五羥色胺對(duì)體外培養(yǎng)山羊黃體細(xì)胞增殖的影響

楊　煥，張　華，陳　炯，范艷樂，馬菊紅，李國紅，雷琦敬，殷玉鵬，趙善廷， 陳樹林*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.萊商銀行，山東萊蕪 271100)

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五羥色胺對(duì)體外培養(yǎng)山羊黃體細(xì)胞增殖的影響

楊煥1，張華2，陳炯1，范艷樂1，馬菊紅1，李國紅1，雷琦敬1，殷玉鵬1，趙善廷1， 陳樹林1*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.萊商銀行，山東萊蕪 271100)

摘要：為了探討5-羥色胺(5-HT)與山羊黃體細(xì)胞的生長是否存在密切的關(guān)聯(lián)性，揭示其在黃體發(fā)育中的生物學(xué)作用，采用膠原酶Ⅱ消化法獲得原代山羊黃體細(xì)胞并用催產(chǎn)素(OT)染色對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定不同濃度5-HT對(duì)山羊黃體細(xì)胞的影響，免疫組織化學(xué)染色法(SP法)檢測(cè)山羊黃體細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白的表達(dá)。MTT法結(jié)果顯示，5-HT對(duì)山羊黃體細(xì)胞的增殖起到促進(jìn)作用，促增殖的濃度范圍在10-8mol/L～10-4mol/L，濃度越高，促增殖作用越明顯。免疫組織化學(xué)染色法證實(shí)，5-HT能夠使山羊黃體細(xì)胞中PCNA蛋白的表達(dá)增多。結(jié)果提示，5-HT可能是通過促進(jìn)PCNA蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對(duì)山羊黃體細(xì)胞的促增殖作用。5-HT在黃體發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮的重要作用及相關(guān)分子機(jī)制的初步揭示都為生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：山羊黃體細(xì)胞；5-羥色胺；細(xì)胞增殖；增殖細(xì)胞核抗原

五羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)是一種吲哚衍生物，由色氨酸轉(zhuǎn)化而來，分子式為C10H12N2O。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，松果體、下丘腦和中腦附近會(huì)產(chǎn)生大量5-HT[1]；分布于消化道內(nèi)的嗜鉻細(xì)胞主要負(fù)責(zé)5-HT的合成，此外部分肥大細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生少量游離的5-HT[2-3]。作為內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)，它與體溫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛疼痛、性活動(dòng)、焦慮睡眠以及精神疾病等相關(guān)，借助信號(hào)激活傳遞、神經(jīng)功能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[4-7]。

黃體形成于哺乳動(dòng)物排卵后，由2種不同類型的細(xì)胞分化而成，以分泌孕酮為主，也分泌少量雌激素[8]，通過調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的變化來適應(yīng)受精卵的著床和妊娠的早期維持，其生理功能的正常與否對(duì)生殖周期的更替起到重要的作用[9-11]。陳樹林等通過大量的研究證實(shí)黃體組織中存在一定數(shù)量的彌散性神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，并闡述了其共同的細(xì)胞標(biāo)志物在黃體中的分布特點(diǎn)，這些細(xì)胞標(biāo)志物主要有神經(jīng)特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、S-100蛋白(S-100 protein)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)和突觸素(synaptophysin,SYP)。它們隨著黃體的發(fā)生、發(fā)展和退化而出現(xiàn)規(guī)律性的變化。綜合分析判斷，這些標(biāo)志物與黃體的發(fā)育必定有密切的關(guān)系[12-13]。本文擬在細(xì)胞培養(yǎng)水平上研究5-HT對(duì)山羊黃體細(xì)胞增殖的影響，為黃體的發(fā)育及成熟后發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的機(jī)理提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)用動(dòng)物健康且性成熟的雌性奶山羊10只，購自楊凌姚南養(yǎng)殖場。

1.1.2主要儀器與試劑DMEM-F12培養(yǎng)基，Gibcobrl公司產(chǎn)品；胎牛血清(FBS),Hyclone公司產(chǎn)品；MTT、二甲基亞砜(dimethgl sulphoxide,DMSO)、5-HT，Sigma公司產(chǎn)品；OT單克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)多克隆抗體，Dako公司產(chǎn)品；SP二抗試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；RT-2100C 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，Rayto產(chǎn)品；超凈工作室(SW-CT-IF),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；CO2恒溫培養(yǎng)箱，日本三洋工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品；Moticam5000圖像信號(hào)采集與分析系統(tǒng)，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1山羊黃體細(xì)胞的分離、體外培養(yǎng)與鑒定采用頸部放血法處理性成熟雌性奶山羊，并取出卵巢保證無菌，投入預(yù)先冷置的PBS液中，將卵巢表面血漬洗滌干凈，放入預(yù)冷的生理鹽水中，用冰瓶帶回實(shí)驗(yàn)室。于超凈工作臺(tái)內(nèi)，從冰瓶中取出采集的新鮮卵巢，置于盛有無菌PBS液的培養(yǎng)皿中，用鑷子小心鈍性分離外層的卵巢膜，分離黃體組織，放入青霉素小瓶中(已事先加入少量PBS液)，小心剪碎，移入已滅菌離心管中，加入少量PBS液小心清洗，靜置沉淀，棄去上清液，加入2 g/L膠原酶Ⅱ溶液，密封管口，于37 ℃水浴恒溫箱中消化40 min，100 mL/L胎牛血清DMEM-F12完全培養(yǎng)液終止消化后細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目在4×105個(gè)/mL～5×105個(gè)/mL之間，吸取適量細(xì)胞懸液于無菌培養(yǎng)皿中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞充分貼壁，傳代培養(yǎng)觀察，并采用OT染色鑒定細(xì)胞。

1.2.25- HT誘導(dǎo)山羊黃體細(xì)胞增殖試驗(yàn)用胰酶消化法處理傳至第2代的細(xì)胞并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，通過添加完全培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行調(diào)整，將調(diào)整好的細(xì)胞懸液用移液器移入96孔板，控制接種密度大約為2×103個(gè)細(xì)胞/100μL/孔，培養(yǎng)24 h后，棄舊培養(yǎng)基后換成DMEM-F12無血清培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)12 h后，分別用含有10-4mol/L～10-9mol/L遞減濃度的5-HT培養(yǎng)液再做更換作為細(xì)胞處理組。細(xì)胞未處理組加入DMEM-F12無血清培養(yǎng)液，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)觀察4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別是24、48、72、96 h。每個(gè)待測(cè)培養(yǎng)孔移入MTT溶液總量為20μL，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱持續(xù)孵育4 h，吸棄孔內(nèi)剩余培養(yǎng)液后，小心避光加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，置于搖床緩慢振蕩10 min后，立即檢測(cè)吸光度值。

1.2.3免疫組化試驗(yàn)在24孔培養(yǎng)板中放置蓋玻片，并事先在板孔中央滴1滴PBS溶液(通過液體表面張力牢固固定蓋玻片)。每孔接種細(xì)胞3×104個(gè)左右，加入含 mL/L胎牛血清的DMEM-F12完全培養(yǎng)液0.5 mL，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)24 h后，換成含10-4mol/L～10-6mol/L 3個(gè)不同濃度的5-HT培養(yǎng)液，細(xì)胞未處理組為DMEM-F12無血清培養(yǎng)液。置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后用鑷子取出細(xì)胞玻片，PBS液充分沖洗后，40 g/L多聚甲醛溶液處理30 min，再用PBS液充分沖洗；1 g/L TritonX-100覆蓋細(xì)胞浸潤20 min，用PBS液沖洗，滴加內(nèi)源性過氧化物酶封閉液，室溫孵育12 min，PBS液沖洗，滴加正常羊血清工作液,室溫孵育12 min；滴加1∶400稀釋處理過的PCNA一抗，放入濕盒中4 ℃過夜。PBS液沖洗，滴加生物素標(biāo)記的二抗,室溫孵育12 min，PBS液沖洗，滴加HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，室溫孵育12 min，PBS液沖洗，滴加DAB顯色工作液，達(dá)到最佳顯色時(shí)間后用蒸餾水沖洗終止顯色。正常兔血清是一抗的替代對(duì)照，PBS緩沖液是二抗的空白對(duì)照。

1.2.4圖像分析于顯微鏡下觀察采集5個(gè)～8個(gè)視野圖，保存圖樣后載入采集分析系統(tǒng)，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，并檢測(cè)平均灰度值。平均灰度值的高低代表圖像透光率的高低，一共分成256級(jí)，最亮為256級(jí)，最黑為0級(jí)。平均灰度值高對(duì)應(yīng)染色淺和蛋白表達(dá)量低；反之，平均灰度值低則對(duì)應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)目多和蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)。

2　結(jié)果

2.1山羊黃體細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

膠原酶Ⅱ消化法培養(yǎng)原代山羊黃體細(xì)胞，可見黃體細(xì)胞貼壁伸展生長，多呈狹長梭邊形、橢圓形，少數(shù)出現(xiàn)多邊形。采用免疫組織化學(xué)染色法鑒定原代培養(yǎng)的細(xì)胞類型，結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)強(qiáng)烈的OT陽性表達(dá)，可以確定所培養(yǎng)的細(xì)胞為山羊黃體細(xì)胞(圖1)。

A.陰性對(duì)照;B.OT陽性細(xì)胞

2.25-HT誘導(dǎo)山羊黃體細(xì)胞增殖試驗(yàn)

分別用含有10-4mol/L～10-9mol/L遞減濃度的5-HT培養(yǎng)液更換舊培養(yǎng)液培養(yǎng)山羊黃體細(xì)胞。細(xì)胞處理組和細(xì)胞未處理組對(duì)比的結(jié)果顯示,細(xì)胞處理組(10-4mol/L～10-8mol/L組)組間OD值差異性顯著(P<0.05)，表明5-HT對(duì)山羊黃體細(xì)胞的增殖在效應(yīng)濃度內(nèi)起到促進(jìn)作用，并隨著濃度的增加促增殖作用逐漸加強(qiáng)。然而10-4mol/L 與10-5mol/L 兩個(gè)濃度組間的OD值差異性不顯著，10-9mol/L濃度組對(duì)山羊黃體細(xì)胞的促增殖無明顯作用(圖2)。

2.35-HT對(duì)體外培養(yǎng)黃體細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響

細(xì)胞未處理組和細(xì)胞處理組均為PCNA蛋白細(xì)胞核陽性染色(圖3)通過計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，檢測(cè)平均灰度值得出,細(xì)胞處理組的PCNA蛋白表達(dá)量顯著高于細(xì)胞未處理組(P<0.05)，表明細(xì)胞處理組可能通過促進(jìn)PCNA蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響山羊黃體細(xì)胞的增殖(表1)。

與對(duì)照組比較，*P<0.01；10-5mol/L組與10-4mol/L組比較，#P>0.05

Compared with control group，*P<0.01 ；10-5mol/L compared with 10-4mol/L，#P>0.05

圖2不同濃度5-HT對(duì)山羊黃體細(xì)胞增殖的影響

Fig.2The effects of 5-HT concentrations on proliferation of goat corpus luteal cells

A.對(duì)照組;B.5-HT組(10-5 mol/L)

組別Groups24h陽性細(xì)胞數(shù)/mm2Positivecellnumber平均灰度值A(chǔ)veragegrayvalue48h陽性細(xì)胞數(shù)/mm2Positivecellnumber平均灰度值A(chǔ)veragegrayvalue72h陽性細(xì)胞數(shù)/mm2Positivecellnumber平均灰度值A(chǔ)veragegrayvalue對(duì)照組Control203±37221.2±7.7218±29207.3±10.6246±40195.2±5.810-6mol/L257±31a190.4±6.2a270±48a187.4±5.8a293±22a154.7±4.6a10-5mol/L278±27ab176.1±8.2ab292±29ab165.1±9.3ab313±34ab136.2±8.5ab10-4mol/L286±41abc170±4.3abc290±66abc168.5±6.9abc329±29abc129.8±7.7abc

注：a.與對(duì)照組比較，P<0.05；b.與10-6mol/L 組比較，P<0.01；c.與10-5mol/L 組比較，P>0.05。

Note：a.Compared with control group，P<0.05；b.Compared with 10-6mol/L，P<0.01；c.Compared with 10-5mol/L，P>0.05.

3　討論

5-HT是一種首先從人的血清中發(fā)現(xiàn)的活性肽類，也是一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。已有研究在大鼠證實(shí)[14]5-HT在有效濃度范圍內(nèi)能引起體外培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖，5-HT的促增殖作用表現(xiàn)為隨其濃度的升高而加強(qiáng)，但5-HT對(duì)于山羊黃體細(xì)胞體外生長影響的研究情況尚未報(bào)道。陳樹林等[12-13]研究證實(shí)山羊黃體細(xì)胞中存在5-HT的表達(dá)。本研究采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，通過添加不同濃度的5-HT來觀察其對(duì)山羊黃體細(xì)胞增殖的影響。

本研究采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，初步得出5-HT對(duì)于山羊黃體細(xì)胞生長增殖的影響規(guī)律。細(xì)胞處理組與細(xì)胞未處理組相比，處理組的OD值明顯高于未處理組數(shù)值，表明5-HT具有促增殖效應(yīng)，并隨其濃度梯度的升高而增強(qiáng)，在10-8mol/L～10-4mol/L的濃度范圍內(nèi)具有顯著性，但10-4mol/L與10-5mol/L 兩個(gè)濃度組間的OD值差異性不顯著，可以推出10-5mol/L濃度組對(duì)山羊黃體細(xì)胞的促增殖作用產(chǎn)生阻滯效應(yīng)。

PCNA高表達(dá)于快速增殖細(xì)胞的細(xì)胞核中。參與細(xì)胞DNA的合成，并且啟動(dòng)細(xì)胞分裂增殖[14-15]。有學(xué)者研究表明，PCNA蛋白的表達(dá)主要發(fā)生在細(xì)胞周期的G1期和S期，在M期和靜止期其表達(dá)水平較低[16]。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組與各試驗(yàn)組中PCNA蛋白均成細(xì)胞核陽性染色。與對(duì)照組相比，5-HT不同濃度試驗(yàn)組染色結(jié)果陽性較強(qiáng)，灰度值分析PCNA蛋白相對(duì)表達(dá)量較高，提示不同濃度的5-HT組與山羊黃體細(xì)胞的PCNA蛋白的表達(dá)存在關(guān)聯(lián)。

綜合以上研究結(jié)果，能夠初步證明在離體培養(yǎng)的山羊黃體細(xì)胞中加入10-8mol/L～10-4mol/L濃度范圍的5-HT后，顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，外源性加入10-6mol/L～10-4mol/L的5-HT，能顯著增加PCNA蛋白的表達(dá)量。此試驗(yàn)結(jié)果在一定程度上表明，外源性加入不同濃度5-HT有助于山羊黃體細(xì)胞的增殖，這可能是通過與PCNA蛋白的表達(dá)進(jìn)程和水平建立了聯(lián)系，促使山羊黃體細(xì)胞的增殖周期由G1期向S期轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)的，但其涉及的分子機(jī)制還不明確，需要深入研究。

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收稿日期：2016-03-09

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30972151)

作者簡介：楊煥(1989-)，女，新疆烏魯木齊人，碩士，主要從事動(dòng)物免疫內(nèi)分泌調(diào)控研究。*通訊作者

中圖分類號(hào):Q813.11

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1007-5038(2016)07-0053-05

Effect of Serotonin on Proliferation in Cultured Goat's Luteal Cellsinvitro

YANG Huan1,ZHANG Hua2,CHEN Jiong1,FAN Yan-le1,MA Ju-hong1,LI Guo-hong1,LEI Qi-jing1,YIN Yu-peng1,ZHAO Shan-ting1,CHEN Shu-lin1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China;2.LayCommercialBank,Laiwu,Shandong,271100,China)

Abstract:The purpose of this study was to investigate that whether there is a close correlation between serotonin (5-HT) and the growth of goat luteal cells and to reveal the 5-HT in the corpus luteum of the biological effects of developing.In this study,the primary culture goat corpus luteal cells were obtained by collagenaseⅡ digestion and identified with OT immunostaining.The effect was studied using MTT assay and immunohistochemical staining assay-SP to obtain goat luteal cells PCNA protein.MTT assay showed that,5-HT on the proliferation of goat luteal cells play a role in promoting the proliferation in the concentration range of 10-8-10-4mol/L,the higher the concentration,the more obvious proliferation.Immunohistochemical staining confirmed that 5-HT enables goat luteal cells expressing PCNA protein increased.The results showed that 5-HT may be by promoting the expression of PCNA protein to achieve the effect of promoting proliferation of goat luteal cells.5-HT occurs in the corpus luteum,plays an important role in the development process and the initial revealing the molecular mechanisms associated reproductive endocrine system,and provides a theoretical basis.

Key words:goat corpus luteum cell; 5-hydroxytryptamine; proliferation; proliferating cell nuclear antigen