深化免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革 培養(yǎng)創(chuàng)新型人才*

◆姜丹 王飛 孟令軍 張洋 劉洋 劉艷 孟慶繁

深化免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革 培養(yǎng)創(chuàng)新型人才*

◆姜丹 王飛 孟令軍 張洋 劉洋 劉艷 孟慶繁

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的重要組成部分，是本科生獲得免疫學(xué)知識(shí)和加深對(duì)理論知識(shí)理解的重要途徑。根據(jù)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)特點(diǎn)，通過(guò)整合實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容、統(tǒng)籌安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間，并以多克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)為例，改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方案，使學(xué)生在實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程中多角度、多層次理解實(shí)驗(yàn)原理和操作過(guò)程，在有限時(shí)間內(nèi)掌握更多的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，提高實(shí)驗(yàn)成功率，從而培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力、綜合分析問(wèn)題解決問(wèn)題的能力，以及縝密的科學(xué)思維和團(tuán)隊(duì)協(xié)作意識(shí)，提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量。

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)；教學(xué)改革；實(shí)驗(yàn)教學(xué)

10.3969/j.issn.1671-489X.2016.12.129

1　前言

免疫學(xué)是生命科學(xué)領(lǐng)域中重要的基礎(chǔ)課程。免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課既是理論課程的驗(yàn)證和補(bǔ)充，又是培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力、獨(dú)立思考能力、分析解決問(wèn)題能力的重要手段［1］。如何使本科生通過(guò)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課程增加對(duì)理論知識(shí)的理解，在較短時(shí)間內(nèi)掌握更多、更前沿的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，是目前免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的突出問(wèn)題。

結(jié)合免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)特點(diǎn)，筆者經(jīng)過(guò)幾年的探索和實(shí)踐，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中進(jìn)行了一系列改革工作，優(yōu)化整合了實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，統(tǒng)籌安排實(shí)驗(yàn)教學(xué)時(shí)間，改進(jìn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，使學(xué)生得到更多的獨(dú)立動(dòng)手機(jī)會(huì)，提高其獨(dú)立思考分析解決問(wèn)題的能力，使免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的教學(xué)水平和效果都得到很大程度的提高。

2　整合與優(yōu)化實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容

吉林大學(xué)國(guó)家級(jí)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“中心”）始終圍繞以提高人才培養(yǎng)質(zhì)量為核心，堅(jiān)持“以學(xué)生為本，協(xié)調(diào)培養(yǎng)學(xué)生的知識(shí)、能力和素質(zhì)”的育人理念，根據(jù)學(xué)科的發(fā)展和社會(huì)的需要，修訂實(shí)踐教學(xué)大綱和教學(xué)內(nèi)容。對(duì)2009版實(shí)踐教學(xué)大綱中免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行調(diào)整，刪除和整合部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，按照抗體的制備、淋巴細(xì)胞功能檢測(cè)技術(shù)、NK細(xì)胞功能檢測(cè)技術(shù)、抗原抗體反應(yīng)、免疫標(biāo)記技術(shù)、細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)等6個(gè)部分重新建立實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目14個(gè)。適當(dāng)削減了驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，增加了綜合性實(shí)驗(yàn)，在整個(gè)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系中既有必做實(shí)驗(yàn)，又有選做實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生有更多的選擇空間。

另外，為了使本科生實(shí)驗(yàn)教學(xué)的內(nèi)容與科研相通，引進(jìn)2個(gè)準(zhǔn)確度和靈敏度高、重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)便、耗材低、對(duì)環(huán)境污染少的成熟的科研實(shí)驗(yàn)來(lái)充實(shí)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容［2］；同時(shí)，為了提高本科生免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)操作動(dòng)手能力、規(guī)范學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作的標(biāo)準(zhǔn)化，新增加1個(gè)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)操作基本技術(shù)的培訓(xùn)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，整合后的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目共16個(gè)，更注重于學(xué)生的綜合創(chuàng)新能力和實(shí)驗(yàn)動(dòng)手操作能力的培養(yǎng)。

3　統(tǒng)籌安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間

中心的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)需要完成酶標(biāo)儀檢測(cè)技術(shù)、凝集實(shí)驗(yàn)（示教）、單克隆抗體制備（示教）、多克隆抗體制備、淋巴細(xì)胞功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、NK細(xì)胞功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)等多個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。筆者曾將每一個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目分開(kāi)進(jìn)行，由于多克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)中免疫動(dòng)物階段需要的時(shí)間較長(zhǎng)，這樣完成整個(gè)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)需要兩個(gè)多月的時(shí)間。在這個(gè)時(shí)間范圍內(nèi)就造成前松后緊的情況，往往使學(xué)生不能很好地把握實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，容易產(chǎn)生厭煩情緒，從而影響實(shí)驗(yàn)效果［3］。

為了改善這種情況，統(tǒng)籌安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間，在多克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)中免疫動(dòng)物的一個(gè)月時(shí)間內(nèi)，穿插進(jìn)行另外幾個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的內(nèi)容，既保證每個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目相對(duì)獨(dú)立地開(kāi)展，又兼顧了長(zhǎng)時(shí)間綜合性實(shí)驗(yàn)的連續(xù)性和完整性。這樣在完成一個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的時(shí)間范圍內(nèi)，完成了整個(gè)免疫學(xué)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，時(shí)間從兩個(gè)多月縮短為一個(gè)多月，不僅使課程節(jié)奏相對(duì)統(tǒng)一，保障實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果，而且節(jié)省了學(xué)生和教師的時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)室的利用率。經(jīng)過(guò)幾年的教學(xué)實(shí)踐，得到教師和學(xué)生的廣泛認(rèn)可和好評(píng)。

4　改進(jìn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

在本科生免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，抗體制備是最為經(jīng)典的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目之一，也是生物學(xué)科學(xué)研究領(lǐng)域中常用的一種實(shí)驗(yàn)手段。下面以多克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)為例，介紹免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)方案設(shè)計(jì)和改進(jìn)等方面的工作進(jìn)展和經(jīng)驗(yàn)。

多克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)的基本流程 多克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)的基本流程如圖1所示，使用具有較高免疫原性的雞卵清白蛋白（OVA）作為抗原，注射免疫小鼠。經(jīng)3次免疫后的小鼠血清經(jīng)過(guò)梯度稀釋后，采用間接法酶聯(lián)免疫標(biāo)記技術(shù)（ELISA）檢測(cè)，據(jù)此判定所制備的多克隆抗體的效價(jià)。

*項(xiàng)目來(lái)源：吉林省教育教學(xué)改革重點(diǎn)項(xiàng)目“多功能酶標(biāo)儀熒光偏振免疫分析功能的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用”（基金編號(hào)：409020720134）。作者：姜丹，吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院工程師，研究方向?yàn)閷?shí)踐教學(xué)與管理研究；王飛、孟令軍、張洋、劉洋、劉艷，吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；孟慶繁，通訊作者，吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院副院長(zhǎng)兼中心常務(wù)副主任，主要從事實(shí)驗(yàn)室建設(shè)與管理研究（130012）。

圖1　多克隆抗體的制備流程

小鼠免疫方法的改革 在多克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)中，小鼠需要進(jìn)行3次免疫注射。小鼠的注射給藥方式有腹腔注射、靜脈注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、肌肉注射等。小鼠的尾靜脈注射是科研中最常用的給藥方法，但因?yàn)椴僮麟y度較高，需要較長(zhǎng)時(shí)間的操作訓(xùn)練才能熟練掌握，因此對(duì)于初學(xué)者成功率較低，在本科生實(shí)驗(yàn)中不采用此方法。

在以前的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中選用的是小鼠肌肉注射法，這種方法在操作時(shí)需要一個(gè)人固定小鼠，另一人用左手抓住小鼠的后肢，右手拿注射器，將注射器與半腱肌呈90°角迅速插入1/4，注入藥液。由于這種方式需要兩個(gè)人的配合，對(duì)于從未進(jìn)行過(guò)小鼠給藥注射的初學(xué)者來(lái)說(shuō)困難程度較大，尤其在完成第一次小鼠免疫的時(shí)候，常常因?yàn)槭址ㄉ琛⑴浜喜簧?，造成被小鼠咬傷或被注射器刺傷的情況。另外，由于小鼠體積小，肌肉層淺薄，肌肉注射也會(huì)造成小鼠不適或肌肉壞死等情況。

針對(duì)這一問(wèn)題，改用小鼠頸部皮下注射免疫法，這種方法是將藥液推入皮下結(jié)締組織，經(jīng)毛細(xì)血管、淋巴管吸收進(jìn)入血液循環(huán)的過(guò)程。操作時(shí)，用左手抓住小鼠的頸部皮膚，然后將皮膚提起，注射針頭取一鈍角角度刺入皮下，把針頭輕輕向左右擺動(dòng)，易擺動(dòng)則表示已刺入皮下，再輕輕抽吸，如無(wú)回血，可緩慢地將藥物注入皮下；拔針時(shí)左手拇、食指捏住進(jìn)針部位片刻，以防止藥物外漏。這種方法操作比較簡(jiǎn)單，而且一個(gè)人操作即可，因此在小鼠免疫的第1次和第2次注射時(shí)均采用此方法進(jìn)行，成功率較高，并且被小鼠咬傷的幾率降低。

在熟練掌握了小鼠皮下注射操作的情況下，為了使學(xué)生在小鼠免疫過(guò)程中盡可能多地掌握其他的給藥注射方式，在給小鼠第3次免疫時(shí)選用腹腔注射的給藥方式。這種方法是將藥物注入胃腸道漿膜以外、腹膜以?xún)?nèi)，由于腹膜面積大，密布血管和淋巴管，因此吸收速度較快。操作時(shí)用一只手固定小鼠，使小鼠的頭部向下，這樣腹腔中的器官就會(huì)自然倒向胸部，防止刺傷腹部器官；注射器針頭以45°角插入腹中線右側(cè)，緩緩將藥液推入；注射完畢后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉(zhuǎn)針頭，防止漏液。這種注射方式相對(duì)簡(jiǎn)單易行，學(xué)生在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中成功率較高，并且較為安全。

小鼠實(shí)驗(yàn)組設(shè)計(jì)方案的改革 在以前的小鼠免疫過(guò)程中將小鼠分為有佐劑和無(wú)佐劑兩組，每組2只小鼠，分別注射抗原＆免疫佐劑的混合液和抗原＆生理鹽水的混合液。有佐劑組多克隆抗體制備效果較好，最終得到的多克隆抗體效價(jià)較高；而無(wú)佐劑組多克隆抗體制備效果較差，最終得到的多克隆抗體效價(jià)較低。

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)分組，可以讓學(xué)生較好地認(rèn)識(shí)到免疫佐劑在抗體制備中的作用。然而通過(guò)多年的教學(xué)實(shí)踐，發(fā)現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)分組方案存在兩方面弊端。

1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物浪費(fèi)現(xiàn)象嚴(yán)重。一只小鼠通過(guò)摘眼球取血的方式，能夠獲得不少于100 μL的血清，而抗體效價(jià)檢測(cè)所需的血清用量是5 μL，因此，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置2只小鼠的作用僅僅是為了防止學(xué)生在免疫過(guò)程中由于操作不當(dāng)或飼養(yǎng)不經(jīng)心而發(fā)生的小鼠死亡。通過(guò)連續(xù)數(shù)年的教學(xué)實(shí)踐觀察，筆者發(fā)現(xiàn)在小鼠免疫過(guò)程中發(fā)生死亡的概率只有1%，即每學(xué)年50組學(xué)生總計(jì)200只小鼠的意外死亡數(shù)量平均只有2只，而為此額外設(shè)置2倍的小鼠用量是對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的嚴(yán)重浪費(fèi)。

2）無(wú)佐劑組小概率出現(xiàn)高效價(jià)抗體。雖然無(wú)佐劑組制備的多克隆抗體一般情況下效價(jià)都不高，可以作為免疫佐劑功能的陰性對(duì)照，但OVA較高的免疫原性使得無(wú)佐劑組小鼠中個(gè)別個(gè)體依然會(huì)產(chǎn)生較高的抗體效價(jià)，對(duì)ELISA實(shí)驗(yàn)的抗體效價(jià)數(shù)據(jù)假陽(yáng)性產(chǎn)生質(zhì)疑，使學(xué)生對(duì)理論知識(shí)的理解造成一定的混淆。

針對(duì)上述實(shí)驗(yàn)方案的缺陷，對(duì)原有的小鼠實(shí)驗(yàn)組設(shè)置方式進(jìn)行優(yōu)化，如表1所示。將實(shí)驗(yàn)小鼠分為有佐劑組、無(wú)佐劑組和無(wú)抗原組，每組1只小鼠。有佐劑組注射免疫佐劑和抗原的混合液，無(wú)佐劑組注射抗原的生理鹽水溶液，無(wú)抗原組只注射等量的生理鹽水。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)課進(jìn)行過(guò)程中，由助教按照標(biāo)準(zhǔn)流程與學(xué)生平行進(jìn)行一組示范實(shí)驗(yàn)，所得的小鼠血清作為標(biāo)準(zhǔn)樣本備用。新的小鼠實(shí)驗(yàn)組設(shè)置有效地解決了實(shí)驗(yàn)小鼠的浪費(fèi)現(xiàn)象和陰性對(duì)照組不全的問(wèn)題，在發(fā)生小鼠意外死亡的小概率事件時(shí)，任課教師會(huì)在ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí)為該組提供相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)血清使其順利完成ELISA實(shí)驗(yàn)。另外，無(wú)抗原組作為抗原的陰性對(duì)照組是不會(huì)出現(xiàn)任何抗體效價(jià)信號(hào)的，在無(wú)佐劑組出現(xiàn)小概率高效價(jià)信號(hào)時(shí)能夠起到很好的對(duì)照和參考作用。

表1　免疫小鼠實(shí)驗(yàn)組

5　結(jié)語(yǔ)

針對(duì)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中存在的問(wèn)題，對(duì)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容的設(shè)置、實(shí)驗(yàn)教學(xué)時(shí)間的統(tǒng)籌安排、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案的改進(jìn)進(jìn)行一系列的改革和探索，使免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量有了大幅度的提高。同時(shí)，學(xué)生的實(shí)驗(yàn)興趣與科研能力顯著提升，由被動(dòng)學(xué)習(xí)轉(zhuǎn)變?yōu)樽灾餍詫W(xué)習(xí)、合作性學(xué)習(xí)和研究性學(xué)習(xí)。在此基礎(chǔ)上要不斷完善，使實(shí)驗(yàn)教學(xué)水平更上一個(gè)新的臺(tái)階，為發(fā)展學(xué)生創(chuàng)新思維能力，進(jìn)一步獲取和創(chuàng)造新知識(shí)打下基礎(chǔ)［4-5］。■

［1］王敏，包常華.提高醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量的探索與體會(huì)［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育，2014，16（11）：938-939.

［2］蘇小平，王全興.本科生免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革實(shí)踐［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育，2014，16（8）：612-622.

［3］任可，陳建芳，常江，等.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革初探［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2014（30）：1259-1260.

［4］潘清.創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)教學(xué)探索［J］.實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2010，27（8）：24-26.

［5］由繼紅.實(shí)驗(yàn)室與創(chuàng)新教育研究［J］.實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2010，27（9）：16-17.

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