芹菜素誘導膀胱癌5637細胞凋亡的機制研究

謝楊春 鄧永誠 田黎

【摘 要】 目的：研究芹菜素誘導人膀胱癌5637細胞凋亡的作用機制。方法：采用25～100μmol/L芹菜素處理膀胱癌5637細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況；采用Western blotting檢測細胞凋亡相關(guān)信號分子Bax、Bcl-2和PARP蛋白的表達水平。結(jié)果：芹菜素處理使細胞Bcl-2蛋白表達降低且呈濃度依賴性，并使Bax的表達增加和導致PARP蛋白發(fā)生切割且呈濃度依賴性。結(jié)論：芹菜素能夠抑制人膀胱癌5637細胞的增殖，誘導細胞凋亡，其機制可能與下調(diào)Bcl-2并上調(diào)Bax表達，導致Bcl-2/Bax比值下降，PARP活化有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 芹菜素；膀胱癌；細胞凋亡；機制

【中圖分類號】R285.5 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）14-0025-04

Abstract：Objective To study the mechanism of apigenin on the apoptosis of human bladder cancer cell line 5637. Methods 5637 cells were cultured with different concentrations of apigenin， and MTT assay was used to evaluate the cell inhibition rates. The expressions of apoptosis-related proteins Bax， Bcl-2 and PARP were analyzed by Western blotting. Results Apigenin causes concentration -dependent inhibition of the proliferation of bladder cancer 5637 cells. Western blotting demonstrated that apigenin increased the protein levels of Bax and PARP cleavage and reduced the protein expression of Bcl-2. Conclusion Apigenin can inhibit the proliferation and induce apoptosis of 5637 cells possibly by up-regulating the Bax expression， enhancing PARP cleavage， downregulating the Bcl-2 expression and resulting in the Bcl-2/Bax ratio decreased.

Keywords：Apigenin； Bladder cancer； Apoptosis； Mechanism

膀胱癌的全球發(fā)病率在全身惡性腫瘤中占第9位。而在我國，膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最高發(fā)的一種惡性腫瘤。臨床上根據(jù)分期可分為非肌層浸潤性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌[1]。其中非肌層浸潤性膀胱癌占發(fā)病率70%，其主要治療方法為經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)（transurethral resection of bladder tumor， TUR-Bt）加術(shù)后膀胱灌注化療，膀胱灌注化療常用藥物包括表柔比星、絲裂霉素、吡柔比星、阿霉素、羥基喜樹堿等[2]，雖經(jīng)過嚴格術(shù)后灌注方案，仍有20%左右的腫瘤患者術(shù)后仍會復發(fā)。而肌層浸潤性膀胱癌中有一部分患者的治療主要需采用以順鉑為主的化療方案[3]，順鉑的化療方案療效雖然敏感，但不能持久，患者5年生存率僅為20%～40%。而且，目前常用的化療藥物存在不同程度的全身或局部毒副反應，包括骨髓抑制、過敏反應以及膀胱刺激征等。這些方法雖然在一定程度上取得一定的療效，但是通常給患者帶來不可逆轉(zhuǎn)的系統(tǒng)毒性以及嚴重的膀胱局部刺激，例如出血性膀胱炎等[4]。因此，尋求無毒副作用且有效的膀胱癌治療藥物十分迫切。

芹菜素（5，7，4′-三羥基黃酮），是一種廣泛存在于果蔬中的一種黃酮類化合物，具有多種藥理活性[5-6]，其中以抗腫瘤活性研究較多。研究表明芹菜素在體外能夠顯著抑制多種類型的腫瘤細胞的生長增殖和誘導其凋亡，包括：人胃癌細胞[7]、人卵巢癌[8]、人結(jié)腸癌細胞[9]、人乳腺癌MDA-MB-231細胞[10]、人肝癌Hep G2細胞[11]、HeLa細胞[12]等，而其對膀胱癌細胞的作用機制研究鮮有報道。本實驗觀察了芹菜素對人膀胱癌5637細胞的生長抑制以及誘導凋亡作用，探討其促進細胞凋亡的作用機制。

1 實驗材料

1.1 試劑 芹菜素（質(zhì)量分數(shù)≥98%，批號：22806）購自阿拉丁公司；MTT，低熔點瓊脂糖、二甲基亞砜（DMSO），蛋白酶抑制劑購自Sigma；RPMI1640培養(yǎng)基，胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）均購自GIBCO公司；人抗兔Bax，Bcl-2，PARP抗體購自Santa Cruz，GAPDH抗體購自Abcam，BCA蛋白定量試劑盒和羊抗兔/鼠二抗購自Pierce；PVDF膜Millipore；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細胞株及細胞培養(yǎng) 人膀胱癌細胞株5637購自中國科學院上海細胞庫；培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37℃、5% CO2、95% O2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

2 實驗方法

2.1 MTT法檢測芹菜素對膀胱癌細胞5637增殖的影響 將5637細胞以3×103/孔接種于96孔板中，待細胞貼壁后每孔分別加入100μL不同濃度的芹菜素（25、50、75和100μmol/L），每個濃度設(shè)4個重復，同時設(shè)立空白對照組（加同體積的DMSO），細胞培養(yǎng)72h后，向每孔加入20μL 5.0 g/L的MTT后繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，向每孔中加入200μL DMSO溶解結(jié)晶紫，置于搖床振蕩30min，至藍紫色顆粒完全溶解后，于酶標儀490nm波長處測定每孔吸光度值（A），并計算細胞增殖率（%）=（藥物處理孔A值-空白孔A值）/（對照孔A值-空白孔A值）×100%。實驗重復3次。

2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 將5637細胞以2×106/孔接種于6孔板中，待細胞貼壁后分別加入不同濃度的芹菜素（50、75、100μmol/L），處理24h后收集細胞，并調(diào)整細胞數(shù)至1×106/mL，用預冷PBS 洗滌細胞2次，棄上清液。加入100μL染料結(jié)合緩沖液重懸后，加入10μL AnnexinV-FITC 染色，混勻后室溫避光靜置15min，然后加入200μL的染料結(jié)合緩沖液和5μL PI染液（50mg/L），靜置5min，立即進行流式細胞儀分析。

2.3 Western blotting檢測Bax、Bcl-2和PARP蛋白表達 將5637細胞以2×105/孔接種于6孔板中，以75、100μmol/L芹菜素作用細胞24h后，收集細胞，在每管細胞中加入100μL的蛋白裂解液后，BCA法進行總蛋白定量，每泳道上樣量為40μg總蛋白，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。一抗稀釋濃度分別為：Bax（1∶3000）、Bcl- 2（1∶2000）、PARP（1∶2000）、GAPDH（1∶10000）。羊抗兔/鼠二抗為1∶5000稀釋。ECL化學發(fā)光液，X光片暗室曝光、顯影及定影。采用WO-9413B型凝膠成像。實驗重復3次。

2.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，組間差異顯著性比較采用t檢驗，以P< 0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 芹菜素對5637細胞增殖的抑制作用 為了研究芹菜素對膀胱癌細胞增值的作用，采用不同濃度芹菜素（25、50、75和100μmol/L）處理膀胱癌5637細胞48 h后，采用MTT法檢測各個組細胞增值效率，研究結(jié)果顯示，不同濃度芹菜素處理的細胞的增殖均受到不同程度的抑制，與空白對照組相比具有顯著性差異（P< 0.05，圖1）。芹菜素對5637細胞增殖的抑制作用呈一定的濃度依賴性，采用不同濃度（25、50、75和100μmol/L）芹菜素處理后，隨著處理濃度的增加，其抑制效果更明顯。芹菜素對5637細胞的抑制呈現(xiàn)濃度依賴的特征。

3.2 Annexin V/PI 雙染法流式細胞儀檢測芹菜素誘導5637細胞的凋亡率為了研究芹菜素對膀胱癌細胞的誘導凋亡的作用，根據(jù)MTT實驗結(jié)果，采用不同濃度芹菜素（50、75和100μmol/L）處理膀胱癌5637細胞24 h后，采用Annexin V/PI 雙染法流式細胞儀檢測各個組細胞的凋亡效率，研究結(jié)果顯示（圖2和圖3），0、50、75和100 μmol/L芹菜素處理組細胞凋亡率分別為（2.3±0.8）%、（14.3±2.9）%、（20.0±5.9）%和（63.8±6.2）%，與對照組相比差異顯著（P<0.05）。隨著芹菜素處理濃度的增加，其誘導膀胱癌5637細胞凋亡效率效果更明顯，提示芹菜素對5637細胞的凋亡誘導效應具有劑量依賴性。

3.3 芹菜素對Bax、Bcl-2和PARP蛋白表達的影響 為了探討芹菜素對膀胱癌細胞的誘導凋亡的作用機制，采用不同濃度芹菜素（75和100 μmol/L）處理膀胱癌5637細胞24h后，采用Western-blotting檢測各個組細胞的凋亡相關(guān)蛋白的表達，研究結(jié)果顯示，75和100μmol/L芹菜素芹菜素處理5637細胞24h后，進行蛋白檢測。檢測結(jié)果表明，隨著濃度增加，Bax蛋白表達逐漸增加，PARP蛋白的切割水解亦逐漸增加，而Bcl-2蛋白表達逐漸降低，因此Bcl-2/Bax比值逐漸下降（圖4）。隨著芹菜素處理濃度的增加，膀胱癌5637細胞中，Bcl-2與剪切的PARP蛋白表達量逐漸降低，Bax蛋白表達量逐漸增高，結(jié)合以上實驗結(jié)果，提示芹菜素對5637細胞的凋亡可能是通過上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2蛋白表達，激活PARP的活性，從而誘導5637細胞的凋亡，并且這種誘導效應具有劑量依賴性。

4 討論

芹菜素是具有多種生物活性的黃酮類化合物，多項研究結(jié)果已經(jīng)證實， 芹菜素對體內(nèi)、外多種癌細胞具有殺傷作用， 其作用機制可能是通過對細胞凋亡的基因調(diào)控實現(xiàn)的，主要通過如Rb、p53及周期蛋白依賴性激酶抑制因子如p15、p16、p21等[13]。抗癌活性是芹菜素的主要活性之一， 細胞凋亡是基因調(diào)控細胞程序性死亡的過程， 凋亡異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。細胞凋亡敏感性主要取決于于多種凋亡相關(guān)基因表達產(chǎn)物的水平及相互作用， 存在著多種控制細胞凋亡的復雜的調(diào)控系統(tǒng)。

體內(nèi)腫瘤細胞生長主要是由于對機體正常調(diào)控機制的逃逸來實現(xiàn)的， 細胞正常的凋亡調(diào)控機制受到嚴格的控制。對多種腫瘤細胞株， 芹菜素以濃度及時間依賴性的方式誘導出現(xiàn)細胞皺縮、染色體凝集及DNA碎裂等特征性凋亡檢測標志。在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，細胞發(fā)生凋亡最早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，這一變化早于細胞皺縮、染色質(zhì)濃縮、DNA片斷化和細胞膜的通透性增加等凋亡現(xiàn)象。AnnexinV是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。因此AnnexinV被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。本研究采用Annexin-V熒光與PI雙染色技術(shù)在5637細胞中也獲得同樣結(jié)論。芹菜素能抑制人膀胱癌5637細胞生長， 誘發(fā)細胞凋亡。

Bcl-2和Bax基因家族在細胞凋亡過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[14]，Bcl-2和Bax蛋白之間的比例影響著細胞對各種凋亡誘導分子的敏感性，直接決定下游Caspases活化與否，從而決定凋亡是否發(fā)生。PARP正是Caspase的切割底物，切割過的PARP不能正常發(fā)揮功能，引起DNA的斷裂[15]。PARP切割降解是細胞凋亡的標志之一。通過Western blotting 檢測發(fā)現(xiàn)75、100μmol/L芹菜素處理后，PARP的切割增加，并且這種增加是濃度依賴性的。Bcl-2表達量多，細胞易于存活，而當Bax表達量過多時，容易形成Bax同源二聚體，導致細胞容易發(fā)生凋亡。通過Western blotting 檢測發(fā)現(xiàn)75、100 μmol/L芹菜素可降低Bcl-2蛋白的表達，同時增加Bax的表達，且隨著濃度的增加增加/抑制的效果更加明顯。實驗結(jié)果顯示芹菜素誘導膀胱癌5637細胞凋亡的機制可能與上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2的表達，導致Bcl-2/Bax比值下降，從而誘導細胞凋亡。

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（收稿日期：2016.05.03）