• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    青海省海北地區(qū)牦牛源賈第蟲檢測與基因型分析

    2016-08-15 07:54:16王光華王戈平李秀萍蔡其剛馬利青周金林
    動物醫(yī)學進展 2016年7期
    關鍵詞:牦牛基因型

    王光華,王戈平,李秀萍,蔡其剛,馬利青*,周金林

    (1.青海省畜牧獸醫(yī)科學院,青海西寧 810016;2.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241)

    ?

    青海省海北地區(qū)牦牛源賈第蟲檢測與基因型分析

    王光華1,王戈平1,李秀萍1,蔡其剛1,馬利青1*,周金林2

    (1.青海省畜牧獸醫(yī)科學院,青海西寧 810016;2.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241)

    摘要:為研究青海省海北地區(qū)牦牛賈第蟲的感染情況及蟲種基因型,對青海省祁連縣、海晏縣和剛察縣的297份牦牛糞樣采用蔗糖密度梯度離心法純化,之后用免疫熒光方法對賈第蟲進行鑒定,對陽性及疑似陽性樣品采用基于18 S rRNA和谷氨酸脫氫酶(gdh)基因的套式PCR擴增,并對擴增產(chǎn)物進行測序。將測序結果與GenBank中的賈第蟲序列進行比對分析。免疫熒光抗體試驗結果顯示,共檢出24份賈第蟲陽性糞樣,總陰性率為8.1%。套式PCR擴增結果顯示,24份陽性樣品中18 S rRNA基因擴增陽性22份,gdh基因擴增陽性18份,產(chǎn)物大小分別為292 bp和432 bp。序列分析表明,分離的蟲種均為牦牛源腸賈第蟲,基因型為集聚體E,未發(fā)現(xiàn)人畜共患基因型。

    關鍵詞:牦牛;賈第蟲;基因型;免疫熒光試驗;套式PCR

    藍氏賈第鞭毛蟲(Giardialamblia)是一種重要的人獸共患寄生蟲,也是人體腸道感染的常見寄生蟲之一,常引起人和動物的腹痛、腹瀉和消化不良[1]。賈第蟲有廣泛的宿主,包括人類和其他哺乳動物,一旦感染很難消除。任何年齡的人和動物均有易感性,羔羊和犢牛尤其易感,感染孢囊后多為無癥狀帶蟲者,有臨床癥狀者主要表現(xiàn)為急性或慢性腹瀉,后者常伴有營養(yǎng)吸收不良綜合征。目前,賈第蟲病已被列為世界范圍內危害人類健康的10種主要寄生蟲病之一[2]。

    賈第蟲的基因型根據(jù)分子遺傳學和表型不同可分為8個主要的聚集體(A~H),每個聚集體都有不同的宿主范圍,A和B集聚體主要感染人和多種哺乳動物[1]。對賈第蟲的傳統(tǒng)檢測方法主要是采集動物糞樣濃縮技術(硫酸鋅浮集法、甲醛-乙醚沉積法和離心法)處理包囊,之后用ELISA、顯微鏡觀察和免疫熒光技術進行抗原檢測。隨著分子生物學技術的發(fā)展,PCR和熒光定量PCR技術廣泛應用于賈第蟲的分子流行病學調查。目前,賈第蟲的檢測和基因分型技術主要通過分析小亞基核糖體RNA(small subunit ribosomal RNA,ssu-rRNA)、β賈第素(β-giardin,bg)、谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase,gdh)、延伸因子-1α(elongation factors-1α,ef-1α)、磷酸丙糖異構酶(triosephosphate isomerase,tpi)及滋養(yǎng)體表面抗原基因實現(xiàn)[3]。

    本研究從青海省海北藏族自治州祁連縣、海晏縣和剛察縣的不同牧戶采集了297份牦牛糞樣,采用蔗糖密度梯度離心法純化之后用免疫熒光試驗(immunofluorescence test,IFT)進行鑒定,對陽性及疑似陽性樣品進行基于賈第蟲18 S rRNA和谷氨酸脫氫酶(gdh)的套式PCR擴增,為該地區(qū)牦牛賈第蟲病的防控和研究提供參考。

    1 材料與方法

    1.1材料

    1.1.1糞樣2014年9月~11月,分別以青海省祁連縣、海晏縣和剛察縣的7戶規(guī)模在50頭以上的養(yǎng)殖戶為調查對象,采集不同牧戶4月齡~7月齡犢牦牛的新鮮糞樣,加入25 g/L的重鉻酸鉀溶液后存放于4 ℃冰箱,共采集297份糞便樣品。

    1.1.2主要試劑與儀器糞樣DNA提取試劑盒、GoTaqDNA聚合酶預混液等,Promega公司產(chǎn)品;DNA標準DL 2 000、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒、瓊脂糖等,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;賈第蟲熒光抗體試劑盒,Cellabs公司產(chǎn)品;胰蛋白胨、酵母提取物,Oxoid公司產(chǎn)品;其他化學試劑如氯化鈉、氫氧化鈉和碘液等均為國產(chǎn)分析純。

    1.2方法

    1.2.1免疫熒光抗體檢測參照文獻[4]方法,每份樣品經(jīng)蔗糖密度梯度離心法純化后采用免疫熒光抗體檢測法進行檢測。在400倍鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)賈第蟲包囊的樣品判為陽性,未發(fā)現(xiàn)的判為陰性。

    1.2.2糞樣DNA的提取對間接免疫熒光試驗(IFT)檢測陽性的樣品提取DNA。分別取400 μL純化的樣品分裝于1.5 mL離心管,按糞便DNA提取試劑盒說明書進行樣品DNA提取,所得DNA溶于80 μL滅菌水中,置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.318 S rRNA基因的套式PCR擴增參照文獻[5]的引物和方法對IFT檢測陽性樣品進行18 S rRNA基因擴增,引物序列見表1,目的基因片段長度約為292 bp。第1輪PCR反應體系為12.5 μL GoTaqDNA聚合酶預混液,上、下游引物Gia2029和Gia2150c各1 μL(10 μmol/L),模板DNA 3 μL,加滅菌水至25 μL;第2輪PCR體系中模板為第1輪PCR反應產(chǎn)物1 μL,上、下游引物RH11和RH4各1 μL(10 μmol/L),其余試劑與首輪體系一致。第1輪反應條件為:95 ℃ 4 min;95 ℃ 45 s,58 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共35個循環(huán);72 ℃ 7 min。第2輪反應條件為:95 ℃ 4 min;95 ℃ 30 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35個循環(huán);72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物電泳后回收并純化,送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

    表1 所用套式PCR引物

    1.2.4基于gdh基因的套式PCR擴增參照文獻[6]引物和方法對IFT檢測陽性樣品進行gdh基因擴增,引物序列見表1,目的基因片段長度約為432 bp。第1輪PCR反應體系為12.5 μL GoTaqDNA聚合酶預混液,上、下游引物GDHeF和GDHiR各1 μL(10 μmol/L),模板DNA3 μL,加滅菌水至25 μL;第2輪PCR體系中模板為第1輪PCR反應產(chǎn)物1 μL,上、下游引物GDHiF和GDHiR各1 μL(10 μmol/L),其余試劑與首輪反應體系一致。第1輪反應條件為:95 ℃ 4 min;95 ℃ 45 s,56 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,35個循環(huán);72 ℃ 7 min。第2輪反應條件為:95 ℃ 4 min;95 ℃ 30 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35個循環(huán);之后72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物電泳后回收并純化,送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

    1.2.5基于gdh基因的限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析參照文獻[6]的方法,將PCR擴增的gdh基因片段采用限制性內切酶NlaⅣ進行RFLP分析,具體步驟為:10×M buffer 2 μL,限制性內切酶NlaⅣ 0.5 μL,PCR產(chǎn)物10 μL,牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)0.2 μL,加滅菌水至20 μL。37 ℃反應3 h,之后采用30 g/L瓊脂糖凝膠電泳,核酸染色劑染色后分析電泳圖譜。

    2 結果

    2.1糞樣免疫熒光抗體檢測

    經(jīng)賈第蟲免疫熒光抗體試劑盒檢測,在采集的297份糞樣中共檢出24份賈第蟲陽性樣品,總感染率為8.1%。賈第蟲在免疫熒光顯微鏡下的形態(tài)見圖1。

    圖1 免疫熒光抗體法檢測牦牛賈第蟲包囊(400×)

    2.218 S rRNA基因和gdh基因擴增結果

    24份IFT陽性樣品采用套式PCR方法擴增,18 S rRNA基因擴增陽性22份,gdh基因擴增陽性18份,產(chǎn)物大小分別為292 bp和432 bp,符合預期大小(圖2和圖3)。

    2.3基因測序及序列分析

    將擴增出的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序,經(jīng)NCBI Blast序列比對,結果均為賈第蟲18 S rRNA基因或gdh基因。

    2.4RFLP分析結果

    將PCR擴增的gdh基因片段采用限制性內切酶NlaⅣ進行RFLP分析,發(fā)現(xiàn)gdh基因片段可以被限制性內切酶(NlaⅣ)酶切為3個主要的片段為220、100、70bp(圖4)。這個結果與文獻[6]中賈第蟲集聚體E型的片段大小一致。

    3 討論

    本研究采用免疫熒光抗體試驗對青海省海北州

    M.DNA標準DL 2 000;1.陽性對照;2.陰性對照;3~17.糞樣PCR結果

    M.DNA標準DL 2 000;1.陽性對照;2~9.糞樣PCR結果;10.陰性對照

    M.DNA Marker DL 2 00;1.Positive control.2-9.PCR products of the fecal samples;10.Negative control

    圖3賈第蟲gdh基因PCR擴增結果

    Fig.3PCR amplification results ofGiardiagdh gene

    M.DNA標準;1~2.糞樣gdh 基因PCR-RFLP分析結果;3.陽性對照樣品gdh 基因PCR-RFLP分析結果;4.陰性對照

    M.DNA Marker;1-2.PCR-RFLP analysis of positive samples;3.PCR-RFLP analysis of positive control;4.Negative control

    圖4基于賈第蟲gdh基因的PCR-RFLP分析圖

    Fig.4PCR-RFLP analysis ofGiardiagdh gene

    部分地區(qū)的牦牛糞樣進行了賈第蟲的鑒定,從297份糞樣中共檢出24份賈第蟲陽性樣品,總感染率為8.1%。表明該地區(qū)牦牛中存在一定程度的賈第蟲感染。不同地區(qū),不同動物中賈第蟲的感染率不同,馮超等[7]對河南省2 137份奶牛糞樣調查發(fā)現(xiàn)189份奶牛糞樣為賈第蟲陽性,總感染率為8.84%。顧有方等[8]對安徽省部分地區(qū)山羊糞樣進行賈第蟲鑒定,共檢出32份賈第蟲陽性樣品,總陽性率為6.3%。王光華等[9]對青海省海晏縣10份牧羊犬糞便樣品進行賈第蟲檢測,結果有1份為賈第蟲包囊陽性,陽性率為10%。

    IFT方法操作簡單,特異性好,但僅憑形態(tài)學和免疫學鑒定難以確定基因型和亞型,通過分子生物學方法進行基因分型可以彌補形態(tài)學分類的不足?;谫Z第蟲18 S rRNA基因的套式PCR擴增是目前最常用的方法之一,該方法具有簡便、快速、特異性和敏感性強等特點。在本試驗中用18 S rRNA基因套式PCR方法共檢測出22份賈第蟲陽性樣品,出現(xiàn)部分樣品IFT檢測陽性而PCR檢測陰性現(xiàn)象,可能是由于賈第蟲包囊在樣品中分布不均勻或樣品中存在PCR擴增酶抑制物。

    在賈第蟲聚集體分型方面主要采用基于18 S rRNA和gdh基因PCR-RFLP分析方法,但由于18 S rRNA比gdh基因更加保守,因此采用18 S rRNA PCR-RFLP方法無法區(qū)分集聚體A和B中存在的亞型;此外,PCR-RFLP分析中采用的gdh基因片段比18 S rRNA基因片段長,因此分析獲得的信息更加可靠[6]。本試驗中對陽性樣品采用基于賈第蟲gdh基因的PCR-RFLP分析方法,結果表明陽性樣品均為牦牛源腸賈第蟲,基因型為集聚體E,沒有發(fā)現(xiàn)人畜共患的集聚體。

    參考文獻:

    [1]鄧明俊,肖西志,孫濤,等.藍氏賈第鞭毛蟲檢測技術研究進展[J].動物醫(yī)學進展,2012,33(12):168-173.

    [2]張會寧,于鑫,魏博,等.隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的危害及其控制技術[J].環(huán)境科學與技術,2011,34(12):135-140.

    [3]梁樂,汪世龍,王惠琴.水源性藍氏賈第鞭毛蟲分子生物學檢測方法研究進展[J].國際醫(yī)學寄生蟲病雜志,2009,36(2):114-117.

    [4]Ma L Q,Isaia S,Cai Q G et al.Detection ofCryptosporidiumandGiardiain agricultural and water environments in the Qinghai area of China by IFT and PCR [J].Parasitol Res,2014,113:3177-3184.

    [5]Juan D R,Ruben D H,Carolina H,et al.Molecular diagnosis and genotype analysis ofGiardiaduodenalisin asymptomatic children from a rural area in central Colombia [J].Infect Genet Evol,2015,32:208-213.

    [6]Carolyn M R,Paul T M,Andrew Thompson R C.Discrimination of all genotypes ofGiardiaduodenalisat the glutamate dehydrogenase locus using PCR-RFLP [J].Infec Genet Evol,2004,4:125-130.

    [7]馮超.河南省部分地區(qū)奶牛賈第蟲病流行病學調查及分離株分子特征研究[D].河南鄭州:河南農業(yè)大學,2010.

    [8]顧有方,王立克,李陽,等.安徽省部分地區(qū)山羊藍氏賈第鞭毛蟲流行病學調查及基因型分析[J].中國寄生蟲與寄生蟲病雜志,2014,32(5):401-403.

    [9]王光華,蔡其剛,王戈平,等.青海省海晏縣犬糞樣中賈第鞭毛蟲的檢測[J].動物醫(yī)學進展,2013,34(9):29-32.

    收稿日期:2016-01-19

    基金項目:青海省自然科學基金項目(2013-Z-934Q);外專千人計劃(WQ20136300172)

    作者簡介:王光華(1978-),男,青海大通人,副研究員,博士,主要從事病原微生物學研究。*通訊作者

    中圖分類號:S852.722

    文獻標識碼:A

    文章編號:1007-5038(2016)07-0030-04

    Detection and Genotyping ofGiardiaIsolates from Yaks in Haibei Area of Qinghai Province

    WANG Guang-hua1,WANG Ge-ping1,LI Xiu-ping1,CAI Qi-gang1,MA Li-qing1,ZHOU Jin-lin2

    (1.QinghaiAcademyofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,Xining,Qinghai,810016,China; 2.ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgricultureSciences,Shanghai,200241,China)

    Abstract:Two hundred ninety-seven fresh fecal samples were collected from yaks in Qilian,Haiyan,Gangcha counties of Qinghai province,and detected by immunofluorescence test (IFT) after discontinuous sucrose gradient purification.The IFT-positive samples were amplified by nested PCR targeting the 18 S rRNA and glutamate dehydrogenase (gdh) genes,and the positive PCR products were sequenced.The sequencing results and published Giardia sequence in GenBank were compared and analyzed.The results showed,24 fecal samples were positive by IFT,the total infection rate was 8.1%.22 out of 24 were 18 S rRNA gene (292 bp) positive,18 out of 24 were gdh gene (432 bp) positive,respectively.The sequence analysis indicated that these isolated species are Giardia duodenalis,assemblage E.The zoonotic genotype was not found in the present study.

    Key words:yak; Giardia; genotype; immunofluorescence; nested-PCR

    猜你喜歡
    牦牛基因型
    牦牛場的雪組詩
    滇池(2022年5期)2022-04-30 21:44:36
    美仁大草原的牦牛(外一章)
    散文詩(2021年22期)2022-01-12 06:13:54
    跟著牦牛去巡山
    上海郊區(qū)牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)基因型分析
    DNA微陣列芯片法與直接測序法檢測CYP2C19基因型的比較研究
    敢于面對困境的牦牛
    目前牦??谔阋叩脑\斷與防治
    西安地區(qū)育齡婦女MTHFRC677T基因型分布研究
    BAMBI基因敲除小鼠的繁育、基因型鑒定
    甘蔗黃葉病毒基因型研究進展
    中國糖料(2013年1期)2013-01-22 12:28:23
    欧美在线黄色| 脱女人内裤的视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 露出奶头的视频| www.999成人在线观看| 91av网站免费观看| 在线观看日韩欧美| 免费在线观看日本一区| 久久香蕉精品热| 国产野战对白在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看| 男插女下体视频免费在线播放| 色av中文字幕| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 日本与韩国留学比较| 亚洲中文av在线| 欧美乱妇无乱码| 国产精品 欧美亚洲| 欧美精品啪啪一区二区三区| www日本黄色视频网| 偷拍熟女少妇极品色| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 日韩成人在线观看一区二区三区| 久久久久久大精品| 很黄的视频免费| 成人一区二区视频在线观看| 精品电影一区二区在线| 综合色av麻豆| 热99re8久久精品国产| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美三级亚洲精品| 国产欧美日韩精品亚洲av| 99riav亚洲国产免费| svipshipincom国产片| 亚洲国产精品合色在线| 99久久精品热视频| 久久久久九九精品影院| 国产高清videossex| 欧美不卡视频在线免费观看| 欧美在线一区亚洲| www国产在线视频色| 久久精品国产综合久久久| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲中文字幕日韩| 午夜福利在线观看吧| 国产一区二区激情短视频| 美女大奶头视频| 久久这里只有精品中国| 日韩欧美免费精品| bbb黄色大片| 精品国产乱子伦一区二区三区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国内精品美女久久久久久| 一a级毛片在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 欧美激情在线99| 男女视频在线观看网站免费| 99久久国产精品久久久| 亚洲国产中文字幕在线视频| 中文资源天堂在线| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产私拍福利视频在线观看| 岛国在线免费视频观看| 午夜激情福利司机影院| 国产av一区在线观看免费| 日本熟妇午夜| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲av成人av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲在线自拍视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美三级亚洲精品| 一区福利在线观看| 久久久久久久午夜电影| 午夜福利视频1000在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 免费看a级黄色片| 午夜影院日韩av| 99热只有精品国产| 精品免费久久久久久久清纯| 操出白浆在线播放| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 一本综合久久免费| 亚洲精品一区av在线观看| 国产三级黄色录像| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 天堂影院成人在线观看| 黑人操中国人逼视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 麻豆成人av在线观看| 国产一区在线观看成人免费| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美在线一区亚洲| 99久久精品国产亚洲精品| 国产激情欧美一区二区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 五月玫瑰六月丁香| 青草久久国产| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲电影在线观看av| av欧美777| 欧美在线一区亚洲| 色尼玛亚洲综合影院| 757午夜福利合集在线观看| 国产免费男女视频| 国产亚洲精品av在线| 久久久久久人人人人人| 国产91精品成人一区二区三区| 欧美zozozo另类| 成人亚洲精品av一区二区| 国内精品一区二区在线观看| 美女午夜性视频免费| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产美女午夜福利| 麻豆一二三区av精品| 精品电影一区二区在线| 午夜福利免费观看在线| 精品无人区乱码1区二区| 国产成人精品久久二区二区免费| 欧美又色又爽又黄视频| 中文字幕熟女人妻在线| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产免费男女视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 99在线人妻在线中文字幕| 午夜福利视频1000在线观看| 老司机福利观看| 无限看片的www在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产一区在线观看成人免费| 欧美日韩乱码在线| 日韩有码中文字幕| 91老司机精品| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 男人舔女人下体高潮全视频| 99国产综合亚洲精品| bbb黄色大片| 成人精品一区二区免费| 老汉色∧v一级毛片| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 午夜福利在线观看吧| 亚洲avbb在线观看| 国产一区二区三区视频了| 久久久久久久午夜电影| 美女扒开内裤让男人捅视频| 精品电影一区二区在线| 久久精品91无色码中文字幕| 中文字幕高清在线视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区精品| 岛国在线观看网站| www.999成人在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 一a级毛片在线观看| 99国产综合亚洲精品| 精品久久久久久成人av| 久久久久久人人人人人| 母亲3免费完整高清在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 窝窝影院91人妻| 亚洲成人精品中文字幕电影| 黄色视频,在线免费观看| 热99re8久久精品国产| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 午夜免费观看网址| 精品一区二区三区视频在线 | 嫩草影视91久久| 一夜夜www| 高清在线国产一区| 久久久久亚洲av毛片大全| 91在线精品国自产拍蜜月 | 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 99国产综合亚洲精品| 在线播放国产精品三级| av中文乱码字幕在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 精品国内亚洲2022精品成人| 热99在线观看视频| 99热6这里只有精品| 全区人妻精品视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 91九色精品人成在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 麻豆国产av国片精品| 国产熟女xx| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲国产色片| 国产精品国产高清国产av| 97超视频在线观看视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 日韩中文字幕欧美一区二区| 搡老妇女老女人老熟妇| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲真实伦在线观看| 成人午夜高清在线视频| 麻豆一二三区av精品| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 熟女人妻精品中文字幕| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 欧美一区二区国产精品久久精品| 久久久久精品国产欧美久久久| 又粗又爽又猛毛片免费看| 欧美zozozo另类| 99热精品在线国产| 久久天堂一区二区三区四区| 欧美黄色淫秽网站| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲精华国产精华精| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产成人av教育| 网址你懂的国产日韩在线| 国产成人福利小说| 中文字幕最新亚洲高清| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久久色成人| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| 成人三级做爰电影| 2021天堂中文幕一二区在线观| 性色avwww在线观看| 欧美日本视频| 哪里可以看免费的av片| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产精品综合久久久久久久免费| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国内精品久久久久精免费| 五月伊人婷婷丁香| 免费在线观看成人毛片| 九九在线视频观看精品| 亚洲黑人精品在线| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产一区二区激情短视频| 国产久久久一区二区三区| 日韩免费av在线播放| 91久久精品国产一区二区成人 | 国产亚洲精品av在线| 精品乱码久久久久久99久播| 精品久久久久久成人av| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久久精品大字幕| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲精品456在线播放app | 又爽又黄无遮挡网站| av在线蜜桃| 免费人成视频x8x8入口观看| 在线观看舔阴道视频| 亚洲,欧美精品.| 狂野欧美激情性xxxx| 一区二区三区高清视频在线| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲无线观看免费| a级毛片a级免费在线| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲自拍偷在线| 青草久久国产| 国产视频一区二区在线看| 极品教师在线免费播放| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 最近最新中文字幕大全电影3| 国产三级在线视频| 99热6这里只有精品| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 免费av不卡在线播放| 最近视频中文字幕2019在线8| 欧美国产日韩亚洲一区| 少妇丰满av| 两人在一起打扑克的视频| 1000部很黄的大片| 男人和女人高潮做爰伦理| www日本在线高清视频| 国产三级黄色录像| 啦啦啦韩国在线观看视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 热99re8久久精品国产| 亚洲成人免费电影在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 国产毛片a区久久久久| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 天堂网av新在线| 国内揄拍国产精品人妻在线| av片东京热男人的天堂| 午夜福利在线在线| 国产成人av教育| 国产午夜福利久久久久久| 欧美在线一区亚洲| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美高清成人免费视频www| 久久久久久久久久黄片| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产精品久久久av美女十八| 成人鲁丝片一二三区免费| 日韩人妻高清精品专区| 国产淫片久久久久久久久 | www.熟女人妻精品国产| 精华霜和精华液先用哪个| 国内精品久久久久久久电影| 日韩精品青青久久久久久| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 日本与韩国留学比较| 国产成人影院久久av| 啦啦啦韩国在线观看视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 成人鲁丝片一二三区免费| www.自偷自拍.com| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 欧美三级亚洲精品| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲熟女毛片儿| 久久亚洲真实| 手机成人av网站| 免费观看人在逋| 亚洲国产欧美网| 长腿黑丝高跟| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 88av欧美| 国产精品一区二区免费欧美| 色吧在线观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲18禁久久av| 一本精品99久久精品77| 午夜免费观看网址| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品一及| 午夜久久久久精精品| 一区福利在线观看| 国产久久久一区二区三区| 美女午夜性视频免费| 久久久国产成人精品二区| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲人成伊人成综合网2020| 成人国产一区最新在线观看| 国内精品久久久久久久电影| 18禁观看日本| 免费在线观看亚洲国产| 2021天堂中文幕一二区在线观| 午夜激情福利司机影院| av天堂在线播放| 在线观看日韩欧美| 好男人电影高清在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 国内精品美女久久久久久| 午夜福利视频1000在线观看| 不卡一级毛片| 久久久国产成人免费| 色哟哟哟哟哟哟| a在线观看视频网站| 一个人看的www免费观看视频| 一夜夜www| 超碰成人久久| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲av片天天在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 免费看光身美女| 香蕉丝袜av| 国产精品亚洲美女久久久| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美日本视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 婷婷亚洲欧美| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| av天堂中文字幕网| 国产精华一区二区三区| av在线蜜桃| 国产淫片久久久久久久久 | 可以在线观看毛片的网站| 国产高清视频在线观看网站| 成人一区二区视频在线观看| 久久久久久久午夜电影| 韩国av一区二区三区四区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲av片天天在线观看| 91av网站免费观看| 曰老女人黄片| 国产成人影院久久av| 亚洲中文字幕日韩| 最近在线观看免费完整版| 欧美日韩黄片免| 午夜精品在线福利| 午夜视频精品福利| 午夜激情欧美在线| 日韩成人在线观看一区二区三区| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲片人在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲精品美女久久av网站| 成人欧美大片| av在线天堂中文字幕| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 久久中文字幕一级| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 久久久久久久精品吃奶| h日本视频在线播放| 免费看十八禁软件| 三级国产精品欧美在线观看 | 村上凉子中文字幕在线| 精品久久蜜臀av无| 一区福利在线观看| 久久热在线av| 99在线人妻在线中文字幕| 国产1区2区3区精品| 亚洲国产欧美人成| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产精品国产高清国产av| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久午夜亚洲精品久久| 成人国产一区最新在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 国产真人三级小视频在线观看| 精品久久久久久成人av| 黄片小视频在线播放| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久久久久久午夜电影| 一个人看视频在线观看www免费 | svipshipincom国产片| 国产精品一及| 美女被艹到高潮喷水动态| 一个人免费在线观看的高清视频| 成人永久免费在线观看视频| 老鸭窝网址在线观看| 午夜两性在线视频| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲精品在线观看二区| 成熟少妇高潮喷水视频| 在线免费观看的www视频| 看免费av毛片| 黄色视频,在线免费观看| 天天一区二区日本电影三级| 日韩高清综合在线| 国产高潮美女av| 国产成人av教育| 久久国产乱子伦精品免费另类| 欧美一级毛片孕妇| 1024香蕉在线观看| 麻豆一二三区av精品| 91av网站免费观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久九九热精品免费| 亚洲 国产 在线| 欧美中文日本在线观看视频| 丰满的人妻完整版| 国产探花在线观看一区二区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国模一区二区三区四区视频 | 久久久国产成人精品二区| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲精品在线美女| 麻豆成人午夜福利视频| 最好的美女福利视频网| 欧美国产日韩亚洲一区| 九色成人免费人妻av| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 成人亚洲精品av一区二区| 国产私拍福利视频在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲七黄色美女视频| 99视频精品全部免费 在线 | 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产久久久一区二区三区| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产成人精品久久二区二区免费| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产99白浆流出| 三级毛片av免费| 国产精品久久久av美女十八| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久久久久国产a免费观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 在线观看午夜福利视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 女人被狂操c到高潮| 丰满的人妻完整版| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久中文字幕一级| 麻豆成人av在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 99re在线观看精品视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品日韩av在线免费观看| 成人一区二区视频在线观看| 日韩三级视频一区二区三区| 国产伦在线观看视频一区| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 俺也久久电影网| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 可以在线观看的亚洲视频| 搡老岳熟女国产| 国产精品一区二区免费欧美| 国产精品日韩av在线免费观看| 免费看光身美女| 美女cb高潮喷水在线观看 | 日本在线视频免费播放| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 搞女人的毛片| 欧美乱妇无乱码| 午夜影院日韩av| 一本精品99久久精品77| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 久久国产精品影院| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 啦啦啦韩国在线观看视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产一区二区三区视频了| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲精品色激情综合| 国产亚洲精品一区二区www| 这个男人来自地球电影免费观看| 久久久久亚洲av毛片大全| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲最大成人中文| 久久久国产成人免费| 91av网一区二区| 淫妇啪啪啪对白视频| 我要搜黄色片| 日本黄大片高清| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲av免费在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久久久国内视频| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美大码av| av在线天堂中文字幕| 中文亚洲av片在线观看爽| 在线看三级毛片| 宅男免费午夜| 国产午夜精品论理片| 日本一二三区视频观看| 亚洲自拍偷在线| 日本一本二区三区精品| 亚洲av第一区精品v没综合| 不卡一级毛片| 成人三级做爰电影| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 女警被强在线播放| 久久久成人免费电影| 亚洲中文日韩欧美视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 午夜免费成人在线视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 嫩草影院精品99| 亚洲熟女毛片儿| 久久久国产成人精品二区| www.999成人在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 麻豆成人午夜福利视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国模一区二区三区四区视频 | 国产人伦9x9x在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 999久久久精品免费观看国产| 99久国产av精品| 国产午夜精品久久久久久| h日本视频在线播放| x7x7x7水蜜桃| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| www日本在线高清视频| 日韩有码中文字幕| 国产精品久久久久久精品电影| 国产熟女xx| 真人一进一出gif抽搐免费| 男人舔女人下体高潮全视频| 一区二区三区国产精品乱码| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 日本与韩国留学比较| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产高清有码在线观看视频| 大型黄色视频在线免费观看| 中文在线观看免费www的网站| 日本免费a在线| ponron亚洲| 伦理电影免费视频| 国产伦人伦偷精品视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| www.熟女人妻精品国产| 91av网站免费观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 高清在线国产一区| 午夜亚洲福利在线播放| 成人av一区二区三区在线看| 国产久久久一区二区三区| 国产精品精品国产色婷婷| 国内精品美女久久久久久| 日韩欧美在线二视频| 久久中文字幕人妻熟女| 两个人的视频大全免费| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲成人久久性| 国产高清videossex| 精品免费久久久久久久清纯| 男人舔女人的私密视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 岛国在线免费视频观看| 99国产极品粉嫩在线观看|