡納濱對蝦的重要污染物。日本囊對蝦蝦體的水分含量會隨著水體中亞硝態(tài)氮濃度的增加和脅迫時間的延長而增加，同時血淋巴中蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量也會降低，血淋巴滲透壓也有所降低，最終導致機體因代謝紊亂而死亡[39]。本研究中，亞硝態(tài)氮脅迫下各組凡納濱對蝦96 h內(nèi)的累積死亡率隨著飼料中膽固醇含量的增加總體呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，表明飼料中膽固醇含量的提升有助于增加淡水養(yǎng)殖環(huán)境下凡納濱對蝦的抗亞硝態(tài)氮脅迫能力。其作用機理可能與低滲環(huán)境中膽固醇有助于對蝦的滲透壓調(diào)節(jié)有關(guān)，更詳細的機理有待進一步研究。

4　結(jié)　論

綜上所述，在淡水養(yǎng)殖條件下，生產(chǎn)性飼料中1.57 g/kg的膽固醇含量可滿足凡納濱對蝦生長的需求，但2.45 g/kg的膽固醇含量可獲得最佳的抗弧菌能力和理想的抗亞硝態(tài)氮脅迫能力。

[1]農(nóng)業(yè)部漁業(yè)漁政管理局.2015中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2015.

[2]陳垂坤,郜衛(wèi)華,田羅.鹽度和營養(yǎng)素對甲殼動物營養(yǎng)生理的影響研究進展[J].長江大學學報:自然科學版,2015,12(3):47-51.

[3]李二超,陳立僑,曾嶒,等.鹽度對凡納濱對蝦體組織蛋白質(zhì)積累、氨基酸組成和轉(zhuǎn)氨酶活性的影響[J].水生生物學報,2009,33(3):532-538.

[4]LANGE Y,STECK T L.Cholesterol homeostasis and the escape tendency (activity) of plasma membrane cholesterol[J].Progress in Lipid Research,2008,47(5):319-332.

[5]SIMONS K,IKONEN E.How cells handle cholesterol[J].Science,2000,290(5497):1721-1726.

[6]溫小波,陳立僑.磷脂和膽固醇在蝦蟹類營養(yǎng)中的研究進展[J].淡水漁業(yè),2000,30(5):25-27.

[7]TESHIMA S I,KANAZAWA A.Biosynthesis of sterols in the lobster,Panulirusjaponica,the prawn,Penaeusjaponicus,and the crab,Portunustrituberculatus[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Comparative Biochemistry,1971,38(3):597-602.

[8]DUERR E O,WALSH W A.Evaluation of cholesterol additions to a soybean meal-based diet for juvenile Pacific white shrimp,Penaeusvannamei(Boone),in an outdoor growth trial[J].Aquaculture Nutrition,1996,2(2):111-116.

[9]GONG H,LAWRENCE A L,JIANG D H,et al.Lipid nutrition of juvenileLitopenaeusvannamei:Ⅰ.Dietary cholesterol and de-oiled soy lecithin requirements and their interaction[J].Aquaculture,2000,190(3/4):305-324.

[10]NIU J,CHEN P F,TIAN L X,et al.Excess dietary cholesterol may have an adverse effect on growth performance of early post-larvalLitopenaeusvannamei[J].Journal of Animal Science and Biotechnology,2012, 3:19.

[11]MORRIS T C,SAMOCHA T M,DAVIS D A,et al.Cholesterol supplements forLitopenaeusvannameireared on plant based diets in the presence of natural productivity[J].Aquaculture,2011,314(1/2/3/4):140-144.

[12]王美鳳.不同生長階段凡納濱對蝦對卵磷脂、膽固醇和n-3HUFA需要量的研究[D].碩士學位論文.湛江:廣東海洋大學,2013:27-38.

[13]GONG H,JIANG D H,LIGHTNER D V,et al.A dietary modification approach to improve the osmoregulatory capacity ofLitopenaeusvannameicultured in the Arizona desert[J].Aquaculture Nutrition,2004,10(4):227-236.

[14]郭騰飛,黃旭雄,蘇明,等.飼料中銅水平對凡納濱對蝦免疫相關(guān)基因表達和抗菌能力的影響[J].水生生物學報,2012,36(5):809-816.

[16]丁卓平,王明華,劉振華,等.食品中膽固醇含量測定方法的研究與比較[J].食品科學,2004,25(1):130-135.

[17]李黎,劉玉峰,唐華澄,等.高效液相色譜法測定食品中的膽固醇[J].食品科學,2007,28(4):289-291.

[18]KANAZAWA A,TANAKA N,TESHIMA S,et al.Nutritional requirements of prawn.Ⅱ. Requirement for sterols[J].Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries,1971,37(3):211-215.

[19]CHEN H Y,JENN J S.Combined effects of dietary phosphatidylcholine and cholesterol on the growth,survival and body lipid composition of marine shrimp,Penaeuspenicillatus[J].Aquaculture,1991,96(2):167-178.

[20]SHEEN S S,LIU P C,CHEN S N,et al.Cholesterol requirement of juvenile tiger shrimp (Penaeusmonodon)[J].Aquaculture,1994,125(1/2):131-137.

[21]ROY L A,DAVIS D A,SAOUD I P.Effects of lecithin and cholesterol supplementation to practical diets forLitopenaeusvannameireared in low salinity waters[J].Aquaculture,2006,257(1/2/3/4):446-452.

[22]周寶蘭.植物淄醇的應用[J].中國油脂,1992(4):33-38.

[23]TESHIMA S I,KANAZAWA A,SASADA H.Nutritional value of dietary cholesterol and other sterols to larval prawn,PenaeusjaponicusBate[J].Aquaculture,1983,31(2/3/4):159-167.

[24]TESHIMA S I,KANAZAWA A.Turnover of dietary cholesterol and β-sitosterol in the prawn[J].Nippon Suisan Gakkaishi,1987,53(4):601-607.

[25]姚專.植物甾醇的開發(fā)現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢[J].糧食與食品工業(yè),2003(3):22-24.

[26]D’ABRAMO L R,BORDNER C E,CONKLIN D E,et al.Sterol requirement of juvenile lobsters,Homarussp.[J].Aquaculture,1984,42(1):13-25.

[27]TESHIMA S,ISHIKAWA M,KOSHIO S,et al.Assessment of cholesterol requirements in the prawn,Penaeusjaponicus[J].Aquaculture Nutrition,1997,3(4):247-253.

[28]TESHIMA S I,KANAZAWA A.Nutritive value of sterols for the juvenile prawn[J].Nippon Suisan Gakkaishi,1986,52(8):1417-1422.

[29]TESHIMA S I,KANAZAWA A,KOSHIO S,et al.Nutritive value of sitosterol for the prawnPenaeusjaponicus[J].Nippon Suisan Gakkaishi,1989,55(1):153-157.

[30]DALL W,CHANDUMPAI A,SMITH D M.The fate of some14C-labelled dietary lipids in the tiger prawnPenaeusesculentus[J].Marine Biology,1993,115(1):39-45.

[31]TESHIMA S I,KANAZAWA A,KAKUTA Y.Role of dietary phospholipids in the transport of [14C] cholesterol in the prawn[J].Nippon Suisan Gakkaishi,1986,52(4):719-723.

[32]鴻巣章二,橋本周久.水產(chǎn)利用化學[M].郭曉風,鄒勝祥，譯.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1994:92-93.

[33]HAINES T H.Water transport across biological membranes[J].FEBS Letters,1994,346(1):115-122.

[34]PALACIOS E,RACOTTA I S.Salinity stress test and its relation to future performance and different physiological responses in shrimp postlarvae[J].Aquaculture,2007,268(1/2/3/4):123-135.

[35]王悅?cè)?李二超,龍麗娜,等.中華絨螯蟹對鹽度變化的適應及其滲透壓調(diào)節(jié)的研究進展[J].海洋漁業(yè),2011,33(3):352-360.

[36]MERCER L P.The quantitative nutrient-response relationship[J].The Journal of Nutrition,1982,112(3):560-566.

[37]CHEN T,WONG N K,JIANG X,et al.Nitric oxide as an antimicrobial molecule againstVibrioharveyiinfection in the hepatopancreas of Pacific white shrimp,Litopenaeusvannamei[J].Fish & Shellfish Immunology,2015,42(1):114-120.

[38]DEVRIM E,ERGüDERB,?ZBEK H,et al.High-cholesterol diet increases xanthine oxidase and decreases nitric oxide synthase activities in erythrocytes from rats[J].Nutrition Research,2008,28(3):212-215.

[39]CHENG S Y,CHEN J C.Effects of nitrite exposure on the hemolymph electrolyte,respiratory protein and free amino acid levels and water content ofPenaeusjaponicus[J].Aquatic Toxicology,1998,44(1/2):129-139.

(責任編輯菅景穎)

, professor, E-mail: xxhuang@shou.edu.cn

Effects of Dietary Cholesterol Content on Growth Performance,Vibrioand Nitrite Nitrogen Stress Resistant Abilities ofLitopenaeusvannameiCultured in Freshwater

WANG Xinlei1LI Hang1HUANG Xuxiong1,2,3*ZHAO Libin1YAN Minglei1ZHAO Lumin1ZHENG Xiaolong1

(1.Key Laboratory of Freshwater Fishery Germplasm Resources, Shanghai Ocean University, Ministry of Agriculture,Shanghai 201306, China; 2. Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture, Shanghai 201306, China;3. Aquatic Animal Genetic Breeding Center Collaborative Innovation Center in Shanghai (ZF1206), Shanghai 201306, China)

In order to assess the effects of dietary cholesterol content on the growth performance,Vibrioand nitrite nitrogen stress resistant abilities ofLitopenaeusvannameicultured in freshwater, five isonitrogenous and isoenergetic experimental diets were formulated based on 10% fish meal and supplemented 0 (C0 group), 1 (C1 group), 2 (C2 group), 3 (C3 group) and 4 g/kg cholesterol(C4 group), respectively, and those diets were fed to theLitopenaeusvannameiwith the initial body weight of (0.160±0.002) g for 50 days. The measured cholesterol content of experimental diets in C0, C1, C2, C3 and C4 groups were 0.78, 1.57, 2.45, 3.43 and 4.18 g/kg, respectively. Each diet fed four net-cages and each net-cage had 50 shrimps. After feeding experiment, the growth performance, proximate composition of muscle, and the survival condition after acuteVibrioharveyiinfection and nitrite nitrogen stress were investigated. The results showed as follows: there were no significant differences in survival ratio and specific growth rate among groups (P>0.05), while the feed conversion rate (FCR) of C0 group was significantly higher than that of C2, C3 and C4 groups (P<0.05). The crude protein content in muscle of shrimps was increased along with the dietary cholesterol content rising, and that of C3 and C4 groups displayed significantly higher than that of C0 group (P<0.05). The crude lipid content in muscle of shrimps was firstly increased then decreased along with the dietary cholesterol content rising, and that of C2 group was significantly higher than that of other groups (P<0.05). The cholesterol content in hepatopancreas and muscle of shrimps was significantly increased with the dietary cholesterol content rising (P<0.05), while the cholesterol content in serum was firstly increased then decreased, and that of C2 group was significantly higher than that of C0 group (P<0.05).When the shrimps were acute challenged withVibrioharveyi, the cumulative mortality in the same time point was firstly decreased and then increased along with the dietary cholesterol content rising, and the C2 group always displayed the lowest cumulative mortality at 24, 36, 48, 72 and 96 h after infection. There was a negative correlation between the cumulative mortality at 96 h after stress and the dietary cholesterol content when the shrimps were stressed with 8.5 to 9.0 mg/L nitrate nitrogen, and the cumulative mortality of C0 and C1 groups was significantly higher than that of other groups (P<0.05). It is suggested that the diet containing 1.57 g/kg cholesterol will satisfy the normal cholesterol requirement for growth ofLitopenaeusvannameicultured in freshwater, and the diet containing 2.45 g/kg cholesterol displays the strongestVibrioresistant ability and the ideal nitrate nitrogen stress resistant ability.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(8)：2639-2649]

freshwater;Litopenaeusvannamei; cholesterol; growth performance;Vibrioresistant ability; nitrate nitrogen stress resistant ability

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.08.037

2016-02-04

上海市科委項目(14320502000)

王鑫磊(1990—)，男，河北承德人，碩士研究生，動物營養(yǎng)與飼料科學專業(yè)。E-mail: 137324718@qq.com

黃旭雄，教授，博士生導師，E-mail: xxhuang@shou.edu.cn

S963

A

1006-267X(2016)08-2639-11