一株大麻雨露脫膠真菌的分離鑒定及其脫膠性能研究

楊慶麗,　劉宇峰,　夏尊民,　石　杰

黑龍江省科學(xué)院大慶分院, 黑龍江 大慶 163319

?

一株大麻雨露脫膠真菌的分離鑒定及其脫膠性能研究

楊慶麗,劉宇峰*,夏尊民,石杰

黑龍江省科學(xué)院大慶分院, 黑龍江 大慶 163319

從大麻根部土壤中分離一株能夠以大麻莖粉為唯一碳源生長(zhǎng)的真菌。經(jīng)18S rRNA鑒定此菌為鏈格孢屬。采用GB/T18147.2-2008和DNS法對(duì)大麻莖殘膠率及真菌果膠酶活性進(jìn)行分析。將此菌應(yīng)用于田間試驗(yàn)，對(duì)施用本菌的漚麻周期、大麻出麻率及纖維強(qiáng)度進(jìn)行研究。結(jié)果表明此菌具有產(chǎn)果膠酶活性但能力較低僅為150.5 U/mL，能夠降解膠質(zhì)釋放大麻纖維，田間雨露漚麻時(shí)施用本菌可以加快漚麻速度，出麻率及大麻纖維強(qiáng)度分別提高了1.73%和17.01%。應(yīng)用此菌漚麻可縮短漚麻周期，提高大麻出麻率及纖維質(zhì)量，具有較好的應(yīng)用前景。

大麻；雨露脫膠；真菌

大麻纖維性能優(yōu)異，具有衛(wèi)生耐用、抗菌防臭、吸汗透氣、防靜電及防紫外線(xiàn)等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于建筑、服裝、家紡等行業(yè)中，是一種綠色環(huán)保的纖維原料，有廣闊的應(yīng)用前景[1,2]。我國(guó)有悠久的大麻種植歷史，約占世界總產(chǎn)量的三分之一，居世界首位[3]。大麻種植的經(jīng)濟(jì)效益與纖維的質(zhì)量及產(chǎn)量直接相關(guān)。脫膠又是影響大麻纖維質(zhì)量和產(chǎn)量的決定性因素[4]。因此，脫膠好壞直接影響著大麻種植的經(jīng)濟(jì)效益。目前，最常用的大麻脫膠方法為天然雨露漚麻，此方法具有省時(shí)省力、經(jīng)濟(jì)環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，得到了廣泛的應(yīng)用。但是在實(shí)際應(yīng)用中也存在許多不足之處。首先，研究表明天然雨露漚麻中起降解作用的主要是生長(zhǎng)較慢的真菌[5]，天然接菌使得漚麻周期較長(zhǎng)，纖維降解菌等雜菌會(huì)共同生長(zhǎng)從而影響纖維質(zhì)量。其次，北方地區(qū)大麻收割期為8月末至9月初，氣溫較低不利于漚麻，若周期過(guò)長(zhǎng)則易出現(xiàn)漚麻不完全的問(wèn)題影響纖維產(chǎn)量。這說(shuō)明縮短漚麻周期對(duì)于提高大麻種植效益非常重要。本研究目的為篩選一株可應(yīng)用于大麻雨露脫膠的微生物，在田間實(shí)驗(yàn)中將此微生物直接接種到大麻莖上，并對(duì)漚麻周期、得麻率和纖維強(qiáng)力等進(jìn)行研究，以期解決大麻天然雨露脫膠中出現(xiàn)的問(wèn)題，為提高大麻纖維的質(zhì)量及產(chǎn)量提供幫助。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)土樣為大麻根部土壤，田間試驗(yàn)大麻品種為“火麻一號(hào)”，麻樣取自收割后的種子田。地點(diǎn)為黑龍江省科學(xué)院大慶分院肇州大慶種植基地。果膠購(gòu)自北京Kebio生物技術(shù)有限公司；半乳糖醛酸購(gòu)自Sigma公司；DNS試劑自配；其他試劑均采用國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

篩選培養(yǎng)基為大麻莖粉培養(yǎng)基(L)：大麻莖粉5 g，NH4NO31 g，NaCl 0.5 g，MgSO40.5 g，K2HPO41 g，F(xiàn)eSO40.01 g， pH 7.2[6]；分離、純化采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基；果膠培養(yǎng)基：以5 g果膠代替上述培養(yǎng)基中的大麻莖粉，其他無(wú)機(jī)成分相同；固體培養(yǎng)基中加入15 g瓊脂，121℃滅菌30 min。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1脫膠菌的分離純化取1 g土樣加入到100 mL大麻莖粉無(wú)機(jī)培養(yǎng)基中，設(shè)3個(gè)重復(fù)。28℃培養(yǎng)7 d后，取上清培養(yǎng)液1 mL接種到100 mL大麻莖粉無(wú)機(jī)培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)3代。培養(yǎng)液上清稀釋后涂布到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基平板上，根據(jù)菌絲形態(tài)及顏色的差異分別接種到馬鈴薯葡萄糖平板上繼續(xù)純化培養(yǎng)，純化后接種到馬鈴薯葡萄糖斜面上編號(hào)保藏。

1.3.2果膠降解圈試驗(yàn)將上述試驗(yàn)中純化的1株優(yōu)勢(shì)真菌接種于果膠固體平板上，28℃培養(yǎng)7 d，用1 g/L剛果紅溶液染色1 h，之后用1 mol/L NaCl溶液脫色1 h，脫色后放入4℃冰箱過(guò)夜，測(cè)量透明圈(H)及菌落(C)直徑。

1.3.3果膠酶活分析取上述優(yōu)勢(shì)真菌接種到100 mL果膠培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)7 d，重復(fù)3次培養(yǎng)后取培養(yǎng)液10 mL，4℃ 9 000 r/min離心30 min，上清即為粗酶液。DNS法測(cè)果膠酶活性，活力單位以U/mL表示，即：

其中U：酶活力單位(U/mL)；G：酶解液中還原糖含量(μg);N：粗酶液稀釋倍數(shù)；V：加粗酶液量(mL)；t：作用時(shí)間(min)。

1.3.4大麻莖殘膠率測(cè)定取肉眼無(wú)可見(jiàn)真菌生長(zhǎng)的大麻莖截成10cm左右小段，放入500mL三角瓶中，每瓶20根，滅菌。取優(yōu)勢(shì)真菌馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液1mL，與30mL滅菌蒸餾水充分混合，之后接種到裝有大麻莖的三角瓶中，搖晃三角瓶使菌接種到大麻莖上，設(shè)3個(gè)重復(fù)。以?xún)H加入同等體積滅菌蒸餾水為空白對(duì)照。室溫(約23℃)漚麻7d后采用GB/T18147.2-2008法測(cè)定殘膠率，感官法評(píng)定大麻木質(zhì)部與韌皮部的分離度。

1.3.5菌種鑒定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3.6田間試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組為先將優(yōu)勢(shì)真菌用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，之后與自來(lái)水按一定比例配合后噴施于收割后平鋪地面的大麻莖表面；對(duì)照組為僅噴施自來(lái)水。兩組試驗(yàn)條件完全相同。

2　結(jié)果與分析

2.1菌種分離篩選

天然雨露漚麻微生物主要來(lái)自于周?chē)h(huán)境，土壤是重要來(lái)源之一。本研究以大麻根際土壤為實(shí)驗(yàn)材料，以大麻莖粉為唯一碳源分離篩選大麻脫膠微生物。根據(jù)微生物在培養(yǎng)基平板上的不同形態(tài)及顏色，初篩共獲得微生物10株，其中真菌6株，細(xì)菌4株。初篩微生物包括大麻脫膠菌及耐受菌，需對(duì)其進(jìn)行大麻脫膠能力分析，才能獲得真正的大麻脫膠菌。由于樣本較多，本研究首先選取其中1株優(yōu)勢(shì)真菌Na-TTP(以下簡(jiǎn)稱(chēng)TTP)進(jìn)行下一步研究。

TTP為好養(yǎng)真菌，在大麻莖粉液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較快，菌體相互緊密結(jié)合成片狀飄浮于培養(yǎng)基表面。PDA平板上生長(zhǎng)迅速，25～28℃條件下培養(yǎng)7d菌落直徑達(dá)8cm左右。菌落呈絨毛狀，圓形等徑生長(zhǎng)，培養(yǎng)初期為灰白色，后逐漸呈現(xiàn)深褐色，表面有水滴，菌落形態(tài)見(jiàn)圖1(彩圖見(jiàn)圖版一)。

2.2菌種分子生物鑒定

經(jīng)生工生物(上海)股份有限公司鑒定，真菌TTP18SrRNA片段全長(zhǎng)1 311bp。通過(guò)NCBI中BLAST比對(duì)獲得相似性最高的前10個(gè)序列，以MAGE6軟件分析TTP系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖可見(jiàn)，Na-TTP與鏈格孢AltB相似度達(dá)100%，與鏈格孢B13，HDJZ-ZWM-06相似度為99.9%，其他均為99.5%以上，結(jié)合菌落形態(tài)分析鑒定TTP為鏈格孢屬(Alternariasp.)。

圖1　大麻脫膠真菌 TTPFig.1　Hemp degumming fungus TTP.(彩圖見(jiàn)圖版一)

圖2　TTP與相似菌株的18S rDNA聚類(lèi)分析圖Fig.2　Clustering analysis of 18S rDNA of TTP and related fungus.

2.3脫膠能力初步研究

果膠是大麻膠質(zhì)的主要組成成分，微生物果膠降解能力的高低是其大麻脫膠能力的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)之一。因此，產(chǎn)果膠酶活性是大麻脫膠菌的篩選的重要指標(biāo)。本研究采用果膠透明圈法及DNS法對(duì)TTP產(chǎn)果膠酶活性進(jìn)行分析。透明圈法是指TTP如果能夠產(chǎn)生果膠酶，菌落周?chē)墓z被其降解，使得剛果紅無(wú)法染色而形成透明圈，未被降解的平板則被染上紅色。產(chǎn)酶能力越強(qiáng)果膠降解越多，透明圈越向外擴(kuò)展。圖3(彩圖見(jiàn)圖版一)可見(jiàn)TTP可以形成果膠透明圈。表1中，TTP透明圈直徑為2.77 cm，菌落大小為2.27 cm，透明圈與菌落直徑的比值 HC 為1.22。培養(yǎng)7 d，TTP果膠酶活性為150.5 U/mL。以上可見(jiàn)，此菌產(chǎn)果膠酶活性不高。大麻莖接種TTP漚麻7 d后，木質(zhì)部與韌皮部分離較好，殘膠率低于對(duì)照組6.39%。表明真菌TTP具有較好大麻脫膠能力。此菌果膠酶活低又具有較高脫膠能力的原因，可能是由于大麻膠質(zhì)是極為復(fù)雜的復(fù)合物，脫膠的好壞并不一定完全取決于果膠的降解能力。

圖3　真菌TTP果膠降解圈Fig.3　Pectin degradation circle of TTP.(彩圖見(jiàn)圖版一)

降解圈(H/C)果膠酶活(U)分離度殘膠率(%)對(duì)照組(CK)--差29.37真菌組(TTP)1.22150.5好22.98

2.4田間試驗(yàn)

雨露脫膠是指大麻收割后平鋪于地面，經(jīng)雨露浸潤(rùn)微生物生長(zhǎng)而天然脫膠的一種漚麻方法。此法受環(huán)境因素影響極大。另外，獲得脫膠微生物的最終目的是進(jìn)行田間應(yīng)用，以提高大麻的種植效益。因此，僅通過(guò)室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)無(wú)法真正確定TTP的脫膠能力。本研究通過(guò)田間實(shí)驗(yàn)，將此菌人工接種到新收割的大麻莖上，分析此菌對(duì)漚麻周期、得麻率及纖維強(qiáng)力的影響，進(jìn)一步確定TTP的脫膠性能。

表2可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比大麻天然漚麻周期縮短了23.07%，出麻率及纖維強(qiáng)度分別提高1.73%及17.01%。表明此菌可以提高大麻纖維的質(zhì)量和產(chǎn)量,有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

表2　田間試驗(yàn)結(jié)果

3　討論

隨著國(guó)家對(duì)環(huán)境保護(hù)力度的加強(qiáng)，能耗高、污染大的溫水漚麻逐漸被能耗低、污染小的雨露漚麻所取代，雨露漚麻中的關(guān)鍵階段為微生物脫膠。因此，針對(duì)大麻脫膠微生物的相關(guān)研究也得到了越來(lái)越多的重視。如汪學(xué)軍等[7]從大麻莖中分離出一株脫膠內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定與點(diǎn)霉屬(Phomasp.)相似度高達(dá)99%。譚曉明[8]篩選出一株有高果膠酶活及低纖維素酶活的大麻脫膠芽孢桿菌(Bacillussp.)。杜格列夫和赫娃道夫斯基研究表明，鏈格孢(Alternariasp.)是西伯利亞雨露漚麻微生物區(qū)系中最重要的組成成分之一[9]。

本研究分離的大麻脫膠菌TTP經(jīng)鑒定為鏈格孢屬，是全球分布最廣，有重要經(jīng)濟(jì)作用的無(wú)性型真菌，具有廣泛的植物宿主[10]。結(jié)果表明TTP能夠降解大麻莖膠質(zhì)，促進(jìn)木質(zhì)部與韌皮部的分離，在縮短漚麻周期的同時(shí)，能有效提高大麻纖維的產(chǎn)量及質(zhì)量，是一株有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的真菌。此研究中也存在一些相關(guān)問(wèn)題，由于試驗(yàn)進(jìn)度的原因，本次研究中應(yīng)用的大麻莖取自收獲后的種子田，使得對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組出麻率及纖維強(qiáng)力均偏低；另外，由于氣溫較低漚麻周期總體較長(zhǎng)。因此，本研究下一步的工作重點(diǎn)是進(jìn)行大麻纖維田的田間試驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

[1]于文杰，王貴賓，韓 潔,等. 大麻脫膠功能菌株在漚麻中的應(yīng)用[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 51(21): 4772-4775.

[2]Arnaud L, Gourlay E. Experimental study of parameters influencing mechanical properties of hemp concretes[J]. Construct. Build. Materials, 2012, 28(1): 50-56.

[3]Alaru M, Kukk L, Olt J,etal.. Lignin content and briquette quality of different fibre hemp plant types and energy sunflower[J]. Field Crops Res., 2011, 124(3): 332-339.

[4]彭源德，嚴(yán) 理，唐守偉,等. 亞大麻快速生物脫膠過(guò)程中發(fā)酵液成分變化[J]. 紡織學(xué)報(bào), 2009, 30(3): 48-52.

[5]汪學(xué)軍，閔長(zhǎng)莉，楊 艷,等. 大麻微生物脫膠特異放線(xiàn)菌菌株的篩選與鑒定[J]. 紡織學(xué)報(bào), 2014, 35(11): 102-106.

[6]董政娥，丁若垚，鄭 磊,等. 亞麻粗紗堿性脫膠菌株的篩選鑒定及脫膠效果[J]. 印染助劑, 2013, 30(10): 16-19.

[7]汪學(xué)軍，閔長(zhǎng)莉，殷志超. 一株具有脫膠功能大麻內(nèi)生真菌的分離和鑒定[J].西北植物學(xué)報(bào), 2014, 34(3): 623-627.

[8]譚曉明. 大麻微生物脫膠菌種選育及脫膠工藝研究[D]. 濟(jì)南: 山東大學(xué), 碩士學(xué)位論文, 2010.

[9]王貴賓. 大麻脫膠功能菌株的選育及在漚麻中的應(yīng)用[D]. 哈爾濱: 黑龍江大學(xué),碩士學(xué)位論文, 2009.

[10]冉俊祥，肖杰文，楊占臣,等. 美國(guó)大豆中鏈格孢的分離鑒定研究[J]. 植物檢測(cè), 2011，25(3): 17-22.

Isolation, Identification and Retting Ability of a Hemp Dew-retting Fungus

YANG Qing-li, LIU Yu-feng*, XIA Zun-min, SHI Jie

DaqingBranchofHeilongjiangAcademyofSciences,HeilongjiangDaqing163319,China

A dew-retting fungus with hemp stalk powder as the sole carbon source was isolated from hemp root soil. The fungus was determined to beAlternariasp. through 18S rRNA analysis. GB/T18147.2-2008 and the DNS methods were used to analyze its pectin enzyme activity and the hemp stem gum content. Fibre percentage, strength and retting time were researched after field application. Results showed pectin enzyme activity of the fungus was only 150.5 U/mL, the fungus could degrade pectin and release the hemp fiber, and speedup dew-retting. Fibre percentage and strength were 1.73% and 17.01% higher than CK. The fungus could shorten the retting period, improve the rate of hemp hemp and fiber quality, which has bright application prospects in the future.

hemp; dew-retting; fungus

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.04.07

2016-03-23; 接受日期：2016-05-17

黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(GC13B209)資助。

楊慶麗，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸?。E-mail:qingliqingli@126.com。*通信作者：劉宇峰，研究員，研究方向?yàn)槲⑸?。E-mail: 384751172@qq.com