靶向葉酸受體的正電子分子探針研究進展

尹吉林，王　成，王欣璐

(1.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院 PET/CT中心，廣東 廣州　510010；2.上海交通大學 醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院 核醫(yī)學科，上?！?00127)

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靶向葉酸受體的正電子分子探針研究進展

尹吉林1，王成2，王欣璐1

(1.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院 PET/CT中心，廣東 廣州510010；2.上海交通大學 醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院 核醫(yī)學科，上海200127)

摘要：葉酸能與多種腫瘤細胞膜表面的葉酸受體(FR)特異性結(jié)合，通過FR介導的內(nèi)吞作用進入細胞，為放射性核素選擇性載帶提供良好的途徑。基于受體和配體間的高度親和性，可將多種放射性核素與葉酸分子及其衍生物偶聯(lián)，制備核醫(yī)學顯像探針。本文主要對非金屬正電子核素(18F、124I)和金屬正電子核素(68Ga、44Sc、152Tb)標記的葉酸及其衍生物PET顯像探針與炎癥PET顯像探針進行綜述，并展望其臨床前景。

關鍵詞：葉酸受體；分子探針；正電子發(fā)射計算機斷層掃描

葉酸受體(folate receptor, FR)是一種糖基磷脂酰肌醇偶聯(lián)蛋白，分為FR-α、FR-β、FR-γ和FR-δ四種。其中，F(xiàn)R-α和FR-β為肌醇磷脂酰聚糖(GPI)介導的膜蛋白，與葉酸及其衍生物具有高度的親和力，并通過內(nèi)吞作用實現(xiàn)內(nèi)在化[1]。FR-α在多種腫瘤表面高度表達，在惡性腫瘤，如卵巢癌、子宮癌、腦瘤、肺癌、腎癌、乳腺癌中，F(xiàn)R-α亞型表達率約為32%～90%[2-3]；但在正常組織中表達有限[3-4]。FR-β在激活的非靜息巨噬細胞中高度表達，如風濕性關節(jié)炎[5]。

葉酸(folic acid, FA)，由蝶酸(pteroic acid, PA)和谷氨酸(glutamic acid, GA)組成。FR主要識別FA中的PA部分，而GA殘基對受體和配體間的親和力影響不大[6]。FA與FRs結(jié)合后特異性高、飽和性好、親和力強、生物效應明顯，又因FA可化學修飾和高溫下穩(wěn)定，使FA成為近乎理想的靶向試劑，用于癌癥和炎癥疾病的顯像及治療。

正電子核素在發(fā)生湮滅輻射時能同時產(chǎn)生兩個能量相同、方向相反的γ光子，通過PET符合線路實現(xiàn)電子準直，提高圖像分辨率和靈敏度，因而在臨床上廣泛應用。本文主要對非金屬正電子核素(18F、124I)和金屬正電子核素(68Ga、44Sc、152Tb)標記的葉酸及其衍生物PET顯像探針與炎癥PET顯像探針的制備與臨床前生物學評價進行綜述，探討其用于臨床的可能性。

1　非金屬正電子核素標記

葉酸(folic acid, FA)結(jié)構(gòu)示于圖1。非金屬正電子核素(18F和124I)標記的葉酸分子探針廣泛用于臨床前研究[7]，分“GA法”與“PA法”兩種制備方法?！癎A法”：制備放射性標記輔基(prosthetic group, PG)后與FA分子的GA殘基連接，再通過有機化學反應與葉酸及其衍生物偶聯(lián)；“PA法”：通過正電子核素直接與FA分子中PA骨架上的基團進行取代?！癎A法”是制備放射性分子探針最常規(guī)的方法，通過改變Linker結(jié)構(gòu)和長度或選擇不同的化學合成方法實現(xiàn)多樣化制備，但放射合成過程繁雜、耗時長且難以實現(xiàn)自動化；“PA法”放射合成過程簡單、快速，能模塊化生產(chǎn)，但PA骨架為FR和配體的結(jié)合部位，可修飾位點少，結(jié)構(gòu)單一，僅可制備有限的正電子分子探針。

圖1　葉酸結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1　Structure of folic acid

1.1[18F]氟-葉酸PET分子探針

1.1.1GA法

圖2　分子探針1和2結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2　Structure of molecule probes 1 and 2

(1) [18F]-芐胺葉酸衍生物Bettio等[8]制備出PG-對[18F]氟芐胺后合成18F-葉酸分子探針1和2(圖2)。產(chǎn)品放化產(chǎn)率(radiochemical yield, RCY)達15%～44%，放射性比活度(specific activity, SA)為24 GBq/μmol。同分異構(gòu)體1和2比例為4∶1，1和2對細胞親和力相近，可不分離直接用于體內(nèi)顯像實驗。與[18F]FDG 小動物PET顯像對比，腫瘤中[18F]FDG放射性攝取缺失部位對1和2有高攝??；健康器官中肝臟和腎臟的放射性滯留最高。

(2) [18F]氟-苯和[18F]氟-吡啶碳酰肼-葉酸衍生物Jammaz等[9-10]用兩種方法合成了分子探針3和4(圖3)。方法一：合成4-[18F]氟苯碳酰肼和2-[18F]氟吡啶-4-碳酰肼兩種PGs，分別與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化的葉酸衍生物偶聯(lián)，制備18F標記的葉酸分子探針3和4，總合成時間45 min，RCY>80%；方法二：合成4-[18F]氟苯甲酸活化酯，通過PG與肼合γ葉酸衍生物反應制備[18F]氟-吡啶碳酰肼-葉酸分子探針，總合成時間85 min，RCY為35%。兩種氟標記的葉酸衍生物受體親和力相似，荷KB腫瘤小鼠體內(nèi)生物學分布實驗證實分子探針4較3在非靶組織中的放射性攝取低。

圖3　分子探針3、4、5、6結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 3　Structure of molecule probes 3, 4, 5 and 6

甲氨蝶呤通過還原葉酸載體介導的FR進入腫瘤細胞，用18F標記的PGs與抗葉酸甲氨蝶呤偶聯(lián)，制備甲氨蝶呤分子探針5和6(圖3)，細胞實驗顯示探針3和4較同種方法制備的甲氨蝶呤分子探針5和6親和力高兩倍，但腫瘤中攝取高六倍[10]。

(3) [18F]氟-三唑-葉酸衍生物2006年，Marik和Mindt等將點擊化學引入到放射性藥物標記合成中，開辟了放射性藥物標記的新方法[11-13]。Ross等[14]將6-[18F]氟己炔在高溫下經(jīng)Cu(I) 催化，與含有疊氮的葉酸衍生物γ-(4-疊氮丁基)-葉酸酰胺進行1,3偶極環(huán)加成反應，制備1,4-二取代的三唑基正電子探針7(圖4)，HPLC純化后[18F]氟-三唑-葉酸衍生物RCY達65%～80%。注射顯像劑45 min后KB腫瘤中放射性攝取為(3.13±0.83)%ID/g，膽汁和糞便中放射性濃聚較高，主要通過肝膽排泄；腎臟中放射性滯留明顯降低，經(jīng)點擊化學反應制備的分子探針7疏水性強于分子探針1和2；全身小動物PET顯像顯示膽囊、腸道、膀胱和腎臟放射性攝取高。

圖4　分子探針7結(jié)構(gòu)示意圖Fig.4　Structure of molecule probe 7

(4) [18F]氟-葡萄糖-葉酸衍生物為提高18F標記的葉酸分子探針的親水性，Jammaz等[15]合成[18F]FDG肟的衍生物，分別與葉酸和甲氨蝶呤衍生物偶聯(lián)，得到[18F]FDG作為PG的葉酸分子探針8和9(圖5)。60 ℃下反應10～15 min后經(jīng)過硅膠Sep-Pak分離，RCY>80%，SA>9 GBq/μmol，放化純度(radiochemical purities, RCP)>98%，總合成時間20 min。注射顯像劑60 min后，腫瘤、腎臟中放射性攝取分別為(3.32 ± 0.32)%ID/g與(1.49 ± 0.05)%ID/g，腫瘤與腎臟攝取比值高于分子探針3、4、5和6，可能是[18F]FDG的引入增加了葉酸衍生物分子的水溶性或葉酸衍生物分子探針進行修飾后整體帶負電。

Fischer等[16]通過點擊化學方法制備[18F]FDG三唑葉酸分子探針10(圖5)。合成疊氮功能化的[18F]FDG作為PG，在Cu(I)的催化作用下與含炔基修飾的葉酸衍生物在50 ℃下反應15 min，HPLC純化后RCY為5%～25%，RCP>95%，最大SA為1～3 GBq/μmol。探針10對KB細胞上FR的親和力與天然葉酸類似，其水溶性極強且在體外穩(wěn)定性較好。注射探針60 min后KB腫瘤中放射性攝取(10.03±1.12)%ID/g，F(xiàn)R陽性表達的器官和組織如腎臟中為(42.94±2.04)%ID/g，唾液腺中為(5.93±0.77)%ID/g；膽汁和糞便中的放射性濃集較分子探針1、2和7明顯降低，但在肝臟中攝取較其他顯像劑高。注射75 min后，KB腫瘤和腎臟中均有明顯的放射性濃集。葉酸分子探針用于顯像的最大缺陷是腎臟攝取高，降低了腫瘤/腎臟的攝取比。為降低腎臟中放射性攝取，F(xiàn)ischer等[17]將一個與血清蛋白具有微摩級親和力的功能基團引入葉酸分子中，通過增加血液循環(huán)時間提高腫瘤/腎臟攝取比。

圖5　分子探針8、9、10、11結(jié)構(gòu)示意圖Fig.5　Structure of molecule probes 8, 9, 10 and 11

通過點擊化學方法合成分子探針11(圖5)，衰減校正后RCY為1%～2%，RCP≥95%，SA為20～50 GBq/μmol。注射顯像劑1 h時，腎臟中放射性攝取約13%ID/g，比探針10在腎臟中的放射性攝取降低約4倍；4 h后腫瘤中放射性攝取約15%ID/g，腫瘤與腎臟放射性攝取比約為1。由于在血液中滯留時間延長，顯像過程中腫瘤與血液的放射性攝取比降低。

1.1.2PA法

為模塊化生產(chǎn)基于葉酸的18F放射性分子探針，Ross等[18]報道了新的“PA法”取代常規(guī)的“GA法”。對葉酸中的4-氨基苯甲?；?’位進行芳基取代，再通過18F直接親核取代制備分子探針12(圖6)。探針RCP>95%，衰減校正后RCY為4%，總合成時間80 min。注射顯像劑75 min后，荷KB腫瘤小鼠中腫瘤特異性攝取(9.37±1.76)%ID/g，腎臟中FR特異性攝取明顯。對天然葉酸結(jié)構(gòu)進行適當取代，通過“PA法”進行放射性標記制備葉酸衍生物示蹤劑用于腫瘤靶向顯像可行，但RCY較低。

圖6　分子探針12和13結(jié)構(gòu)示意圖Fig.6　Structure of molecule probes 12 and 13

為了克服在制備探針12過程中RCY低的缺陷，Betzel等[19]用吡啶環(huán)取代葉酸中的苯環(huán)，通過3’-氮雜環(huán)葉酸2’-吡啶環(huán)上的芳香族親核氟化反應提高RCY。160 ℃下反應10 min，18F取代原料中的氯；酸性條件、60 ℃下反應10 min進行脫保護。經(jīng)HPLC純化后得到RCY達3%～9%，RCP>98%，SA為127 GBq/μmol 的分子探針13(圖6)，總合成時間110 min。注射顯像劑30 min后，KB腫瘤中放射性攝取(11.70 ± 0.87)%ID/g，腎臟中放射性攝取在30～90 min內(nèi)為53%～58%ID/g，腫瘤與腎臟放射性攝取比約為0.2；注射探針13(29 MBq)2 h后，小動物PET/CT顯示腫瘤、腎臟、唾液腺和肝臟中放射性攝取均較明顯，可作為診斷FR陽性疾病組織顯像的有效工具。

1.2[124I]碘-葉酸PET顯像探針

124I具有較長的半衰期(4.2 d)，可標記小分子PET顯像劑用于定量藥理學和PET顯像研究。Jammaz等[20-21]用SIB碘標記方法制備124I 標記的葉酸分子探針14和15(圖7)， RCY分別為90%和60%，總合成時間約30～40 min，RCP均大于98%。正常鼠注射顯像劑3 h后，探針14在肝臟、腸道內(nèi)攝取分別為(5.94±2.01)%ID/g和(1.95±0.42)%ID/g，探針15攝取分別為(0.62±0.24)%ID/g和(0.32±0.06)%ID/g，由于氮原子的引入使水溶性增強，15在肝臟中的攝取較14低。KB荷瘤鼠注射分子探針15 1 h后，腎臟中攝取(1.47± 0.21)%ID/g明顯低于3和4，且3 h攝取達到最大(2.67±0.06)%ID/g，同時腫瘤與血液、腫瘤與肌肉、腫瘤與腸道放射性攝取比分別為15.47，65.75和5.68，表明分子探針15是潛在靶向FR陽性腫瘤PET顯像的有效工具。

圖7　分子探針14和15結(jié)構(gòu)示意圖Fig.7　Structure of molecule probes 14 and 15

2　金屬正電子核素標記

金屬放射性核素(如68Ga、44Sc和152Tb等)，通過葉酸或者葉酸衍生物偶聯(lián)雙功能螯合劑(bifunctional chelate agent, BFCA)中的配位基團進行絡合制備葉酸分子探針[7,22]。目前常用的BFCAs有去鐵胺、DOTA、DO3A和NODAGA(圖8)。

2.1[68Ga]鎵-葉酸PET顯像探針

2.1.1[68Ga]鎵-去鐵胺-葉酸衍生物Mathias等報道用67Ga標記葉酸衍生物制備67Ga-去鐵胺葉酸[23-24]。隨后，合成了相應的正電子核素66Ga和68Ga標記的去鐵胺葉酸[25]。在乙酰丙酮和乙醇的混合溶液中，去鐵胺葉酸衍生物和放射性鎵50 ℃下孵育15～30 min，得到SA為18 MBq/μg，RCY>97%的分子探針。注射天然葉酸和66Ga-去鐵胺葉酸標記物后，F(xiàn)R陽性表達的腫瘤和腎臟中，放射性攝取明顯降低。

圖8　DOTA衍生物和NODAGA衍生物結(jié)構(gòu)示意圖Fig.8　Structure of DOTA and NODAGA conjugates

圖9　標記前體16、17、18結(jié)構(gòu)示意圖Fig.9　Structure of labelling precursors 16, 17 and 18

2.1.2[68Ga]鎵-DOTA-葉酸衍生物和[68Ga]鎵-DO3A-蝶呤衍生物Fani等[26]用1,2-二氨基乙烷和聚乙二醇(PEG)作為linker的DOTA-葉酸衍生物16和17(圖9)進行金屬核素67/68Ga標記。67/68Ga-16、67/68Ga-17相對111In-DTPA-葉酸分子探針具有較高的腫瘤攝取和較長的腫瘤滯留時間[27]。注射顯像劑2 h后，67/68Ga-16、67/68Ga-17在腫瘤中攝取均為10%ID/g，在腎臟中攝取分別為(87.78±12.37)%ID/g與(98.43±15.40)%ID/g。腫瘤/腎臟攝取比在20 min～24 h內(nèi)保持在0.08～0.14之間。合成中省略FA中的GA部分，可以避免在化學合成和純化中出現(xiàn)α羧基偶聯(lián)和γ羧基偶聯(lián)而產(chǎn)生同分異構(gòu)，且有實驗證實FA中省略GA不影響FR的靶向效果[6,28]。Kühle等[29]用DO3A配體偶聯(lián)蝶呤衍生物18(圖9)，30 nmol標記前體在95 ℃、0.13 M 4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液(HEPES)中反應10 min，得到RCY為75%、脂水分配系數(shù)為-0.1±0.1的標記產(chǎn)物68Ga-18。當過量轉(zhuǎn)鐵蛋白存時，68Ga-18可在磷酸鹽緩沖液(PBS)中穩(wěn)定3 h以上。在蝶呤部分與顯像核素之間修飾一個合適的linker，F(xiàn)R靶向性將增強[30]。

2.1.3[68Ga]鎵-NODAGA-葉酸衍生物Fani等[31]合成的兩種NODAGA-葉酸衍生物19和20(圖10)，室溫下與68Ga在2 mL乙酸鹽緩沖溶液(pH=4.0)中反應10 min，得到SA為30 MBq/nmol，RCY>95%的68Ga-19和68Ga-20。阻斷實驗證實其均為FR特異性攝取，注射68Ga-19與68Ga-20 4 h后，KB腫瘤中的FR特異性攝取分別高達16%ID/g和15%ID/g，在腎臟中攝取最高，腫瘤與腎臟放射性攝取比小于0.18；肝臟中68Ga-20攝取(2.49±0.21)%ID/g高于68Ga-19攝取(1.07±0.18)%ID/g；小動物PET顯像顯示68Ga-19在膽囊和腸道內(nèi)的放射性濃集明顯降低。68Ga-19、68Ga-20比68Ga-16、68Ga-17的合成條件溫和，RCY高，且68Ga-19和68Ga-20可增加腫瘤與血液、腫瘤與肌肉、腫瘤與肝臟的攝取比。68Ga-19和68Ga-20的體內(nèi)分布數(shù)據(jù)證實，68Ga-19是更具潛在臨床應用價值的基于FR親和的腫瘤顯像劑。

圖10　標記前體19和20結(jié)構(gòu)示意圖Fig.10　Structure of labelling precursors 19 and 20

2.2[152Tb]鋱和[44Sc]鈧-葉酸PET顯像探針

Müller等[32]以靶向FR葉酸分子為模板，偶聯(lián)與血清蛋白具有μmol級親和力的功能基團，同時用點擊化學方法連接BFCA-DOTA制備標記前體21(圖11)。20 MBq的152Tb與15 nmol前體21在α羥基異丁酸溶液中反應15 min，得到RCY>96%的152Tb-21。盡管152Tb較18F和68Ga能量高，但注射～10 MBq152Tb-21后，小動物PET/CT掃描顯示腫瘤中152Tb-21攝取明顯(圖12)，腎臟中發(fā)現(xiàn)放射性濃集，腫瘤/腎臟攝取比值接近1。152Tb-21表現(xiàn)出高腫瘤與腎臟攝取比，應用前景較68Ga-16～68Ga-20更廣闊。

圖11　標記前體21結(jié)構(gòu)示意圖Fig.11　Structure of labelling precursor 21

Cristina等[33]用標記前體21與44Sc溶液在室溫下孵育15 min，得到SA為7 MBq/nmol，RCY>97%的44Sc-21。FR陽性表達的KB細胞攝取和內(nèi)在化實驗顯示該探針與FR特異性結(jié)合；注射44Sc-21 4 h后，小動物PET/CT顯像顯示：腫瘤、腎臟中存在明顯放射性濃集(圖12)，其他組織和器官中未發(fā)現(xiàn)放射性濃集；腫瘤與腎臟攝取比值與152Tb-21相近。

3　炎癥PET顯像

激活的巨噬細胞可作為炎癥部位靶向診斷的依據(jù)。Kularatne 等[34]利用FR-β在靜止或者靜息的活化巨噬細胞中表達存在差異，制備出PET分子探針22和68Ga-23(圖13)用于炎癥顯像研究。其 SA為分別(59.3±10.0) GBq/μmol與(11.0±4.6) GBq/μmol。嚙齒類動物的炎癥足模型研究發(fā)現(xiàn)22在炎癥和非炎癥部位標準攝取值(SUV)分別為0.78±0.08和0.37±0.06，68Ga-23 SUV分別為0.88±0.06和0.41±0.05，[18F]FDG SUV分別為2.61±0.56和0.37±0.08。分子探針22和68Ga-23敏感性優(yōu)于[18F]FDG，對炎癥顯像的同時對腫瘤攝取也高，可作為腫瘤顯像分子探針。

圖12　152Tb-21(a)和44Sc-21(b)小動物PET/CT顯像圖Fig.12　The micro-PET/CT of 152Tb-21(a)and 44Sc-21(b)

圖13　分子探針22和標記前體23結(jié)構(gòu)示意圖Fig.13　Structure of molecule probe 22 andlabelling precursor 23

4　展望

目前，已合成多種PET和SPECT葉酸顯像探針[35-36]，但只有111In-DTPA-folate和99mTc-EC20兩種示蹤劑用于臨床[37-38]。正電子核素標記的葉酸及其類似物尚屬臨床前研究階段，原因為：1) 臨床常用的正電子核素18F標記葉酸及其衍生物的條件苛刻，一般為多步反應；后處理需經(jīng)過HPLC分離純化，耗時較長；2) 常規(guī)生產(chǎn)的自動化合成模塊發(fā)展緩慢，限制了臨床應用。因此，發(fā)展一種簡便快捷的葉酸及其衍生物的18F標記方法尤為重要。近年來，隨著正電子核素標記技術(shù)的不斷發(fā)展，分子探針的放射性標記逐漸得到完善和發(fā)展。

FR-α受體不僅在多種類型的腫瘤表面高度表達，還與惡性腫瘤侵襲關系密切，成為用于葉酸衍生物的正電子放射性核素標記和成像關鍵靶點。基于葉酸衍生物的PET分子探針必將發(fā)展成為核醫(yī)學領域中的有效工具。

葉酸衍生物的分子探針還可用于靶向激活的巨噬細胞表面的FR-β炎癥疾病顯像。FA及其衍生物對FR-α和FR-β亞型的結(jié)合力類似，且這兩種受體亞型均在生物體中表達。因此，研究FR亞型與FA及其衍生物特異性結(jié)合關系，開發(fā)出腫瘤和炎癥特異性識別的正電子分子探針為重要發(fā)展方向。

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收稿日期：2016-01-28;修回日期：2016-03-14

基金項目：中國博士后科學基金(2013M532161)

作者簡介：尹吉林(1962—)，男，江西人，主任醫(yī)師，主要從事腫瘤核醫(yī)學與多模態(tài)分子探針制備研究 通信作者：王成，E-mail: wangch628@163.com

中圖分類號：TL92+3

文獻標志碼：A

文章編號：1000-7512(2016)03-0184-09

doi：10.7538/tws.2016.29.03.0184

PET Molecular Probes Targeting Folate Receptor

YIN Ji-lin1, WANG Cheng2, WANG Xin-lu1

(1.PET-CTCenter,GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,Guangzhou510010,China;2.DepartmentofNuclearMedicine,RenjiHospital,SchoolofMedicine,

ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200127,China)

Abstract:Folic acid can combine specifically with folate receptors (FRs) which are overexpressed on the epithelial cells of the tumor. The FRs are confirmed to be the tumor-associated antigens that bind folate and folate conjugates with very high affinity and shuttle these bound molecules inside cells via an endocytic mechanism．The FR-α is a target of critical value for nuclear imaging through using folate-based radiotracers as it is expressed on several tumor types. Moreover, employment of folate radiopharmaceuticals for imaging of inflammatory diseases by targeting at FR-β on activated macrophages holds promise as a further field of application. Based on these, more and more researches focus on folate conjugates labeled with radionuclides for nuclear medicine imaging (including single photon emission computed tomography (SPECT) and positron emission tomography (PET). These folate molecular probes are applied not only in cancer imaging but also in inflammation imaging. Hence, folate-based imaging agents may be useful for selection of patients who could profit from such new therapy concepts and for monitoring response to a particular treatment. This review was focused on the preparation and preclinical biological evaluation of the molecular probes which were labeled by positron nuclides (18F,124I,68Ga,44Sc,152Tb), and the clinical application of these molecular probes were discussed.

Key words：folate receptor; molecular probe; positron emission tomography