飼糧銅含量對牦牛體外瘤胃發(fā)酵的影響

薛艷鋒　郝力壯*　劉書杰*　柴沙駝　張曉衛(wèi)　趙索南

(1.省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海省高原放牧家畜動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海高原牦牛研究中心，青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧810016；2.海北州畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，海晏810200)

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飼糧銅含量對牦牛體外瘤胃發(fā)酵的影響

薛艷鋒1郝力壯1*劉書杰1*柴沙駝1張曉衛(wèi)1趙索南2

(1.省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海省高原放牧家畜動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海高原牦牛研究中心，青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧810016；2.海北州畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，海晏810200)

為了探究牦牛飼糧中微量元素銅的適宜含量，本試驗(yàn)以甘氨酸銅作為添加形式，以牦牛飼糧為底物進(jìn)行體外瘤胃發(fā)酵，底物銅含量分別為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/kg，共發(fā)酵48 h。測定發(fā)酵后的產(chǎn)氣量、瘤胃發(fā)酵指標(biāo)及消化酶活力。結(jié)果表明：當(dāng)?shù)孜镢~含量為15.0 mg/kg時(shí)，干物質(zhì)消化率(DMD)，微生物蛋白質(zhì)(MCP)、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、總揮發(fā)性脂肪酸濃度，脂肪酶(LPS)、胰蛋白酶 (TYS)、纖維素酶(CLS)活力均達(dá)到最大值，分別為63.858%、4.289 g/L、24.475 mmol/L、0.470 mmol/L、8.977 mmol/L、1.159 mmol/L、1.607 mmol/L、81.583 mmol/L、0.504 U/mL、84.167 U/mL、79.956 U/mL，乙酸/丙酸最低為2.045；當(dāng)銅含量為10.0 mg/kg時(shí)，MCP、乙酸濃度達(dá)到最大值，分別為4.289 g/L、51.075 mmol/L，且其他指標(biāo)也都處于較高水平。綜合得出，在體外條件下，牦牛飼糧推薦銅含量為10.0～15.0 mg/kg。

牦牛；甘氨酸銅；體外產(chǎn)氣技術(shù)；消化酶活力；揮發(fā)性脂肪酸

牦牛作為環(huán)境條件極其惡劣(寒、旱、缺氧、強(qiáng)輻射)的青藏高原地區(qū)優(yōu)勢畜種，是當(dāng)?shù)啬撩裆娴奈镔|(zhì)基礎(chǔ)和經(jīng)濟(jì)支柱[1-2]。但牦牛面臨著寒冷的冬季和漫長的枯草期，不僅冬季掉膘嚴(yán)重，而且凍死、餓死的現(xiàn)象也屢見不鮮，嚴(yán)重制約著牦牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此深入研究牦牛營養(yǎng)、制訂飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)、合理補(bǔ)飼勢在必行。關(guān)于牦牛能量[3]和蛋白質(zhì)[4]營養(yǎng)方面已經(jīng)有一定研究基礎(chǔ)，但牦牛微量元素營養(yǎng)方面的研究基本上處于空白狀態(tài)。

銅是動物機(jī)體所必需的微量元素之一[5]，參與造血和髓蛋白的合成[6-7]，促進(jìn)骨和膠原的形成[8]，參與被毛色素沉積，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[9-10]，促進(jìn)家畜生長[11-12]?；A(chǔ)飼糧中銅往往處于缺乏狀態(tài)，但添加過量又會影響牦牛消化代謝、生長繁殖和生產(chǎn)性能，甚至影響牦牛機(jī)體的健康狀況。楊鳳[6]指出動物飼糧中的微量元素銅、錳、碘、鐵、鋅處于臨界缺乏狀態(tài)，而實(shí)際生產(chǎn)中大多數(shù)以預(yù)混料的形式向動物飼糧中添加過量的微量元素復(fù)合物來滿足動物的需求，這樣雖然彌補(bǔ)了動物飼糧中微量元素的缺乏，起到了一定的積極作用，但卻不能最大程度地發(fā)揮動物的生長性能。

楊紅建[13]推薦肉牛飼糧中銅的添加量為10 mg/kg。Perry等[14]認(rèn)為在較低的鉬水平下，奶牛對銅的需要量為10～20 mg/kg。馬長星[15]報(bào)道，體重在300～650 kg、妊娠250 d的青年母牛銅需要量為12～16 mg/kg。因此本試驗(yàn)以甘氨酸銅作為微量元素銅的添加形式，采用體外產(chǎn)氣技術(shù)研究銅含量為5.0～25.0 mg/kg時(shí)對人工瘤胃發(fā)酵的影響，旨在篩選牦牛飼糧中微量元素銅的最適含量，為完善牦牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)和科學(xué)補(bǔ)飼提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動物與飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)選擇3頭健康、體況接近、裝有永久性瘤胃瘺管的成年閹牦牛作為瘤胃液供體動物。試驗(yàn)飼糧包括精料和粗料(燕麥青干草)，精粗比6∶4，單頭飼喂，每日2次(08:00、18:00)，自由飲水。飼喂15 d之后，清晨空腹采集瘤胃液。

1.2體外產(chǎn)氣的試驗(yàn)方法

清晨空腹采集3頭牛的瘤胃液，混勻之后4層紗布過濾，參考Menke等[16]的方法配制人工瘤胃發(fā)酵液，通入二氧化碳達(dá)到厭氧狀態(tài)，使用自動分液器分裝到裝有200 mg底物的培養(yǎng)管中(每管30 mL)，轉(zhuǎn)入(39.0±0.5) ℃的人工瘤胃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至2、4、6、8、12、16、20、24、30、36、48 h各時(shí)間點(diǎn)時(shí)，取出培養(yǎng)管，快速讀取活塞所處的刻度值(mL)并記錄。發(fā)酵48 h結(jié)束后，將培養(yǎng)管轉(zhuǎn)移到冰水浴中終止發(fā)酵。同時(shí)設(shè)定無發(fā)酵底物的空白管?，F(xiàn)場測定發(fā)酵液pH和氨態(tài)氮(NH3-N)濃度，備份發(fā)酵液，冷凍保存，用于測定消化酶活力，微生物蛋白質(zhì)(MCP)、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度，收集發(fā)酵殘?jiān)?05 ℃烘干12～24 h，測定干物質(zhì)消化率(DMD)。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考《肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 815—2004)和《牦牛營養(yǎng)研究論文集》[2]，按照150 kg牦牛日增重500 g設(shè)計(jì)牦?；A(chǔ)飼糧的精料配方，以燕麥青干草作為粗料，精粗比6:4配制發(fā)酵底物。本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共5個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。首先通過原子吸收分光光度計(jì)測定發(fā)酵底物中銅的含量為4.395 mg/kg，然后在5個(gè)處理的發(fā)酵底物中以甘氨酸銅(含銅量20%)的形式分別添加0.605、5.605、10.605、15.605、20.605 mg/kg的銅，從而使5個(gè)處理中銅的總含量分別達(dá)到5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/kg。采用體外發(fā)酵技術(shù)研究不同銅含量對牦牛瘤胃發(fā)酵的影響。

1.4測定指標(biāo)與方法

1.4.1銅含量

銅含量參考GB/T 13885—2003[17]，使用北京普析TAS-990 AFG型原子吸收分光光度計(jì)，采用火焰法測定。本試驗(yàn)所做出的銅含量標(biāo)準(zhǔn)曲線擬和公式為：

Abs=0.100 30Conc+0.000 466 67

(r=0.999 9，n=4)。

式中：Conc為銅含量(μg/mL)；Abs為吸光度值，波長為324.8 nm。

1.4.2產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣速率和DMD

根據(jù)各時(shí)間點(diǎn)記錄的產(chǎn)氣量計(jì)算總產(chǎn)氣量、甲烷產(chǎn)量和產(chǎn)氣速率。

總產(chǎn)氣量(mL)=試驗(yàn)管總產(chǎn)氣量-

空白管總產(chǎn)氣量;

甲烷產(chǎn)量(mL)=總產(chǎn)氣量×甲烷所占百分比;

產(chǎn)氣速率(mL/h)=階段產(chǎn)氣量/時(shí)間間隔。

DMD(%)={[樣本干物質(zhì)(DM)重-

殘?jiān)麯M重+空白管DM重]/

樣本DM重}×100。

1.4.3pH和NH3-N、MCP濃度

pH采用HANNA HI221型臺式酸度計(jì)測定。

NH3-N濃度采用馮宗慈等[18]改進(jìn)的比色法測定；本試驗(yàn)所作出的NH3-N濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線擬和公式為：

Y=0.043 1X+0.024 1(r=0.995，n=5)。

式中：Y為NH3-N濃度(mg/dL)，X為吸光度值，波長為625.0 nm。

MCP濃度測定采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進(jìn)行測定。

測定原理：蛋白質(zhì)分子中的肽鍵(—CONH—)能與堿性銅溶液作用，發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，形成紫色復(fù)合物，因此可以測定顯色反應(yīng)后溶液的吸光度值(波長為540 nm)，計(jì)算溶液中蛋白質(zhì)的濃度。

雙縮脲試劑的配制：將試劑1中的粉劑加超純水稀釋到100 mL，試劑2中的粉劑加超純水稀釋到200 mL，然后將稀釋后的試劑1、試劑2按照1∶2的比例配成雙縮脲試劑，4 ℃保存。操作方法：準(zhǔn)確吸取發(fā)酵液0.20 mL，加入0.80 mL的生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，制成20%的勻漿液，在2 500 r/min的條件下離心10 min，取上清液50 μL進(jìn)行測定；具體操作步驟見表1。使用TU-1810紫外可見分光光度計(jì)(提前預(yù)熱30 min)在波長540 nm處測定各管吸光度值，比色皿光徑1 cm，超純水調(diào)零。

MCP計(jì)算公式如下：

MCP(g/L)=(Am-AK)/(As-Ak)×Ck×w。

式中：Am為測定管吸光度值；AK為空白管吸光度值；AVs為標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值；Ck為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度56.3 g/L；w為稀釋倍數(shù)。

表1　雙縮脲反應(yīng)操作流程

1.4.4VFA濃度

VFA濃度測定參考相關(guān)文獻(xiàn)[19-20]，對樣品進(jìn)行前處理。發(fā)酵瘤胃液經(jīng)4層紗布過濾后，取5 mL于干凈的離心管中，3 000 r/min離心10 min，取上清液2 mL于Tube管中，準(zhǔn)確加入0.2 mL、25%的偏磷酸溶液，混勻之后，靜置10 min充分反應(yīng)后，在12 000 r/min、4 ℃的條件下離心10 min，轉(zhuǎn)移上清到新的Tube管中，-80 ℃凍存，備用。

VFA的測定方法：用島津2014氣相色譜儀分析。測定條件：FID檢測器，色譜柱為毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.5 μm)；色譜柱升溫程序，初始60 ℃，以10 ℃/min升溫至120 ℃，保留2 min，以15 ℃/min升溫至180 ℃，保留5 min；汽化溫度250 ℃；檢測溫度250 ℃；進(jìn)樣量：1 μL，載氣為高純氮?dú)?99.99 %)，壓力0.7 MPa，檢測器氫氣壓力0.4 MPa，空氣壓力0.4 MPa，毛細(xì)管柱壓力0.6～0.8 MPa，分流比40。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線見表2。

表2　VFA濃度計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線中：Y為進(jìn)樣的峰面積；X為組分濃度(mmol/L)。

In standard curves:Ywas peak area of the sample;Xwas the concentration of the fraction(mmol/L).

1.4.5消化酶活力

淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)、胰蛋白酶(TYS)、纖維素酶(CLS)活力測定采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進(jìn)行測定?；盍挝欢x：每毫升含酶溶液在37 ℃下與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個(gè)AMS活力單位；每毫升含酶溶液在37 ℃下與底物作用1 min，每消耗1 μmol底物為1個(gè)LPS活力單位；每毫升含酶溶液在37 ℃、pH=8.0的條件下，每分鐘使反應(yīng)體系的吸光度值(波長為253 nm)變化0.003即為1個(gè)TYS活力單位；每毫升含酶溶液每分鐘催化產(chǎn)生1 μg葡萄糖定義為1個(gè)CLS活力單位。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.0軟件的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著，各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2　結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣速率和DMD

從表3中可以看出，以甘氨酸銅作為添加劑時(shí)，隨著銅含量的升高，瘤胃發(fā)酵總產(chǎn)氣量呈現(xiàn)出先上升后達(dá)到穩(wěn)定的趨勢，銅含量在10.0～20.0 mg/kg時(shí)，總產(chǎn)氣量處于穩(wěn)定狀態(tài)，在75.0 mL左右波動，只有銅含量達(dá)到25.0 mg/kg時(shí)的總產(chǎn)氣量顯著高于銅含量為5.0 mg/kg時(shí)(P<0.05)，其他各組之間總產(chǎn)氣量差異均不顯著(P>0.05)。隨著銅含量的升高，甲烷產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在銅含量為10.0 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值10.54 mL，顯著高于銅含量為5.0、20.0、25.0 mg/kg時(shí)(P<0.05)，但與銅含量為15.0 mg/kg時(shí)的甲烷產(chǎn)量10.42 mL之間差異不顯著(P>0.05)。隨著銅含量的升高，DMD出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)銅的含量為15.0 mg/kg時(shí)，DMD達(dá)到最大值63.858%，并且顯著高于銅含量為5.0和25.0 mg/kg時(shí)(P<0.05)。

表3　底物銅含量對體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量和DMD的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same letter superscripts mean no significant different (P>0.05). The same as below.

從圖1中可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，5組的產(chǎn)氣速率都出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，最后產(chǎn)氣速率趨近于0，在5～9 h之間產(chǎn)氣速率達(dá)到最大值，呈現(xiàn)單峰形狀。

圖1　底物銅含量對體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣速率的影響

2.2pH和NH3-N、MCP濃度

從表4中可以看出，以甘氨酸銅作為添加劑時(shí)，隨著銅含量的升高，體外發(fā)酵后pH呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，銅含量在10.0～15.0 mg/kg時(shí)，pH達(dá)到穩(wěn)定趨勢，并且顯著高于銅含量為5.0 mg/kg時(shí)(P<0.05)。各組體外發(fā)酵后pH處于6.71～7.16之間，都屬于牦牛瘤胃液pH正常范圍之內(nèi)。隨著銅含量的升高，體外發(fā)酵后的NH3-N濃度出現(xiàn)先穩(wěn)定后降低的趨勢，當(dāng)銅的含量在5.0～15.0 mg/kg時(shí)NH3-N濃度處于穩(wěn)定居高的狀態(tài)，都在10.00 mg/dL之上，當(dāng)銅的含量在20.0～25.0 mg/kg時(shí)NH3-N濃度略低，在10.00 mg/dL之下。銅含量為5.0 mg/kg時(shí)NH3-N濃度顯著高于銅含量為20.0和25.0 mg/kg時(shí)(P<0.05)。隨著銅含量的升高，體外發(fā)酵后MCP濃度出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在銅含量為10.0～15.0 mg/kg時(shí)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，都為4.289 g/L，顯著高于銅含量為5.0 mg/kg時(shí)的MCP濃度(P<0.05)。

2.3VFA濃度

從表5中可以看出，以甘氨酸銅作為添加劑時(shí)，隨著銅含量的升高，發(fā)酵后乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)的濃度都出現(xiàn)先上升后下降的趨勢。乙酸的濃度在銅含量為10.0 mg/kg的時(shí)候達(dá)到最大值51.075 mmol/L；丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、TVFA的濃度都在銅含量為15.0 mg/kg的時(shí)候達(dá)到最大值，分別為24.475、0.470、8.977、1.159、1.607、81.583 mmol/L。乙酸/丙酸出現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在銅含量為15.0 mg/kg的時(shí)候達(dá)到最小值2.045。當(dāng)銅含量為10.0 mg/kg時(shí)，體外發(fā)酵后乙酸濃度顯著高于銅含量為5.0和25.0 mg/kg時(shí)(P<0.05)；當(dāng)銅含量為15.0 mg/kg時(shí)，體外發(fā)酵后丙酸濃度顯著高于其他所有組(P<0.05)，銅含量為10.0 mg/kg時(shí)，體外發(fā)酵后丙酸濃度顯著高于銅含量為5.0和25.0 mg/kg時(shí)(P<0.05)；當(dāng)銅含量為10.0和15.0 mg/kg時(shí)，體外發(fā)酵后異丁酸濃度差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于其他各組(P<0.05)；當(dāng)銅含量為10.0和15.0 mg/kg時(shí)，體外發(fā)酵后丁酸濃度都顯著高于其他各組(P<0.05)，且這2組之間差異顯著(P<0.05)；當(dāng)銅含量為10.0和15.0 mg/kg時(shí)，體外發(fā)酵后異戊酸濃度都顯著高于其他各組(P<0.05)，這2組之間差異不顯著(P>0.05)；當(dāng)銅含量為10.0和15.0 mg/kg時(shí)，體外發(fā)酵后戊酸濃度都顯著高于其他各組(P<0.05)，且這2組之間差異顯著(P<0.05)；當(dāng)銅含量為10.0和15.0 mg/kg時(shí)，體外發(fā)酵后TVFA濃度都顯著高于銅含量為5.0和25.0 mg/kg時(shí)(P<0.05)，這2組之間差異不顯著(P>0.05)；當(dāng)銅含量為15.0 mg/kg時(shí)，體外發(fā)酵后乙酸/丙酸顯著低于銅含量為5.0、10.0、20.0 mg/kg時(shí)(P<0.05)。

表4　底物銅含量對體外瘤胃發(fā)酵pH和NH3-N、MCP濃度的影響

表5　底物銅含量對體外瘤胃發(fā)酵VFA濃度的影響

2.4消化酶活力

從表6中可以看出，隨著銅含量升高，體外發(fā)酵后AMS活力出現(xiàn)先保持較高水平后下降再上升的趨勢，LPS、TYS和CLS活力都出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。AMS活力在銅含量為5.0 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值0.531 U/mL，但與銅含量為10.0、25.0 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)，這3組顯著高于其他2組(P<0.05)；當(dāng)銅含量為15.0 mg/kg時(shí)，LPS活力達(dá)到最大值0.504 U/mL，顯著高于其他所有組(P<0.05)；當(dāng)銅含量為15.0 mg/kg時(shí)，TYS活力達(dá)到最大值84.167 U/mL，顯著高于銅含量為5.0、20.0、25.0 mg/kg時(shí)(P<0.05)，但與銅含量為10.0 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)；當(dāng)銅含量為15.0 mg/kg時(shí)，CLS活力達(dá)到最大值79.956 U/mL，與銅含量為25.0 mg/kg時(shí)差異不顯著，且這2組都顯著高于銅含量為5.0 mg/kg時(shí)(P<0.05)。

表6　底物銅含量對體外瘤胃發(fā)酵消化酶活力的影響

3　討　論

瘤胃氣體發(fā)酵產(chǎn)物主要包括二氧化碳、甲烷、氫氣、VFA等[21]，來源于飼糧中有機(jī)物質(zhì)的降解，總產(chǎn)氣量的多少反映飼糧的降解程度[22]，產(chǎn)氣量越高，表明飼糧發(fā)酵越充分，為機(jī)體提供的能量越多，越有利于動物的生長。本試驗(yàn)中總產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量隨著底物銅含量的升高而增加，由此可見，添加甘氨酸銅有利于瘤胃發(fā)酵。產(chǎn)氣速率出現(xiàn)先上升后下降的單峰趨勢，這是由于發(fā)酵初期，發(fā)酵底物中的可溶性糖等成分易于被微生物所利用，迅速產(chǎn)生氣體，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，可發(fā)酵成分越來越少，產(chǎn)氣速率也慢慢降低，最終趨近于0。pH是瘤胃發(fā)酵的綜合反映，受發(fā)酵底物類型、有機(jī)酸沉淀等各種因素的影響[23]，只有當(dāng)pH處于正常范圍之內(nèi)，才能夠保證瘤胃發(fā)酵、飼料降解的正常進(jìn)行。本試驗(yàn)不同銅含量下體外發(fā)酵后的pH都在反芻動物瘤胃液pH正常范圍5.6～7.5之內(nèi)。

DMD直接反映飼糧在瘤胃中的降解程度，本試驗(yàn)中，隨著銅含量的提高，DMD先增大后減小，在銅含量為15.0 mg/kg的時(shí)候達(dá)到最大值63.858%，由此可見銅含量15.0 mg/kg最有利于飼料的降解。這與瘤胃消化道酶活力的測定結(jié)果基本吻合，其中LPS、TYS和CLS 3種消化酶的活力都在銅含量為15.0 mg/kg的時(shí)候達(dá)到最大值。只有AMS的活力出現(xiàn)了先降低后升高的趨勢，并且DMD在銅含量為10.0 mg/kg的時(shí)候也處于較高水平。因此從瘤胃消化酶活力和DMD的角度看，當(dāng)銅的含量在10.0～15.0 mg/kg的時(shí)候，最有利于飼糧的降解。本試驗(yàn)中所測定的牦牛瘤胃消化酶活力與張海濤等[24]測定的犢牛瘤胃內(nèi)AMS活力0.29～1.74 U/mL，劉彩娟等[25]測定的奶牛瘤胃中CLS活力71.43～99.05 U/m，Moharrery等[26]測定的奶牛十二指腸中AMS活力0.70～31.99 U/mL、LPS活力0.15～0.81 U/mL都基本上處于同一水平；只有TYS活力遠(yuǎn)高于Moharrery等[26]測定的奶牛十二指腸中TYS活力5.55～11.42 U/mL、王杰[27]測定的羊瘤胃中TYS活力18.09～24.56 U/mL，而達(dá)到32.713～84.167 U/mL。Goodrich等[28]給瘤胃液中添加不同含量的銅進(jìn)行體外培養(yǎng)的試驗(yàn)表明，銅對纖維素的降解有很大的促進(jìn)作用。Saxena等[29]的研究也表明，飼糧中添加銅可以促進(jìn)瘤胃微生物對纖維素的降解作用，而本試驗(yàn)中添加銅也顯著提高了牦牛瘤胃體外發(fā)酵后CLS活力，這將對瘤胃微生物降解纖維素起到積極的作用。

NH3-N來源于飼糧中蛋白質(zhì)的降解，主要用于微生物合成MCP[30]，在瘤胃中基本處于動態(tài)平衡。本試驗(yàn)中5組的NH3-N濃度都處于正常范圍0.35～29.0 mg/dL[31-32]之內(nèi)，并且隨著銅含量的提高，NH3-N濃度出現(xiàn)降低的趨勢，但當(dāng)銅含量在10.0～15.0 mg/kg的時(shí)候，NH3-N濃度還處于整體較高值。MCP提供了反芻動物機(jī)體40%～60%的蛋白質(zhì)需要量，隨著銅含量的提高，MCP濃度出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且在銅含量為10.0～15.0 mg/kg的時(shí)候達(dá)到最大值。由此可見，銅含量為10.0～15.0 mg/kg的時(shí)候，最有利于NH3-N和MCP的形成。當(dāng)銅含量較低的時(shí)候，可能是由于微生物合成MCP的能力較弱，從而使MCP濃度處于較低水平，并且也導(dǎo)致NH3-N轉(zhuǎn)化成MCP的反應(yīng)受到抑制，從而使NH3-N濃度處于較高的水平。

VFA是反芻動物重要的能量物質(zhì)，提供了反芻動物60%～80%的消化能[33-34]。本試驗(yàn)中丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、TVFA的濃度都在銅含量為15.0 mg/kg的時(shí)候達(dá)到最大值，乙酸的濃度在銅含量為10.0 mg/kg的時(shí)候達(dá)到最大值。同時(shí)，對于反芻動物來說，動物機(jī)體所需要的能量主要來源于肝臟組織糖異生作用產(chǎn)生的葡萄糖，而丙酸是糖異生作用的重要前體物質(zhì)，是一種高效酸，乙酸/丙酸越低，表明丙酸所占比例也越大，越利于反芻動物的生長，本試驗(yàn)中乙酸/丙酸的比例在銅含量為15.0 mg/kg的時(shí)候達(dá)到最低值。由此可見，銅含量為10.0～15.0 mg/kg的時(shí)候，最有利于能量物質(zhì)的生成，最有利于牦牛的生長。

4　結(jié)　論

綜上所述，體外條件下，對于生長期牦牛，若以甘氨酸銅作為銅元素的添加形式，牦牛飼糧銅含量在10.0～15.0 mg/kg時(shí)，有利于瘤胃發(fā)酵和飼糧降解。而本試驗(yàn)牦牛飼糧中的微量元素銅的基礎(chǔ)含量只有4.395 mg/kg，遠(yuǎn)低于牦牛對銅的需要量10.0～15.0 mg/kg，處于極度缺乏狀態(tài)，必須額外補(bǔ)充微量元素銅，才能更大限度地改善牦牛瘤胃發(fā)酵，提高生長性能。

[1]WIENER G,HAN J L,LONG R J.The yak[M].3nded.Bangkok:RAP Publication,2003:1-18.

[2]胡令浩.牦牛營養(yǎng)研究論文集[M].西寧:青海人民出版社,1997.

[3]韓興泰,胡令浩,謝敖云,等.粗飼條件下生長牦牛能量代謝的估測[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志,1992,22(2):21-22.

[4]薛白,柴沙駝,劉書杰.生長期牦牛蛋白質(zhì)需要量的研究[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志,1994,24(4):1-4.

[5]劉宗平.現(xiàn)代動物營養(yǎng)代謝病學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2003:132-142.

[6]楊鳳.動物營養(yǎng)學(xué)[M].2版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2003:116-117.

[7]袁施彬,何平,陳代文.微量元素銅的營養(yǎng)生理功能和促生長機(jī)制[J].飼料工業(yè),2004,25(7):23-26.

[8]郭寶林.不同飼料銅源對綿羊銅代謝及纖維素降解影響的研究[D].博士學(xué)位論文.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.

[9]楊文正,章世元,林在光,等.動物礦物質(zhì)營養(yǎng)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1996:6-9.

[10]吳建設(shè),咼于明.微量元素銅的營養(yǎng)與免疫研究進(jìn)展[J].國外畜牧科技,1999,26(1):5-9.

[11]李文立,黃新成.微量元素添加劑對牛育肥效果試驗(yàn)報(bào)告[J].萊陽農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),1994,11(4):313-315.

[12]楊正德.不同銅添加水平對肉牛銅代謝及肥育性能的影響[J].中國畜牧雜志,2000,36(3):14-16.

[13]楊紅建.肉牛微量元素銅的營養(yǎng)[J].飼料研究,1999(8):1-3.

[14]PERRY J M,ZHAO Y,MARLETTA M A,et al.Cu2+and Zn2+inhibit nitric-oxide synthase through an interaction with the reductase domain[J].The Journal of Biological Chemistry,2000,275(19):14070-14076.

[15]馬長星.奶牛對微量元素銅的營養(yǎng)需要研究[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2010(11):43.

[16]MENKE K H,RAAB L,SALEWSKI A,et al.The Estimation of the digestibility and metabolizable energy content of ruminant feedingstuffs from the gas production when they are incubated with rumen liquorinvitro[J].Journal of Agriculture Science,1979,93(1):217-222.

[17]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 13885—2003 動物飼料中鈣、銅、鐵、鎂、錳、鉀、鈉和鋅含量的測定 原子吸收光譜法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2004.

[18]馮宗慈,高民.通過比色測定瘤胃液氨氮含量方法的改進(jìn)[J].畜牧與飼料科學(xué),2010,31(6/7):37.

[19]曹慶云,周武藝,朱貴釗,等.氣相色譜測定羊瘤胃液中揮發(fā)性脂肪酸方法研究[J].中國飼料,2006(24):26-28.

[20]王加啟.反芻動物營養(yǎng)學(xué)研究方法[M].北京:現(xiàn)代教育出版社,2011:139-141.

[21]MENKE K H,STEINGASS H.Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis andinvitrogas production using rumen fluid[J].Animal Research and Development,1988,28:7-55.

[22]哈斯花.體外發(fā)酵產(chǎn)氣技術(shù)在飼料營養(yǎng)價(jià)值評定中的作用[J].當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè),2013(1):15-19.

[23]高天爽,孫海霞,謝小來,等.日糧中高粱替代玉米對綿羊瘤胃發(fā)酵的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2014(9):7-10.

[24]張海濤,王加啟,卜登攀,等.納豆枯草芽孢桿菌對犢牛斷奶前后瘤胃發(fā)酵和酶活的影響[J].中國畜牧獸醫(yī),2009,36(12):5-11.

[25]劉彩娟,孫滿吉,孫金艷,等.飼糧中添加復(fù)合益生菌對奶牛瘤胃發(fā)酵及纖維素酶活的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2011,23(5):821-827.

[26]MOHARRERY A,BRASK M,WEISBJERG M R.The effect of different physical forms of rapeseed as a fat supplement on the activity of some enzymes in the duodenal chyme of dairy cows[J].Journal of Animal and Feed Sciences,2014,23(4):293-298.

[27]王杰.小尾寒羊、灘羊生長性能及其主要消化生理參數(shù)的比較[D].碩士學(xué)位論文.楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2008.

[28]GOODRICH R D,TILLMAN A D.Effects of sulfur and nitrogen sources and copper levels on the metabolism of certain minerals by sheep[J].Journal of Animal Science,1966,25(2):484-491.

[29]SAXENA K K,RANJHAN S K.A note on the effect of cobalt and copper supplementation on in vivo cellulose digestion by nylon-bag technique in Hariana calves[J].Indian Journal of Animal Science,1978,48:833-835.

[30]LENG R A,NOLAN J Y.Nitrogen metabolism in the rumen[J].Journal of Dairy Science,1984,67(5):1072-1089.

[31]SLYTER L L.Monensin and dichloroacetamide influences on methane and volatile Fatty Acid production by rumen bacteriainvitro[J].Applied and Environmental Microbiology,1979,37(2):283-288.

[32]COLEMAN G S,SANDFORD D C.The uptake and utilization of bacteria,amino acids and nucleic acid components by the rumen ciliateEudiplodiniummaggii[J].Journal of Applied Bacteriology,1979,47(3):409-419.

[33]GRAY G M.Starch digestion and absorption in nonruminants[J].The Journal of Nutrition,1992,122(1):172-177.

[34]趙國琦,賈亞紅,陳小連,等.不同NDF/NFE比的日糧對山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)影響的研究[J].中國畜牧雜志,2006,42(13):29-33.

(責(zé)任編輯王智航)

s: HAO Lizhuang, associate professor, E-mail： lizhuanghao1122@foxmail.com; LIU Shujie， professor, E-mail： mkylshj@126.com

Effects of Dietary Copper Content on Rumen Fermentation of YaksinVitro

XUE Yanfeng1HAO Lizhuang1*LIU Shujie1*CHAI Shatuo1ZHANG Xiaowei1ZHAO Suonan2

(1. State Key Laboratory of Plateau Ecology and Agriculture, Key Laboratory of Plateau Grazing Animal Nutrition and Feed Science of Qinghai Province, Qinghai Plateau Yak Research Center, Qinghai Academy of Science and Veterinary Medicine of Qinghai University, Xining 810016, China; 2. Academy of Science and Veterinary Medicine of Haibei Prefecture, Haiyan 810200, China)

To find an optimal content of copper in diet for yaks, cupric glycinate was used as additive, and diet for yaks was used as a substrate forinvitrorumen fermentation in the present study. Copper contents in substrates were designed as 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0 mg/kg, respectively. The fermentation lasted for 48 h. After fermentation, gas production, rumen fermentation parameters and digestive enzyme activities were measured. The results showed as follows: when the content of copper in substrate was 15.0 mg/kg, dry matter digestibility (DMD), the concentrations of microbial protein (MCP), propionic acid, isobutyric acid, butyric acid, isovaloric acid, valeric acid and total volatile fatty acids, as well as the activities of lipidase, trypsinase , cellulase reached the highest, which were 63.858 %, 4.289 g/L, 24.475 mmol/L, 0.470 mmol/L, 8.977 mmol/L, 1.159 mmol/L, 1.607 mmol/L, 81.583 mmol/L, 0.504 U/mL, 84.167 U/mL and 79.956 U/mL, respectively; when the content of copper in substrate was 10.0 mg/kg, acetic acid/propionic acid reached the lowest, which was 2.045; when the content of copper was 10.0 mg/kg, MCP and acetic acid concentrations reached the highest, which were 4.289 g/L and 51.075 mmol/L, respectively, and the values of other indexes were also on high level. Therefore, underinvitroconditions, the copper content recommended in yak’s diet is between 10.0 and 15.0 mg/kg.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(8)：2599-2606]

yak; cupric glycinate;invitrogas production technique; digestive enzyme activity; volatile fatty acid

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.08.033

2016-02-27

“973”國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012CB722906)；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD13B01)；國家國際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目(2015DFG31870)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203008)；教育部長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(IRT13074)；青海省重大科技平臺建設(shè)項(xiàng)目(2013-Z-Y03)

薛艷鋒(1990—)，男，河南南陽人，碩士研究生，研究方向?yàn)閯游餇I養(yǎng)與飼料科學(xué)。E-mail： 945982845@qq.com

郝力壯，副研究員，E-mail： lizhuanghao1122@foxmail.com；劉書杰，研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail： mkylshj@126.com

S823

A

1006-267X(2016)08-2599-08