順鉑通過抑制轉(zhuǎn)移抑制基因1-細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶及絲氨酸/蘇氨酸激酶激活抑制HeLa細(xì)胞增殖

張 思，劉元林，李 雪，周向東，趙 岳，張萍萍，童 英，，張 毅（.解放軍醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科，北京 0085；.空軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 00；.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞生物學(xué)研究室，北京 00850；.包頭市九原區(qū)醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭 0060）

順鉑通過抑制轉(zhuǎn)移抑制基因1-細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶及絲氨酸/蘇氨酸激酶激活抑制HeLa細(xì)胞增殖

張 思1，劉元林3，李 雪3，周向東2，趙 岳4，張萍萍2，童 英1，2，張 毅3
（1.解放軍醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科，北京 100853；2.空軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100142；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞生物學(xué)研究室，北京 100850；4.包頭市九原區(qū)醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭 014060）

目的 研究順鉑（DDP）抑制HeLa細(xì)胞增殖的分子機制。方法 用順鉑0.02～75 μmol·L-1處理HeLa細(xì)胞24或48 h，CCK-8法檢測細(xì)胞存活，劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移力，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，實時熒光定量PCR（q-PCR）檢測轉(zhuǎn)移抑制基因1（MTSS1）基因的表達，Western蛋白質(zhì)印跡法檢測磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（p-ERK）、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶（p-AKT）和轉(zhuǎn)移抑制基因1（MTSS1）蛋白水平。結(jié)果 不同濃度DDP處理HeLa細(xì)胞24或48 h，可明顯抑制HeLa細(xì)胞增殖（P＜0.05），細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）值分別為4.14和11.82 μmol·L-1；DDP處理組HeLa細(xì)胞較對照組遷移能力下降（P＜0.05）；DDP使HeLa細(xì)胞周期阻滯于S期；DDP抑制HeLa細(xì)胞MTSS1的基因表達，存在明顯的濃度效應(yīng)關(guān)系（r24 h=-0.965，P＜0.01；r48 h=-0.953，P＜0.01）；p-ERK，p-AKT及胞內(nèi)MTSS1蛋白表達水平均隨DDP濃度增加顯著下降（p-ERK：r24 h=-0.875，P＜0.01；r48 h=-0.966，P＜0.01；p-AKT：r24 h=-0.831，P＜0.01；r48 h=-0.863，P＜0.01；MTSS1：r24 h=-0.969，P＜0.01；r48 h=-0.988，P＜0.01）。結(jié)論 DDP可能通過下調(diào)MTSS1的表達水平并抑制ERK和AKT信號通路的激活而抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和遷移。

順鉑；HeLa細(xì)胞；細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶；絲氨酸/蘇氨酸激酶；轉(zhuǎn)移抑制基因1

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2016.04.008

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病呈現(xiàn)上升及年輕化趨勢［1］，并且癌癥的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移仍是宮頸癌治療最大難題。因此，研究宮頸癌的發(fā)病機制尤為重要。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulatedkinase，ERK）是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）家族成員之一，磷酸化ERK （p-ERK）具有介導(dǎo)并促進細(xì)胞增殖與分化、維持細(xì)胞形態(tài)、抑制細(xì)胞凋亡等功能，在細(xì)胞癌變及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［2］。除MAPK家族，蛋白激酶絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine-threonine kinase，AKT）的磷酸化可阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生［3］，這2種信號通路均為表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）信號通路的下游通路，都可影響腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特定的生物學(xué)效應(yīng)。轉(zhuǎn)移抑制基因1（metastasis suppressor 1，MTSS1）又稱轉(zhuǎn)移遺失基因（missing in metastasis），定位于染色體8q24.1。MTSS1可通過多途徑調(diào)控肌動蛋白參與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移［4-8］，從而在惡性腫瘤的生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用。有研究指出，該基因與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［9］。

本研究觀察順鉑（cisplatin，DDP）不同濃度和作用時間對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、p-ERK和p-AKT蛋白及MTSS1基因表達的影響，探討DDP調(diào)控HeLa細(xì)胞增殖的作用機制，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、試劑和儀器

人宮頸癌HeLa細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞生物學(xué)研究室保存。DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清，購自奧地利PAALaboratories公司；DDP購自齊魯制藥有限公司；CCK-8試劑購自日本Dojindo公司；PI試劑購于美國BD Pharmingin公司；RNA提取試劑Trizol購自美國Sigma公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒均購自北京康為世紀(jì)公司；鼠源MTSS1抗體購自美國Abcam公司；兔源p-ERK，ERK，p-AKT及AKT抗體購自美國CST公司；羊抗鼠和羊抗兔二抗購自美國SANTA CRUZ公司。二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；Immunoskan 340型酶標(biāo)儀購自英國BDSL公司；FC500 Mcl型流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter公司；Western蛋白質(zhì)印跡實驗相關(guān)儀器購自美國Bio-Rad公司；實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和藥物配制

HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（青霉素100 kU·L-1和鏈霉素0.1 g·L-1），置于5%CO2，37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后進行相關(guān)實驗。DDP用PBS配制成濃度為1 mmol·L-1的貯存液，過濾除菌，分裝后4℃避光貯存，使用時用DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.3CCK-8法檢測細(xì)胞存活

0.25%胰酶消化對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞，離心后在96孔板中配制100 μL的細(xì)胞懸液，每孔1×104細(xì)胞。將96孔板放入培養(yǎng)箱孵育24 h，分別加入DDP 0，0.02，0.1，0.5，2.5，12.5，25，50和75 μmol·L-1，空白對照組不加細(xì)胞和藥物。繼續(xù)孵育24或48 h，棄去原培養(yǎng)基，每孔加入新DMEM培養(yǎng)基100 μL和CCK-8溶液10 μL，培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀測定波長450 nm處吸光度值（A450nm）。計算各組24和48 h細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=〔（A對照孔-A空白孔）-（A加藥孔-A空白孔）/（A對照孔-A空白孔）〕×100%，每個濃度設(shè)3復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.4劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移力和侵襲力

取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞，消化接種6孔板，孵育24 h后，用200 μL槍頭在6孔板底沿直線劃痕，PBS沖洗3次，加入無血清單純培養(yǎng)基，分別加入DDP 0，0.02，0.1，0.5，2.5和12.5 μmol·L-1，加藥后0，24和48 h于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕愈合情況并拍照分析。以劃痕面積為基準(zhǔn)，24和48 h后分別量取與劃痕區(qū)域相同面積，采用Image J軟件檢測劃痕愈合前后劃痕區(qū)域灰度值，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）=〔（0 h劃痕區(qū)灰度值-24劃痕區(qū)灰度值/48 h劃痕區(qū)灰度值）/0 h劃痕區(qū)灰度值〕× 100%。

1.5流式檢測細(xì)胞周期

取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞，細(xì)胞生長融合度約50%，分別加入DDP 0，0.02，0.1，0.5，2.5和12.5 μmol·L-1，孵育24和48 h，然后消化離心收集細(xì)胞，258×g離心5 min，棄上清，1 mL PBS清洗，258×g離心5 min，去上清，加入500 μL PI染液（含RNA酶），室溫避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，實驗重復(fù)3次。

1.6q-PCR檢測基因MTSS1 mRNA表達水平

DDP 0，0.02，0.1，0.5，2.5和12.5 μmol·L-1分別處理HeLa細(xì)胞24和48 h，按Trizol說明書步驟提取細(xì)胞RNA，定量后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)熒光定量PCR試劑說明書進行PCR擴增，MTSS1引物序列：上游引物5′-TAGTGTTTAAGAAAGCAAGCAAGTC-3′，下游引物5′-GAGGGTTCGGTCAGAAATGTG-3′；內(nèi)參β肌動蛋白引物序列：上游引物5′-GCTGTCACCTTCACCGTTC-3′，下游引物5′-CCATCGTCCACCGCAAAT-3′；q-PCR反應(yīng)程序：95℃10 min預(yù)熱，95℃15 s，60℃1 min，共40個循環(huán)后，95℃ 15 s，60℃1 min，95℃15 s，60℃15 s繪制溶解曲線，實驗所得數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。

1.7Western蛋白質(zhì)印跡法檢測p-ERK，p-AKT和MTSS1蛋白表達

DDP 0，0.02，0.1，0.5，2.5和12.5 μmol·L-1分別處理HeLa細(xì)胞24和48 h，收集并裂解細(xì)胞，提取總蛋白，由BCA試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度。取蛋白質(zhì)樣品60 μg進行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)移至纖維素膜上，經(jīng)過含5%脫脂牛奶的TBST封閉1 h，孵育相關(guān)蛋白的一抗（設(shè)β肌動蛋白為內(nèi)參），4℃搖床搖勻過夜，再與相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，ECL化學(xué)發(fā)光法進行顯色，X線膠片于暗室曝光，隨后顯影并定影。用Quantity One軟件進行積分吸光度值分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1順鉑對HeLa細(xì)胞存活的影響

CCK-8實驗結(jié)果（圖1）表明，DDP 0.02～75 μmol·L-1對HeLa細(xì)胞存活具有抑制作用（P＜0.05），隨著藥物濃度的升高，其抑制細(xì)胞存活也顯著增強，作用24和48 h IC50值分別為4.14和11.82 μmol·L-1。提示DDP對HeLa細(xì)胞增殖具有抑制作用，且呈濃度依賴性（r24 h=0.993，P＜0.01；r48 h=0.993，P＜0.01）。

Fig.1 lnhibitory effect of cisplatin（DDP）on HeLa cell proliferation detected by CCK-8 assay.HeLa cells were treated with DDP for 24 and 48 h，respectively.±s，n=3.*P＜0.05，compared with corresponding control group.

Fig.2　Effect of DDP on migration and invasion of HeLa cells.HeLa cells were treated with DDP for 24 or 48 h.±s，n=3.*P＜0.05，compared with corresponding control group.

Tab.1 Effect of DDP on HeLa cell cycle

2.2順鉑對HeLa細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

細(xì)胞對照組48 h后劃痕處有顯著的細(xì)胞遷移。隨著DDP濃度升高，肉眼可見漂浮死細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞遷移能力顯著下降（P＜0.05），其中DDP 12.5 μmol·L-1處理組在48 h內(nèi)遷移能力最弱。提示高濃度DDP對HeLa細(xì)胞的遷移和侵襲能力有顯著的抑制作用（圖2）。

2.3順鉑對HeLa細(xì)胞周期的影響

由表1顯示，隨著DDP濃度升高和作用時間延長，HeLa細(xì)胞G0/G1期百分率逐漸降低（P＜0.05），S期和G2/M期細(xì)胞百分率逐漸增加（P＜0.05）。表明DDP嚴(yán)重干擾HeLa細(xì)胞周期，使其阻滯于S期和G2/M期。

2.4順鉑對HeLa細(xì)胞MTSS1基因表達的影響

q-PCR實驗結(jié)果顯示，DDP與HeLa細(xì)胞作用24和48 h，隨著濃度升高，HeLa細(xì)胞MTSS1 mRNA表達逐漸減少（r24 h=-0.965，P＜0.01；r48 h=-0.953，P＜0.01）（圖3A）。Western蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果表明，隨著DDP濃度升高，MTSS1蛋白表達也隨之下降（r24 h=-0.969，P＜0.01；r48 h=-0.988，P＜0.01）（圖3B和C）。

Fig 3.Metastasis suppressor 1（MTSS1）expression in HeLa cells treated with DDP for 24 or 48 h.A：rela?tive quantification of MTSS1 mRNA was detected by q-PCR；B and C：expression of protein was detected by Western blotting，C was the relative expression level of MTSS1 protein showed as integrated absorption（IA）Target protein/IAβ-Actin.±s，n=3.*P＜0.05，com?pared with corresponding control group.

2.5順鉑對HeLa細(xì)胞p-ERK及p-AKT蛋白水平的影響

Western蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果（圖4）表明，隨著DDP濃度升高，HeLa細(xì)胞中p-ERK和p-AKT蛋白水平逐漸下降，呈明顯的濃度依賴性（p-ERK：r24 h=-0.875，P＜0.01；r48 h=-0.966，P＜0.01；p-AKT： r24 h=-0.831，P＜0.01；r48 h=-0.863，P＜0.01）。

Fig.4 Phosphorylated-extracellular　signal-regulated kinase（p-ERK）and phosphorylated-serine-threonine kinase（p-AKT）levels in HeLa cells treated with DDP for 24（A）or 48 h（B）.A2 and B2 were the semi-quantitive results of A1 and B1，respectively.±s，n=3.*P＜0.05，compared with cor?responding control group.

3　討論

DDP作為臨床應(yīng)用極為廣泛的含鉑類化療藥物，是細(xì)胞周期非特異性抗腫瘤藥物［10］。該藥已用于多種實體腫瘤的治療，是目前較為有效的化療藥物［11-12］。本研究利用DDP處理HeLa細(xì)胞并檢測其對ERK及AKT這2種信號通路和MTSS1基因表達的影響。DDP處理HeLa細(xì)胞24或48 h，劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移力和侵襲力的改變。結(jié)果顯示，HeLa細(xì)胞的遷移力及侵襲力隨DDP濃度升高而明顯減弱。CCK-8實驗結(jié)果進一步證實DDP對HeLa細(xì)胞存活具有明顯抑制作用。在細(xì)胞周期檢測結(jié)果中，DDP 0.5～12.5 μmol·L-1作用24和48 h，HeLa細(xì)胞明顯被阻滯于S期，呈濃度依賴性?？梢奃DP不但抑制HeLa細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞遷移及侵襲的能力，并能有效阻滯HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期。

Dawson等［13］研究發(fā)現(xiàn)，MTSS1通過調(diào)控表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）受體定位到細(xì)胞膜而調(diào)控EGF信號通路的激活，并影響細(xì)胞內(nèi)p-ERK和p-AKT蛋白水平。本研究Western蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果表明，高濃度DDP處理使HeLa細(xì)胞內(nèi)p-ERK和p-AKT水平下調(diào)，并伴有MTSS1蛋白水平下調(diào)。q-PCR結(jié)果提示，DDP濃度越高，作用時間越長，MTSS1基因表達越低，與Western蛋白質(zhì)印跡檢測到細(xì)胞中MTSS1蛋白水平的變化相一致。據(jù)此推斷，DDP通過干擾MTSS1蛋白表達，以及阻斷ERK和AKT信號通路的激活，從而抑制HeLa細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移過程。MTSS1表達水平與DDP濃度呈顯著的負(fù)相關(guān)，提示該分子可作為臨床DDP治療效果的監(jiān)測指標(biāo)，此結(jié)果與Zhang等［9］利用免疫組化方法研究宮頸癌組織中MTSS1表達水平的結(jié)果相一致。MTSS1可能成為臨床檢測癌癥發(fā)展的指標(biāo)和癌癥治療效果的監(jiān)測指標(biāo)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，DDP可能通過下調(diào)MTSS1的表達水平及抑制ERK和AKT信號通路的激活而抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖與遷移。關(guān)于MTSS1與ERK和AKT信號通路間的具體調(diào)控機制及三者在癌癥發(fā)生發(fā)展及治療過程中的詳細(xì)分子機制仍需進一步探討。

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Corresponding authors：TONG Ying，E-mail：tongying7326@sina.com；ZHANG Yi，E-mail：zhangyi5643@163.com

（本文編輯：齊春會）

Cisplatin inhibites HeLa cell proliferation by suppressing activation of metastasis suppressor gene 1-extracellular signal-regulated kinase/serine-threonine kinase

ZHANG Si1，LIU Yuan-lin3，LI Xue3，ZHOU Xiang-dong2，ZHAO Yue4，ZHANG Ping-ping2，TONG Ying1，2，ZHANG Yi3
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，Medical School of Chinese PLA，Beijing 100853，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology，Air Force General Hospital，Beijing 100142，China；3.Department of Cell Biology，Institute of Basic MedicalSciences，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China；4.Baotou Jiuyuan District Hospital，Baotou 014060，China）

OBJECTlVE To study the molecular mechanism of cisplatin（DDP）by which HeLa cell growth and proliferation are inhibited.METHODS Cultured HeLa cells were treated with DDP 0.02-75 μmol·L-1for 24 or 48 h.CCK-8 assay was used to determine the cell proliferation.The wound scratch assay was used to detect the cell migration and invasion.Flow cytometry was used to detect the cell cycle arresting.q-PCR was used to test the expression of metastasis suppressor gene 1 （MTSS1）mRNA.Western blot was used to determine protein levels of MTSS1，phosphorylated-extra?cellular signal-regulated kinase（p-ERK）and phosphorylated-serine-threonine kinase（p-AKT）.RESULTS Following the treatment with DDP for 24 or 48 h，the proliferation of HeLa cells was inhibited significantly （P＜0.05），the value of the half inhibitory concentration（IC50）of cells was 4.14 and 11.82 μmol·L-1. Migration and invasion activity of HeLa cells were reduced according to the wound scratch assay（P＜0.05）.Flow cytometry results showed that the cell cycle was arrested at S phase.q-PCR results showed that MTSS1 mRNA expression changed with DDP in a concentration-dependent manner（r24 h=-0.965，P＜0.01；r48 h=-0.953，P＜0.01）.Western blot showed that the protein levels of MTSS1，p-ERK and p-AKT expression declined significantly with the increase in DDP concentrations（p-ERK：r24 h=-0.875，P＜0.01；r48 h=-0.966，P＜0.01.p-AKT：r24 h=-0.831，P＜0.01；r48 h=-0.863，P＜0.01.MTSS1：r24 h=-0.969，P＜0.01；r48 h=-0.988，P＜0.01）.CONCLUSlON DDP treatment inhibits HeLa growth and proliferation by interfering with the MTSS1 expression and disturbing the activation of ERK and AKT signaling pathways.

cisplatin；HeLa cells；extracellular signal-regulated kinase；serine-threonine kinase；metastasis suppressor gene 1

The project supported by National Natural Science Foundation of China（31070996）；and Air Force General Hospital Scientific Research Fund（kz2013011）

R979.1

A

1000-3002-（2016）04-0350-06

國家自然科學(xué)基金（31070996）；空軍總醫(yī)院科研基金課題（kz2013011）

張 思，女，碩士研究生，主要從事宮頸癌發(fā)病機制研究；童 英，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事婦科惡性腫瘤研究；張 毅，女，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事細(xì)胞生物學(xué)研究。

童 英，E-mail：tongying7326@sina.com；張 毅，E-mail：zhangyi5643@163.com

2015-11-18接受日期：2016-03-16）