小青龍湯對慢性腎炎寒飲蘊肺證大鼠模型的藥效學(xué)研究

王　浩，李澤庚，黃平富，童佳兵，趙志奮，楊　程

(1. 滁州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，安徽 滁州　239000；2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥　230012；3. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥　230031)

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·實驗研究·

小青龍湯對慢性腎炎寒飲蘊肺證大鼠模型的藥效學(xué)研究

王浩1，李澤庚2，黃平富1，童佳兵3，趙志奮1，楊程3

(1. 滁州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，安徽 滁州239000；2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥230012；3. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥230031)

[摘要]目的觀察小青龍湯對慢性腎炎寒飲蘊肺證大鼠相關(guān)實驗室指標的影響。方法將60只Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組和小青龍湯組，每組20只。采用強迫大鼠在冷水中疲勞游泳和腹腔注射小牛血清白蛋白的方式復(fù)制慢性腎炎寒飲蘊肺證模型。觀察3組大鼠一般情況；實驗第6、7、8周時連續(xù)檢測24 h尿蛋白；實驗第8周時，檢測尿表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、血清肌酐(serum creatinine, SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、血清白蛋白(albumin, ALB)、血清總膽固醇(total cholesterol, TC)水平；光鏡下觀察大鼠腎組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果小青龍湯可改善模型大鼠的一般狀況。實驗第6、7、8周時，小青龍湯可明顯降低模型大鼠升高的24 h尿蛋白含量(P<0.05)；實驗第8周時，小青龍湯可明顯降低模型大鼠升高的尿EGF、SCr、BUN和血清TC水平(P<0.05)，明顯升高模型大鼠降低的血清ALB水平。光鏡下顯示，小青龍湯可防止腎小球體積增大和系膜細胞增多，防止腎小管上皮細胞腫脹。結(jié)論小青龍湯具有降低慢性腎炎寒飲蘊肺證大鼠尿蛋白水平，保護腎功能和防止腎組織病理變化的作用。

[關(guān)鍵詞]慢性腎炎；宣肺利水法；小青龍湯

慢性腎小球腎炎簡稱慢性腎炎，臨床多以蛋白尿、水腫、腎功能不全為特征。肺主宣發(fā)，水液隨其鼓舞而上行頭面，外達肌腠；肺主肅降，水液在其約束而下注腎與膀胱；肺通過宣發(fā)和肅降功能來推動和調(diào)節(jié)全身水液的輸布和代謝。這是宣肺利水法治療慢性腎炎的中醫(yī)整體觀念、“病在下，治其上”治療原則的體現(xiàn)。本研究通過復(fù)制病證結(jié)合的動物模型，運用具有宣肺利水作用的小青龍湯干預(yù)慢性腎炎模型大鼠，并觀察主要藥效學(xué)指標的變化，為小青龍湯防治慢性腎炎提供實驗依據(jù)。

1　材料

1.1實驗動物清潔級健康雄性Wistar大鼠60只，生產(chǎn)許可證號為SCXK(皖)2011-002，體質(zhì)量250～300 g，由安徽省實驗動物中心提供。將其隨機分為正常組、模型組與小青龍湯組3組，每組20只。動物飼養(yǎng)室為清潔級，于獨立送風(fēng)隔離籠具(康為IR60)飼養(yǎng)，籠內(nèi)溫度控制在(20±1)℃，相對濕度60%。自然光照，塑料籠內(nèi)以消毒木屑為墊料，食水自取。

1.2主要試劑與藥物

1.2.1試劑2%戊巴比妥；弗氏不完全佐劑：美國Sigma公司，批號 F5506；小牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)：購自博世德生物制品有限責(zé)任公司，批號為PR0025-3；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)：購自北京朋利馳科技有限公司，批號為10010-023)。

1.2.2藥物小青龍湯(麻黃、半夏、白芍各9 g，炙甘草、桂枝各6 g，干姜、細辛、五味子各3 g)：由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，配成濃度為0.056 g/mL的溶液。

1.3主要儀器動物強迫游泳裝置：安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院研制；RM2135型石蠟切片機：斯沃德儀器設(shè)備有限公司；EG1160型包埋機：上海儀器有限公司；QP-B型切片漂烘溫控儀：安徽電力科學(xué)研究所；CX41-12C02型光學(xué)顯微鏡：日本OLYMPUS；HH-W21-600型37 ℃電熱恒溫水溫箱：上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠；A1830208型自動勻漿機：上海艾測電子科技有限公司。

2　方法

2.1慢性腎炎寒飲蘊肺證模型的復(fù)制將大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，第2周開始，參照楊麗平等[1]、孫廣仁等[2]的方法，將大鼠在5 ℃左右水中每天游泳30 min，使其勞累，再將大鼠置于獨立送風(fēng)隔離籠具，保持籠內(nèi)溫度為(5±1)℃，相對濕度為60%，使其感受寒邪，共3周，復(fù)制“寒飲蘊肺證”模型。從第5周開始，對大鼠進行預(yù)免疫，每周3次，即取BSA 100 mg溶于1% PBS溶液3.75 mL中，加弗氏不完全佐劑，混勻成30 mL混懸液，超聲乳化，在大鼠兩腹股溝、兩前足跖，共4點做皮下注射，每點0.05 mL，同時腹腔注射0.2 mL，正常組用生理鹽水與弗氏不完全佐劑按相同比例乳化行皮下注射。第6周對大鼠進行正式免疫，在大鼠腹股溝皮下注射0.05 mL BSA混懸液，隔日1次，共2周。預(yù)免疫和正式免疫用于復(fù)制慢性腎炎模型。

2.2給藥方法 從第6周開始，小青龍湯組大鼠每日接受小青龍湯10 mL/kg(相當(dāng)成人臨床用量)灌胃，正常組與模型組大鼠接受2.5 mL等容量生理鹽水灌胃，共2周。

2.3指標觀察方法

2.3.1一般情況觀察觀察大鼠飲食量、飲水量和運動情況，以及毛色有無光澤，尿道口是否紅腫，皮下有沒有水腫，眼瞼是否浮腫。

2.3.224 h尿蛋白及尿表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)檢測各組分別在第6周、第7周及第8周用代謝籠收集24 h尿液，用濁度法定量測24 h尿蛋白，用放射免疫法測定尿液中EGF水平。

2.3.3血生化指標檢測用多功能全生化分析儀測定血清肌酐(serum creatinine, SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、血清白蛋白(albumin, ALB)、血清總膽固醇(total cholesterol, TC)。至第8周時，按1 mL/kg劑量對大鼠腹腔注射2%戊巴比妥，將大鼠麻醉后，從腹主動脈取血，室溫放置2 h后，3 000 r/min離心20 min，取上清液，待用。

2.3.4腎組織形態(tài)學(xué)觀察腹主動脈采血后，將大鼠處死，取腎組織，置于4%多聚甲醛中固定，8 h后依次進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(6 μm)，作蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，OLYMPUS顯微鏡觀察HE染色切片并攝片。

3　結(jié)果

3.1一般狀況觀察在模型復(fù)制和灌胃過程中，正常組也進行了干預(yù)，死亡4只；模型組與小青龍湯組分別死亡6只和8只。從剩余大鼠中隨機取10只進行試驗。與正常組比較，模型組大鼠飲食量、飲水量減少且活動緩慢，毛色欠光澤，尿道口有紅腫，皮下輕度水腫，眼瞼可見浮腫。小青龍湯組與正常組一般情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3.23組大鼠24 h尿蛋白、尿EGF水平比較兩因素混合設(shè)計的不等距重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果顯示，被試內(nèi)因素(時間)和被試間因素(組別)對慢性腎炎大鼠24 h尿蛋白水平的主效應(yīng)具有統(tǒng)計學(xué)意義(被試內(nèi)因素：F(3，81)=503.12，P=0.000；被試間因素：F(2，27)=3 206.78，P=0.000)，兩者的交互作用也具有統(tǒng)計學(xué)意義(F(6，81)=491.45，P=0.000)。簡單效應(yīng)分析結(jié)果顯示，給藥前3組尿蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；實驗第6、7、8周，模型組大鼠24 h尿蛋白水平顯著高于正常組和小青龍湯組(P<0.05)；模型組大鼠各時點24 h尿蛋白水平比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；正常組大鼠各時點24 h尿蛋白水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與正常組比較，模型組尿EGF水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，小青龍湯組尿EGF水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1　3組大鼠24 h尿蛋白和尿EGF水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3.33組血生化指標測定與正常組比較，模型組SCr、TC和BUN水平顯著升高(P<0.05)，ALB含量顯著下降(P<0.05)。與模型組比較，小青龍湯組血清TC和BUN水平顯著降低(P<0.05)，ALB顯著升高(P<0.05)。見表2。

3.43組大鼠腎組織的形態(tài)學(xué)觀察HE染色結(jié)果如圖1所示，正常組大鼠腎臟組織中腎小球、腎小管基本結(jié)構(gòu)和形態(tài)均未見異常。與正常組比較，模型組大鼠腎組織均發(fā)生不同程度的病理變化，模型組大鼠腎小球體積均有不同程度的增大，系膜細胞有不同程度的增多，腎小管上皮細胞有不同程度的腫脹，局部腎小管近曲小管上皮細胞未見刷狀緣；但未見腎間質(zhì)纖維化。小青龍湯干預(yù)后腎小球體積稍增大，系膜細胞少量增多。局部腎小管近曲小管上皮細胞刷狀緣未見明顯異常。

表2　 3組大鼠SCr、BUN、ALB和TC水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

圖1　 各組大鼠腎小球和腎小管的形態(tài)學(xué)觀察(HE染色，10×40倍)

4　討論

以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，參照西醫(yī)經(jīng)典的模型復(fù)制方法，讓大鼠感受風(fēng)、寒、濕邪，邪乘虛入里，內(nèi)擾脾腎之陽，致脾失健運、腎失開闔、氣機阻滯、水濕內(nèi)停，從而出現(xiàn)下肢及全身浮腫，即為溢飲。本研究利用BSA可以提高等電點，通過腎小球基底膜表面負電荷屏障種植于基底膜上的特點，復(fù)制原位免疫復(fù)合物性腎炎，其發(fā)病機制及病理改變均類似于人類膜性腎病[3]。與正常組比較，模型組在實驗第6、7、8周時24 h尿蛋白顯著升高(P<0.05)，呈現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿，提示腎臟發(fā)生了病變。且模型組ALB含量較正常組顯著降低(P<0.05)。EGF含量可作為判斷慢性腎炎腎組織損傷和纖維化的指標之一[4]，模型組尿EGF水平顯著高于正常組(P<0.05)，SCr水平變化主要由腎小球的濾過能力來決定[5]。SCr水平高出正常值多提示腎臟受損，腎功能不全時，SCr在體內(nèi)蓄積成為對人體有害的毒素。與SCr一樣，在腎功能損害早期，BUN可在正常范圍。當(dāng)腎小球濾過率下降到正常值的50%以下時，BUN濃度才迅速升高[6-7]。本研究表明，與正常組比較，模型組SCr和BUN水平均顯著升高(P<0.05)，且腎小球、腎小管也發(fā)生病理性改變；同時，模型組TC濃度也顯著升高(P<0.05)。以上結(jié)果提示大鼠出現(xiàn)了類似慢性腎炎寒飲蘊肺證的變化。

肺金為腎水之母，子之病可從母治之。肺主通調(diào)水道，為水之上源。水液的輸布代謝有賴于肺的宣降，肺主宣發(fā)，水液隨其鼓舞而上行頭面，外達肌腠；肺主肅降，水液在其約束而下注腎與膀胱[8]。肺失治節(jié)，津液不能宣發(fā)從汗而解，亦不能肅降氣化為尿液。氣機失調(diào)，精微不升則發(fā)生蛋白尿或血尿。大鼠在冷水中游泳，勞則氣耗，肺氣虧虛，衛(wèi)外功能減弱，易感受寒邪或寒邪直中少陰，腎陽受損，溫煦功能降低[9]。慢性腎炎屬于中醫(yī)“痰飲”“水腫”范疇，其治療以發(fā)汗、利尿為原則。《金匱要略》曰：“諸有水者，腰以下腫，當(dāng)利小便，腰以上腫，當(dāng)發(fā)汗乃愈?！薄安√碉嬚?，當(dāng)以溫藥和之?！奔丛谥委熖碉嫴r，應(yīng)注意選用溫性藥物[10]?！安∫顼嬚撸?dāng)發(fā)其汗，大青龍湯主之，小青龍湯亦主之”(《金匱要略》)。大青龍湯主治外感風(fēng)寒兼有里熱，然小青龍湯為外有風(fēng)寒內(nèi)有水飲而設(shè)，結(jié)合治療痰飲的法則，故適宜選用小青龍湯。其中麻黃與桂枝相須為君，麻黃得桂枝相助，發(fā)汗散寒解表邪，同時桂枝溫陽化氣，與麻黃協(xié)同作用，加強利尿之功。細辛與干姜辛溫，為臣藥，助麻黃、桂枝解表，能溫腎而行水?！端貑枴げ貧夥〞r論》曰：“腎苦燥，急食辛以潤之，開腠理，致津液，通氣也?！奔毿劣譃樯訇幠I經(jīng)表藥[11]。辛溫發(fā)散恐耗散肺氣，故佐以酸寒之芍藥和酸溫之五味子以收之?！端貑枴げ貧夥〞r論》曰：“肺欲收，急食酸以收之?！卑胂男翜兀苁漳鏆舛⑺?，為使藥。炙甘草可益氣和中，又可調(diào)和辛散酸收之品，為佐使之藥。

與模型組比較，小青龍湯組在實驗第6、7、8周時尿蛋白均明顯降低(P<0.05)；實驗第8周時，小青龍湯組尿EGF明顯降低(P<0.05)，SCr、BUN和血清TC含量也顯著下降(P<0.05)，血清ALB含量明顯上升(P<0.05)，腎小管和腎小球病理變化均明顯改善。結(jié)果提示小青龍湯對慢性腎炎寒飲蘊肺證具有較好的療效。

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基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(81001520)

作者簡介：王浩(1986-)，男，醫(yī)師

通信作者：李澤庚，li6609@126.com

[中圖分類號]R692.3；R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.04.018

(收稿日期：2015-12-13；編輯：姚實林)

Pharmacodynamics of Xiaoqinglong Decoction in Rat Model of Chronic Nephritis with Syndrome of Cold Fluid Retention in Lung

WANGHao1,LIZe-geng2,HUANGPing-fu1,TONGJia-bing3,ZHAOZhi-fen1,YANGCheng3

(1.ChuzhouIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicalHospital,AnhuiChuzhou239000,China; 2.AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 3.TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China)

[Abstract]Objective To investigate the effect of Xiaoqinglong Decoction on related experimental indexes in rats with chronic nephritis with the syndrome of cold fluid retention in lung. MethodsA total of 60 Wistar rats were randomly divided into normal group, model group, and Xiaoqinglong Decoction group, with 20 rats in each group. The rats were forced to swim to fatigue in cold water and were given intraperitoneal injection of bovine serum albumin to establish the model of chronic nephritis with the syndrome of cold fluid retention in lung. The rats’ general status was observed. At weeks 6, 7, and 8 of the experiment, 24-h urinary protein excretion was measured continuously; at week 8 of the experiment, the levels of urinary epidermal growth factor (EGF), serum creatinine (SCr), blood urea nitrogen (BUN), serum albumin (Alb), serum total cholesterol (TC) were measured. The morphological changes in renal tissue were observed under a light microscope. ResultsXiaoqinglong Decoction improved the rats’ general status. At weeks 6, 7, and 8 of the experiment, the Xiaoqinglong Decoction group showed a significant reduction in the elevated 24-h urinary protein excretion (P<0.05); at week 8 of the experiment, the Xiaoqinglong Decoction group showed significant reductions in the elevated levels of urinary EGF, SCr, BUN, and serum TC (P<0.05), as well as a significant increase in the reduced serum ALb level. As was shown by the light microscope, Xiaoqinglong Decoction prevented the increases in the glomerular volume and the number of mesangial cells, as well as the swelling of renal tubular epithelial cells. ConclusionIn rats with chronic nephritis with the syndrome of cold fluid retention in lung, Xiaoqinglong Decoction can reduce the level of urinary protein, protect renal function, and prevent renal histopathological changes.

[Key words]Chronic nephritis; Method of freeing lung-qi and eliminating damp; Xiaoqinglong Decoction