新型可溶性鳥苷酸環(huán)化酶激動劑sGC003對內(nèi)皮素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的作用

劉 可，顏玲娣，雍 政，宮澤輝，蘇瑞斌（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，北京 100850）

新型可溶性鳥苷酸環(huán)化酶激動劑sGC003對內(nèi)皮素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的作用

劉 可，顏玲娣，雍 政，宮澤輝，蘇瑞斌
（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，北京 100850）

目的 研究可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（sGC）激動劑sGC003對內(nèi)皮素1（ET-1）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的作用。方法 通過復(fù)合酶消化法及差速貼壁法培養(yǎng)SD乳大鼠原代心肌細(xì)胞，以ET-1 10 nmol·L-1刺激其發(fā)生肥大，同時給予sGC003 0.01，0.1和1.0 μmol·L-1，48 h后在倒置顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)，圖像分析軟件（Image-Pro Plus6.0）對心肌細(xì)胞表面積進(jìn)行測量分析，BCA法檢測心肌細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量，實時定量PCR法檢測心房利鈉肽基因（ANP）mRNA表達(dá)。結(jié)果 與正常對照組相比，ET-1 10 nmol·L-1刺激心肌細(xì)胞48 h，可使心肌細(xì)胞表面積增加80%（P＜0.01），總蛋白質(zhì)含量增加120%（P＜0.01），ANP mRNA水平升高140%（P＜0.01）。給予sGC003 0.01～1.0 μmol·L-1能對抗ET-1引起的心肌細(xì)胞表面積增大（P＜0.01）和總蛋白質(zhì)含量升高（P＜0.05），對于ET-1誘導(dǎo)的ANP mRNA表達(dá)增加也有一定抑制作用（P＜0.05）。結(jié)論sGC003可改善ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，對心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。

可溶性鳥苷酸環(huán)化酶；激動劑；sGC003；心肌細(xì)胞；內(nèi)皮素1；心肌肥大

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2016.04.006

我國心血管疾病發(fā)生人數(shù)和死亡人數(shù)逐年增加，是城鄉(xiāng)居民疾病死亡的首要原因［1］。心肌肥大是高血壓、心肌梗死、缺血性心臟病和心瓣膜病等許多心血管疾病的共同病理過程，被公認(rèn)為是引起心血管疾病發(fā)生率和死亡率顯著升高的獨立危險因素。因此，改善心肌肥大對多種心血管疾病的治療有著重要意義［2］。

可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）是一種在體內(nèi)廣泛分布的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)酶，被一氧化氮（nitric oxide，NO）激活后催化三磷酸鳥苷反應(yīng)生成第二信使環(huán)鳥苷酸（cyclic guanosine monophosphate，cGMP），介導(dǎo)許多心血管系統(tǒng)生理過程，如促進(jìn)血管和平滑肌舒張、抑制血小板凝聚、抑制血管重構(gòu)等［3-4］。因此，NO/sGC/cGMP通路成為治療多種心血管疾病，如肺動脈高壓、急性心衰、心絞痛和心肌梗死誘發(fā)血管重構(gòu)等的有效靶標(biāo)［5］。多年來，眾多研究者以此開發(fā)了NO供體、磷酸二酯酶抑制劑和非NO依賴性sGC激動劑等藥物，其中非NO依賴性sGC激動劑能避免傳統(tǒng)的NO供體類藥物易出現(xiàn)耐受、作用特異性不強和持續(xù)時間短等缺點［6］，受到了廣泛關(guān)注。目前已有系列的sGC激動劑被相繼開發(fā)，其中由德國拜耳先靈制藥公司研發(fā)的利奧西呱（riociguat）已獲得美國、歐盟及日本等多個國家批準(zhǔn)，用于治療慢性血栓栓塞性肺動脈高壓和成人動脈型肺動脈高壓，但利奧西呱尚未在中國上市。

本所藥物化學(xué)合成研究室以利奧西呱為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造得到了一系列化合物，從中篩選得到sGC003（相對分子質(zhì)量424.8）作為候選化合物，目前已申請并獲得國家專利［7］。本研究室前期藥效學(xué)評價研究表明，在慢性低氧及野百合堿誘導(dǎo)的SD大鼠肺動脈高壓模型上，預(yù)防給予sGC003能明顯降低大鼠肺動脈壓和右心指數(shù)，改善右心室肥大，具有良好的藥理作用。以往對sGC003的研究多集中于對病理模型動物癥狀的改善，其是否具有直接改善心肌肥大的作用未見報道。本研究采用復(fù)合酶消化法和差速貼壁法培養(yǎng)SD乳大鼠原代心肌細(xì)胞，內(nèi)皮素1（endothelin-1，ET-1）刺激其肥大，檢測sGC003對肥大的心肌細(xì)胞表面積、總蛋白質(zhì)含量和心房利鈉肽基因（atrial natriuretic peptide，ANP）mRNA表達(dá)的影響，明確sGC003對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

1　材料與方法

1.1試劑和儀器

sGC003和利奧西呱由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所藥物化學(xué)合成研究室合成；ET-1購自德國Merck公司；5-溴脫氧核糖尿苷（5-bromodeoxyuri?dine deoxyribose，BrdU）、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白、谷氨酰胺和異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocya?nate，F(xiàn)ITC）購自美國Sigma公司；DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清、青霉素和鏈霉素購自美國Hyclone公司；胰酶和膠原酶Ⅱ購自美國Invitrogen公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；Power SYBR Green購自美國Thermo Fisher Scientific公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。PCR引物由北京奧科生物有限公司合成。

3-16PK低溫高速離心機（美國Sigma公司），2800UV/VIS紫外分光光度計（美國UNICO公司），Gel logic1500凝膠成像系統(tǒng)（美國Kodak公司），EDC-810基因擴(kuò)增儀（北京東勝創(chuàng)新科技有限公司），ABI prism 7300實時定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司），EVOS f1大屏幕倒置熒光顯微鏡（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2SD乳大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)［8］

出生24 h的SPF級SD大鼠乳鼠由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供，動物合格證號SCXK-（軍）2012-0004。無菌條件下，自乳鼠劍突處開胸，暴露心臟，剪取心尖部分置于預(yù)冷的D-Hanks液中，洗凈血污并轉(zhuǎn)移至另一盛有冷D-Hanks液的平皿后用D-Hanks液清洗2次，將心臟剪成約1 mm× 1 mm×1 mm的組織碎塊，繼續(xù)D-Hanks液清洗后轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加入約5倍于組織體積的消化液（0.125%胰酶∶0.1%膠原酶Ⅱ=2∶1），37℃水浴，輕輕搖晃，每次3 min，消化6～8次，至心肌組織塊基本消化完全，收集除第一次消化后的細(xì)胞懸液，加入等體積預(yù)冷的DMEM/F12完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）以終止胰酶消化作用。將細(xì)胞懸液輕輕吹打約1 min，過200目篩，除去未消化組織及細(xì)胞團(tuán)塊。將濾液432×g離心10 min，棄上清，向沉淀中加入適量DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)80 min后吸取細(xì)胞懸液，根據(jù)實驗需求稀釋至合適密度接種在培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中。細(xì)胞培養(yǎng)的前72 h用含BrdU 0.1 mmol·L-1的DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)以抑制成纖維細(xì)胞增殖，之后換成無BrdU的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，再進(jìn)行后續(xù)給藥處理。

1.3ET-1刺激心肌細(xì)胞肥大模型的建立

將心肌細(xì)胞接種于6孔板，分別加入ET-1 0，1，10和100 nmol·L-1，分別處理24和48 h，觀察并檢測心肌細(xì)胞表面積及ANP mRNA的表達(dá)，以確定后續(xù)實驗條件。

1.4心肌細(xì)胞表面積的觀察和測量［8］

將心肌細(xì)胞1×107L-1接種于6孔板，分為6組：對照組、ET-1 10 nmol·L-1組、ET-1+利奧西呱0.1 μmol·L-1組、ET-1+sGC003 0.01，0.1和1.0 μmol·L-1組，藥物處理48 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，4%甲醛固定20 min；PBS洗2次，加入含0.1%FITC和0.01%Hoechst的PBS，室溫下避光孵育1 h，PBS洗4次，在倒置熒光顯微鏡下觀察，隨機選擇8個視野，每個視野10個細(xì)胞，拍照，用圖像分析軟件（Image-Pro Plus6.0）對心肌細(xì)胞表面積進(jìn)行測量分析。

1.5BCA法檢測心肌細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量

將心肌細(xì)胞1×108L-1接種于6孔板，分組處理同1.4。給藥48 h后，棄去培養(yǎng)基，用適量PBS洗3次，加入適量細(xì)胞裂解液使細(xì)胞裂解，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，置于4℃冰箱中緩搖混勻。將裂解液15 000×g離心20 min，4℃，將上清液轉(zhuǎn)移至另一EP管中。取適量上清液按照試劑盒說明書測定蛋白質(zhì)濃度。

1.6實時熒光定量PCR法檢測心肌細(xì)胞ANP mRNA表達(dá)［9］

將心肌細(xì)胞1×108L-1接種于6孔板，分組同1.4。給藥48 h后，棄去培養(yǎng)基，用適量PBS洗3次，每孔加入0.5 mL Trizol試劑裂解細(xì)胞，收集裂解液，氯仿抽提，異丙醇沉淀，75%乙醇（現(xiàn)配現(xiàn)用）洗滌沉淀，得到細(xì)胞總RNA。1.2%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計測定RNA純度和濃度。取1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，引物序列如表1所示，反應(yīng)體系為20 μL，設(shè)定反應(yīng)條件為30℃10 min，42℃ 60 min，99℃5 min，5℃5 min。以Power SYBR Green為熒光指示物，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)，GAPDH為內(nèi)參。電腦自動記錄樣品熒光反應(yīng)曲線、融解曲線及反應(yīng)循環(huán)數(shù)（Ct），用2-△△Ct表示ANP mRNA相對表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

Tab.1 PCR primer sequence［10］

2　結(jié)果

2.1ET-1刺激心肌細(xì)胞肥大方法的建立及確證

由圖1可見，在顯微鏡下觀察到培養(yǎng)的SD乳大鼠原代心肌細(xì)胞貼壁展開，呈梭形、三角形或多邊形等，有自主性節(jié)律搏動，并且較密集處的心肌細(xì)胞會形成放射狀細(xì)胞簇，搏動同步化。與正常對照組比較，ET-1 1，10和100 nmol·L-1刺激24 h，心肌細(xì)胞面積無顯著變化（數(shù)據(jù)略）；刺激48 h，細(xì)胞面積顯著增加，增大率分別為117%，163%和154% （P＜0.01）。

由圖2可見，ET-1 1，10和100 nmol·L-1刺激24 h，ANP mRNA表達(dá)分別上調(diào)21%，18%和24% （P＜0.05）；刺激48 h后，ANP mRNA表達(dá)增幅更大，分別上調(diào)94%，68%和76%（P＜0.01）。故后續(xù)實驗選擇ET-1 10 nmol·L-1作用48 h以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。

Fig.1 Effect of endothelin-1（ET-1）on cardiomyocyte area of neonatal Sprague-Dawley rats.The cardiomyo?cytes were treated with ET-1 1，10 and 100 nmol·L-1for 48 h，re?spectively.A：morphology of cardiomyocytes；B：cardiomyo?cyte area expressed by the elementary area.±s，n=8.**P＜0.01，compared with normal control group.

Fig.2 Effect of ET-1 on ANP mRNA expression of neonatal Sprague-Dawley rat cardiomyocytes.±s，n=4. *P＜0.05，**P＜0.01 compared with corresponding normal control group.

2.2sGC003對ET-1所致肥大心肌細(xì)胞表面積的影響

由圖3可見，與正常對照組相比，ET-1 10 nmol·L-1刺激心肌細(xì)胞48 h使細(xì)胞表面積增大約85%（P＜0.01）；與ET-1單獨處理組比較，sGC003 0.01，0.1和1.0 μmol·L-1能降低ET-1引起的心肌細(xì)胞表面積增加，分別使細(xì)胞表面積減少了16%，21%和39%（P＜0.01），其作用與利奧西呱相近，表明sGC003能有效地抑制ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

2.3sGC003對ET-1所致肥大心肌細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量的影響

由圖4可見，ET-1 10 nmol·L-1刺激心肌細(xì)胞48 h后，心肌細(xì)胞總蛋白含量顯著增加，為正常對照組的2.24倍（P＜0.01）。與單獨給予ET-1 10 nmol·L-1組相比，給予sGC003 0.01，0.1和1.0 μmol·L-1能降低ET-1引起的心肌細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量升高，分別使總蛋白含量降低了36%，38%和46%（P＜0.05），其作用與利奧西呱相近。

2.4sGC003對ET-1所致肥大心肌細(xì)胞ANP mRNA表達(dá)的影響

由圖5所示，ET-1 10 nmol·L-1刺激心肌細(xì)胞48 h后，ANP mRNA表達(dá)顯著升高，為正常對照組的2.44倍（P＜0.01）；ET-1與sGC003 0.1 μmol·L-1聯(lián)合處理組ANP mRNA表達(dá)較ET-1單獨處理組明顯下降＞30%（P＜0.05），sGC003 0.01和1.0 μmol·L-1對ET-1引起的ANP mRNA表達(dá)無明顯影響，提示sGC003對ET-1誘導(dǎo)的ANP mRNA的過表達(dá)具有一定的抑制作用。

Fig.3　Effect of novel agonist of soluble guanylate cyclase sGC003 on ET-1-induced cardiomyocyte area changes in neonatal rats.　Thecardiomyocyteswere cultured with ET-1（10 nmol·L-1），ET-1+riociguat（0.1 nmol·L-1）and　ET-1+sGC003（0.01，0.1 and 1.0 nmol·L-1）for 48 h. A：cardiomyocyte morphology；B：the cardiomyocyte area expressed by the elementary area.±s，n=8-9.**P＜0.01，com?pared with normal control group；##P＜0.01，compared with ET-1 group.

Fig.4 Effect of sGC003 on ET-1-induced total protein content changes in neonatal rat cardiomyocytes.See Fig.3 for the cell treatment.±s，n=5.**P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with ET-1 control group.

Fig.5 Effect of sGC003 on ET-1-induced ANP mRNA of neonatal rat cardiomyocytes expression.See Fig.3 for the cell treatment.±s，n=3.**P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with ET-1 group.

3　討論

心肌肥大在初期可視為心臟對血流動力學(xué)超負(fù)荷或神經(jīng)體液刺激的一種有益的代償機制，但長時間持續(xù)的心肌肥大最終會導(dǎo)致心律失常、心力衰竭，甚至猝死［11］。因此，對于肥大心肌的藥物保護(hù)研究一直都是心血管領(lǐng)域的重要課題。本研究發(fā)現(xiàn)，sGC003對ET-1誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞肥大具有一定的保護(hù)作用。

盡管心肌肥大的誘因多種多樣，但其典型表現(xiàn)為：在分子水平主要是胚胎基因ANP、β心肌肌球蛋白重鏈和心肌肌球蛋白輕鏈2等過表達(dá)及胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成增加；在細(xì)胞、組織水平為心肌細(xì)胞肥大、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等非心肌細(xì)胞增殖和以膠原沉積為主要表現(xiàn)的細(xì)胞外基質(zhì)重建；在器官水平為心臟質(zhì)量增加，心室壁增厚或心腔擴(kuò)大；反映到功能上表現(xiàn)為心臟收縮、舒張紊亂，心臟順應(yīng)性降低。本研究選用ET-1誘導(dǎo)原代心肌細(xì)胞肥大排除了血流動力學(xué)負(fù)荷和其他神經(jīng)體液刺激等影響因素，是常用的評價心肌肥大的離體實驗?zāi)Ｐ?。ET-1可激活磷脂酶C/三磷酸肌醇途徑，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加或通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPK）通路，最終啟動相關(guān)基因表達(dá)從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大［12］。肥大的心肌細(xì)胞客觀上表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積明顯增加，顯微鏡下可觀察到細(xì)胞表面積增加；蛋白質(zhì)合成速率顯著升高，總蛋白質(zhì)含量增加；心肌細(xì)胞胚胎基因重新表達(dá)，ANP上調(diào)是心肌細(xì)胞肥大的標(biāo)志。為成功建立心肌肥大的離體實驗?zāi)Ｐ?，本研究觀察了ET-1不同濃度及不同刺激時間對心肌細(xì)胞表面積和ANP mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，ET-1使心肌細(xì)胞表面積顯著增加，并上調(diào)心肌肥大標(biāo)志基因ANP mRNA表達(dá)，表明ET-1造成了心肌細(xì)胞肥大，適用于后續(xù)研究。

心肌肥大是一種由多種因素參與調(diào)節(jié)的復(fù)雜動態(tài)過程，現(xiàn)已證實磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路、MAPK通路、NO/cGMP通路等多條信號通路均參與其病理過程［13-16］。cGMP作為體內(nèi)廣泛存在的第二信使在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，在心血管疾病的發(fā)生過程中，NO/sGC/ cGMP信號通路是紊亂的，究其原因，大多是病理條件下NO被清除，從而阻斷了sGC的激活［6］。sGC003是不依賴于NO的sGC激動劑，一方面能直接刺激sGC活性，另一方面能與NO發(fā)揮協(xié)同作用，在NO供體類藥物硝普鈉2 μmol·L-1存在的情況下，sGC003能明顯提高SD乳大鼠原代心肌細(xì)胞中cGMP的濃度，EC50為0.473 μmol·L-1，與利奧西呱相當(dāng)；抗低氧誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓的有效劑量為10 mg·kg-1。本研究以ET-1刺激心肌細(xì)胞肥大，考察sGC003對肥大心肌細(xì)胞的直接作用，發(fā)現(xiàn)sGC003能有效地抑制ET-1引起的心肌細(xì)胞面積增加、總蛋白含量升高和ANP mRNA表達(dá)增加，其作用與陽性藥利奧西呱相當(dāng)，提示其能夠改善ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，對心肌細(xì)胞有直接保護(hù)作用，這對于sGC003適應(yīng)證的選擇具有重要的指導(dǎo)意義，也為sGC作為臨床上治療心血管疾病的靶點提供了實驗依據(jù)。sGC003抑制心肌細(xì)胞肥大的具體機制有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：齊春會）

Effect of novel agonist of soluble guanylate cyclase sGC003 on endothelin-1-induced cardiomyocyte hypertrophy

LIU Ke，YAN Ling-di，YONG Zheng，GONG Ze-hui，SU Rui-bin
（State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures，Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

OBJECTlVE To investigate the protective effect of sGC003，a novel agonist of soluble guanylate cyclase，on endothelin-1（ET-1）-induced cardiomyocyte hypertrophy.METHODS Cardiomy?ocytes were isolated from neonatal Sprague-Dawley rats using serial enzymatic digestion and then incubated with ET-1 10 nmol·L-1in the absence or presence of sGC003 0.01，0.1 and 1.0 μmol·L-1.Hyper?trophic responses including the cardiomyocyte area（Image-Pro Plus 6.0），the expression of atrial natri?uretic peptide gene（ANP）mRNA（RT-PCR method）and total protein content（BCA method）were detect?ed.RESULTS After 48 h stimulation with ET-1 10 nmol·L-1，the cardiomyocyte area increased by 80% （P＜0.01），the total protein content increased by 120%（P＜0.01）and the expression of ANP mRNA up-regulated by 140%（P＜0.01）.sGC0030.01，0.1 and 1.0 μmol·L-1elicitedantihypertrophic actions，including inhibition of ET-1-mediated increase in the cardiomyocyte area（P＜0.01），raised total protein content（P＜0.05）and upregulation of ANP mRNA（P＜0.05）.CONCLUSlON sGC003 has protective，car?diomyocyte-selective antihypertrophic effects in vitro.

soluble guanylate cyclase；agonist；sGC003；cardiomyocytes；endothelin-1；cardiac hypertrophy

The project supported by National Science and Technology Major Project of China（2012ZX09301-001-006）

SU Rui-bin，E-mail：ruibinsu@126.com，Tel：（010）66931607

R972

A

1000-3002-（2016）04-0338-06

國家科技重大專項（2012ZX09301-001-006）

劉 可，女，碩士研究生，主要從事新藥評價研究，E-mail：liuke1991f@126.com；蘇瑞斌，男，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事新藥評價與神經(jīng)精神藥理學(xué)研究。

蘇瑞斌，E-mail：ruibinsu@126.com，Tel：（010）66931607

2016-01-12接受日期：2016-03-21）