青海省海北地區(qū)牦牛源賈第蟲檢測與基因型分析

王光華，王戈平，李秀萍，蔡其剛，馬利青*，周金林

(1.青海省畜牧獸醫(yī)科學院，青海西寧 810016；2.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

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青海省海北地區(qū)牦牛源賈第蟲檢測與基因型分析

王光華1，王戈平1，李秀萍1，蔡其剛1，馬利青1*，周金林2

(1.青海省畜牧獸醫(yī)科學院，青海西寧 810016；2.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

摘要：為研究青海省海北地區(qū)牦牛賈第蟲的感染情況及蟲種基因型，對青海省祁連縣、海晏縣和剛察縣的297份牦牛糞樣采用蔗糖密度梯度離心法純化，之后用免疫熒光方法對賈第蟲進行鑒定，對陽性及疑似陽性樣品采用基于18 S rRNA和谷氨酸脫氫酶(gdh)基因的套式PCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進行測序。將測序結果與GenBank中的賈第蟲序列進行比對分析。免疫熒光抗體試驗結果顯示，共檢出24份賈第蟲陽性糞樣，總陰性率為8.1%。套式PCR擴增結果顯示,24份陽性樣品中18 S rRNA基因擴增陽性22份，gdh基因擴增陽性18份，產(chǎn)物大小分別為292 bp和432 bp。序列分析表明，分離的蟲種均為牦牛源腸賈第蟲，基因型為集聚體E，未發(fā)現(xiàn)人畜共患基因型。

關鍵詞：牦牛；賈第蟲；基因型；免疫熒光試驗；套式PCR

藍氏賈第鞭毛蟲(Giardialamblia)是一種重要的人獸共患寄生蟲，也是人體腸道感染的常見寄生蟲之一，常引起人和動物的腹痛、腹瀉和消化不良[1]。賈第蟲有廣泛的宿主，包括人類和其他哺乳動物，一旦感染很難消除。任何年齡的人和動物均有易感性，羔羊和犢牛尤其易感，感染孢囊后多為無癥狀帶蟲者，有臨床癥狀者主要表現(xiàn)為急性或慢性腹瀉，后者常伴有營養(yǎng)吸收不良綜合征。目前，賈第蟲病已被列為世界范圍內危害人類健康的10種主要寄生蟲病之一[2]。

賈第蟲的基因型根據(jù)分子遺傳學和表型不同可分為8個主要的聚集體(A～H),每個聚集體都有不同的宿主范圍，A和B集聚體主要感染人和多種哺乳動物[1]。對賈第蟲的傳統(tǒng)檢測方法主要是采集動物糞樣濃縮技術(硫酸鋅浮集法、甲醛-乙醚沉積法和離心法)處理包囊，之后用ELISA、顯微鏡觀察和免疫熒光技術進行抗原檢測。隨著分子生物學技術的發(fā)展，PCR和熒光定量PCR技術廣泛應用于賈第蟲的分子流行病學調查。目前，賈第蟲的檢測和基因分型技術主要通過分析小亞基核糖體RNA(small subunit ribosomal RNA,ssu-rRNA)、β賈第素(β-giardin,bg)、谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase,gdh)、延伸因子-1α(elongation factors-1α,ef-1α)、磷酸丙糖異構酶(triosephosphate isomerase,tpi)及滋養(yǎng)體表面抗原基因實現(xiàn)[3]。

本研究從青海省海北藏族自治州祁連縣、海晏縣和剛察縣的不同牧戶采集了297份牦牛糞樣，采用蔗糖密度梯度離心法純化之后用免疫熒光試驗(immunofluorescence test,IFT)進行鑒定，對陽性及疑似陽性樣品進行基于賈第蟲18 S rRNA和谷氨酸脫氫酶(gdh)的套式PCR擴增，為該地區(qū)牦牛賈第蟲病的防控和研究提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1糞樣2014年9月～11月，分別以青海省祁連縣、海晏縣和剛察縣的7戶規(guī)模在50頭以上的養(yǎng)殖戶為調查對象，采集不同牧戶4月齡～7月齡犢牦牛的新鮮糞樣，加入25 g/L的重鉻酸鉀溶液后存放于4 ℃冰箱，共采集297份糞便樣品。

1.1.2主要試劑與儀器糞樣DNA提取試劑盒、GoTaqDNA聚合酶預混液等，Promega公司產(chǎn)品；DNA標準DL 2 000、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒、瓊脂糖等，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；賈第蟲熒光抗體試劑盒，Cellabs公司產(chǎn)品；胰蛋白胨、酵母提取物，Oxoid公司產(chǎn)品；其他化學試劑如氯化鈉、氫氧化鈉和碘液等均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1免疫熒光抗體檢測參照文獻[4]方法，每份樣品經(jīng)蔗糖密度梯度離心法純化后采用免疫熒光抗體檢測法進行檢測。在400倍鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)賈第蟲包囊的樣品判為陽性，未發(fā)現(xiàn)的判為陰性。

1.2.2糞樣DNA的提取對間接免疫熒光試驗(IFT)檢測陽性的樣品提取DNA。分別取400 μL純化的樣品分裝于1.5 mL離心管，按糞便DNA提取試劑盒說明書進行樣品DNA提取，所得DNA溶于80 μL滅菌水中，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.318 S rRNA基因的套式PCR擴增參照文獻[5]的引物和方法對IFT檢測陽性樣品進行18 S rRNA基因擴增，引物序列見表1，目的基因片段長度約為292 bp。第1輪PCR反應體系為12.5 μL GoTaqDNA聚合酶預混液，上、下游引物Gia2029和Gia2150c各1 μL(10 μmol/L),模板DNA 3 μL，加滅菌水至25 μL；第2輪PCR體系中模板為第1輪PCR反應產(chǎn)物1 μL，上、下游引物RH11和RH4各1 μL(10 μmol/L)，其余試劑與首輪體系一致。第1輪反應條件為：95 ℃ 4 min；95 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。第2輪反應條件為：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物電泳后回收并純化，送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

表1　所用套式PCR引物

1.2.4基于gdh基因的套式PCR擴增參照文獻[6]引物和方法對IFT檢測陽性樣品進行gdh基因擴增，引物序列見表1，目的基因片段長度約為432 bp。第1輪PCR反應體系為12.5 μL GoTaqDNA聚合酶預混液，上、下游引物GDHeF和GDHiR各1 μL(10 μmol/L),模板DNA3 μL，加滅菌水至25 μL；第2輪PCR體系中模板為第1輪PCR反應產(chǎn)物1 μL，上、下游引物GDHiF和GDHiR各1 μL(10 μmol/L)，其余試劑與首輪反應體系一致。第1輪反應條件為：95 ℃ 4 min；95 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。第2輪反應條件為：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；之后72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物電泳后回收并純化，送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

1.2.5基于gdh基因的限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析參照文獻[6]的方法，將PCR擴增的gdh基因片段采用限制性內切酶NlaⅣ進行RFLP分析，具體步驟為：10×M buffer 2 μL,限制性內切酶NlaⅣ 0.5 μL，PCR產(chǎn)物10 μL，牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)0.2 μL，加滅菌水至20 μL。37 ℃反應3 h,之后采用30 g/L瓊脂糖凝膠電泳，核酸染色劑染色后分析電泳圖譜。

2　結果

2.1糞樣免疫熒光抗體檢測

經(jīng)賈第蟲免疫熒光抗體試劑盒檢測，在采集的297份糞樣中共檢出24份賈第蟲陽性樣品，總感染率為8.1%。賈第蟲在免疫熒光顯微鏡下的形態(tài)見圖1。

圖1　免疫熒光抗體法檢測牦牛賈第蟲包囊(400×)

2.218 S rRNA基因和gdh基因擴增結果

24份IFT陽性樣品采用套式PCR方法擴增，18 S rRNA基因擴增陽性22份，gdh基因擴增陽性18份，產(chǎn)物大小分別為292 bp和432 bp，符合預期大小(圖2和圖3)。

2.3基因測序及序列分析

將擴增出的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，經(jīng)NCBI Blast序列比對，結果均為賈第蟲18 S rRNA基因或gdh基因。

2.4RFLP分析結果

將PCR擴增的gdh基因片段采用限制性內切酶NlaⅣ進行RFLP分析，發(fā)現(xiàn)gdh基因片段可以被限制性內切酶(NlaⅣ)酶切為3個主要的片段為220、100、70bp(圖4)。這個結果與文獻[6]中賈第蟲集聚體E型的片段大小一致。

3　討論

本研究采用免疫熒光抗體試驗對青海省海北州

M.DNA標準DL 2 000；1.陽性對照;2.陰性對照；3～17.糞樣PCR結果

M.DNA標準DL 2 000；1.陽性對照；2～9.糞樣PCR結果；10.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 00;1.Positive control.2-9.PCR products of the fecal samples;10.Negative control

圖3賈第蟲gdh基因PCR擴增結果

Fig.3PCR amplification results ofGiardiagdh gene

M.DNA標準；1～2.糞樣gdh 基因PCR-RFLP分析結果；3.陽性對照樣品gdh 基因PCR-RFLP分析結果；4.陰性對照

M.DNA Marker；1-2.PCR-RFLP analysis of positive samples；3.PCR-RFLP analysis of positive control；4.Negative control

圖4基于賈第蟲gdh基因的PCR-RFLP分析圖

Fig.4PCR-RFLP analysis ofGiardiagdh gene

部分地區(qū)的牦牛糞樣進行了賈第蟲的鑒定，從297份糞樣中共檢出24份賈第蟲陽性樣品，總感染率為8.1%。表明該地區(qū)牦牛中存在一定程度的賈第蟲感染。不同地區(qū)，不同動物中賈第蟲的感染率不同，馮超等[7]對河南省2 137份奶牛糞樣調查發(fā)現(xiàn)189份奶牛糞樣為賈第蟲陽性，總感染率為8.84%。顧有方等[8]對安徽省部分地區(qū)山羊糞樣進行賈第蟲鑒定，共檢出32份賈第蟲陽性樣品，總陽性率為6.3%。王光華等[9]對青海省海晏縣10份牧羊犬糞便樣品進行賈第蟲檢測，結果有1份為賈第蟲包囊陽性，陽性率為10%。

IFT方法操作簡單，特異性好，但僅憑形態(tài)學和免疫學鑒定難以確定基因型和亞型，通過分子生物學方法進行基因分型可以彌補形態(tài)學分類的不足?；谫Z第蟲18 S rRNA基因的套式PCR擴增是目前最常用的方法之一，該方法具有簡便、快速、特異性和敏感性強等特點。在本試驗中用18 S rRNA基因套式PCR方法共檢測出22份賈第蟲陽性樣品，出現(xiàn)部分樣品IFT檢測陽性而PCR檢測陰性現(xiàn)象，可能是由于賈第蟲包囊在樣品中分布不均勻或樣品中存在PCR擴增酶抑制物。

在賈第蟲聚集體分型方面主要采用基于18 S rRNA和gdh基因PCR-RFLP分析方法，但由于18 S rRNA比gdh基因更加保守，因此采用18 S rRNA PCR-RFLP方法無法區(qū)分集聚體A和B中存在的亞型；此外，PCR-RFLP分析中采用的gdh基因片段比18 S rRNA基因片段長，因此分析獲得的信息更加可靠[6]。本試驗中對陽性樣品采用基于賈第蟲gdh基因的PCR-RFLP分析方法，結果表明陽性樣品均為牦牛源腸賈第蟲，基因型為集聚體E，沒有發(fā)現(xiàn)人畜共患的集聚體。

參考文獻：

[1]鄧明俊,肖西志,孫濤,等.藍氏賈第鞭毛蟲檢測技術研究進展[J].動物醫(yī)學進展,2012,33(12):168-173.

[2]張會寧,于鑫,魏博,等.隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的危害及其控制技術[J].環(huán)境科學與技術,2011,34(12):135-140.

[3]梁樂,汪世龍,王惠琴.水源性藍氏賈第鞭毛蟲分子生物學檢測方法研究進展[J].國際醫(yī)學寄生蟲病雜志,2009,36(2):114-117.

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[5]Juan D R,Ruben D H,Carolina H,et al.Molecular diagnosis and genotype analysis ofGiardiaduodenalisin asymptomatic children from a rural area in central Colombia [J].Infect Genet Evol,2015,32:208-213.

[6]Carolyn M R,Paul T M,Andrew Thompson R C.Discrimination of all genotypes ofGiardiaduodenalisat the glutamate dehydrogenase locus using PCR-RFLP [J].Infec Genet Evol,2004,4:125-130.

[7]馮超.河南省部分地區(qū)奶牛賈第蟲病流行病學調查及分離株分子特征研究[D].河南鄭州：河南農業(yè)大學,2010.

[8]顧有方,王立克,李陽,等.安徽省部分地區(qū)山羊藍氏賈第鞭毛蟲流行病學調查及基因型分析[J].中國寄生蟲與寄生蟲病雜志,2014,32(5):401-403.

[9]王光華,蔡其剛,王戈平,等.青海省海晏縣犬糞樣中賈第鞭毛蟲的檢測[J].動物醫(yī)學進展,2013,34(9):29-32.

收稿日期：2016-01-19

基金項目：青海省自然科學基金項目(2013-Z-934Q)；外專千人計劃(WQ20136300172)

作者簡介：王光華(1978-)，男，青海大通人，副研究員，博士，主要從事病原微生物學研究。*通訊作者

中圖分類號:S852.722

文獻標識碼:A

文章編號:1007-5038(2016)07-0030-04

Detection and Genotyping ofGiardiaIsolates from Yaks in Haibei Area of Qinghai Province

WANG Guang-hua1,WANG Ge-ping1,LI Xiu-ping1,CAI Qi-gang1,MA Li-qing1,ZHOU Jin-lin2

(1.QinghaiAcademyofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,Xining,Qinghai,810016，China; 2.ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgricultureSciences,Shanghai,200241，China)

Abstract:Two hundred ninety-seven fresh fecal samples were collected from yaks in Qilian,Haiyan,Gangcha counties of Qinghai province,and detected by immunofluorescence test (IFT) after discontinuous sucrose gradient purification.The IFT-positive samples were amplified by nested PCR targeting the 18 S rRNA and glutamate dehydrogenase (gdh) genes,and the positive PCR products were sequenced.The sequencing results and published Giardia sequence in GenBank were compared and analyzed.The results showed,24 fecal samples were positive by IFT,the total infection rate was 8.1%.22 out of 24 were 18 S rRNA gene (292 bp) positive,18 out of 24 were gdh gene (432 bp) positive,respectively.The sequence analysis indicated that these isolated species are Giardia duodenalis,assemblage E.The zoonotic genotype was not found in the present study.

Key words:yak; Giardia; genotype; immunofluorescence; nested-PCR