茅蒼術(shù)對(duì)H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

楊嘉永　劉碧麗

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【實(shí)驗(yàn)研究】

茅蒼術(shù)對(duì)H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

楊嘉永劉碧麗

廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部(廈門 361003)

摘要：目的茅蒼術(shù)水煎液和它的含藥血清對(duì)H9c2該細(xì)胞的保護(hù)效果的研究。方法采用雙氧水制造 H9c2 大鼠心肌細(xì)胞的氧化損傷模型，以Vc為陽性對(duì)照，通過對(duì)受損心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀測(cè)、SOD活力檢測(cè)及細(xì)胞相對(duì)凋亡情況的檢測(cè)，測(cè)定茅蒼術(shù)水煎液和它的含藥血清對(duì)H9c2細(xì)胞的保護(hù)效果。結(jié)果不同濃度的茅蒼術(shù)水煎液均使細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)得以改善，外部形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)。高劑量組細(xì)胞生長(zhǎng)較好，中劑量組次之，低劑量組較差；茅蒼術(shù)水煎液組 LDH 釋放量和MDA 含量明顯低于 Vc 對(duì)照組，SOD 活力明顯高于損傷組；細(xì)胞的相對(duì)存活率隨著茅蒼術(shù)水提液的濃度升高而明顯增大，分別為72.37%、66.19%、55.44%，低劑量組的茅蒼術(shù)水提液對(duì) H2O2 損傷的 H9c2 心肌細(xì)胞的保護(hù)作用不明顯。結(jié)論茅蒼術(shù)水提液的保護(hù)作用機(jī)制與增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力、減少自由基和脂質(zhì)過氧化物導(dǎo)致的細(xì)胞膜損傷有關(guān)。

關(guān)鍵詞：茅蒼術(shù)；H9c2心肌細(xì)胞；保護(hù)作用

茅蒼術(shù)Atractylodeslancea為常用中藥，在我國(guó)有悠久的臨床應(yīng)用歷史，因其主要成分揮發(fā)油過量對(duì)人體有明顯的不良作用，因此研究其水溶性成分是當(dāng)務(wù)之急。本研究采用雙氧水制造H9c2大鼠心肌細(xì)胞的氧化損傷模型，以Vc為陽性對(duì)照，測(cè)定茅蒼術(shù)水煎液和它的含藥血清對(duì)H9c2細(xì)胞的保護(hù)效果，以期達(dá)到評(píng)價(jià)其抗氧化作用的效果，找出發(fā)揮抗氧化的藥效物質(zhì)，為茅蒼術(shù)進(jìn)一步藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明提供理論依據(jù)。

1　材料與設(shè)備

1.1實(shí)驗(yàn)儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：MCO-20AIC型，日本三洋SANYO；倒置顯微鏡：CKX31型，日本奧林巴斯OLYMPUS；全自動(dòng)滅菌鍋：ES315型，日本TOMY；高速冷凍離心機(jī)：5811U型，德國(guó)Eppenodorf公司；超純水制備系統(tǒng)：Synergy型，美國(guó)密理博Millipore；水浴鍋：HR-06型，Guohua公司； 10,100,1000 μL微量加樣器：Eppendorf，Germany；酶標(biāo)儀：ELX800，BioTek，USA；H9c2大鼠心肌細(xì)胞株，購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑澳洲胎牛血清：批號(hào)1431602，Gibco；DMEM高糖培養(yǎng)液：批號(hào)NYH0948，Gibco；青鏈霉素混合液(100X)：批號(hào)20140417，Solarbio；0.25%胰蛋白酶：(1：250，25 g)，批號(hào)20140216，Gibco；PBS磷酸鹽緩沖液：0.01 mol·L-1，PH 7.2～7.4，批號(hào)509E024，Solarbio；MTT：批號(hào)1028D005，Solarbio；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒：批 號(hào)分 別為20140416、20140332、20140423，上?；鈱?shí)業(yè)有限公司。

2　實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1茅蒼術(shù)提取物的制備茅蒼術(shù)藥材采自江蘇茅山，陰干備用。準(zhǔn)確稱取粉碎過篩的茅蒼術(shù)，以重蒸水提前浸泡1 h，加水回流提取1 h，紗布過濾，藥渣繼續(xù)提取1 h，合并兩次的濾液并濃縮成浸膏狀，于65℃烘干，得茅蒼術(shù)提取物(每克相當(dāng)于生藥約3.5 g)。稱取以上項(xiàng)已制備好的茅蒼術(shù)提取物約0.2 g，精密稱定，置于小燒杯中，緩慢加入95%乙醇，慢加快攪，至不再有絮狀物析出為止。

2.2分析方法

2.2.1溶液配制PBS緩沖液(PH=7.2)的配制：將一包PBS粉 末溶 于2 L的三 蒸 水里，溶 解，121℃滅30 min，備用。DMEM雙抗培養(yǎng)液：DMEM 500 mL +雙 抗5.5 mL，4℃存放。10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液：胎牛血清10 mL+ DMEM 90 mL，混勻，4℃存放。

2.2.2實(shí)驗(yàn)分組將96孔板中已經(jīng)培育24 h的H9c2細(xì)胞更換新的培養(yǎng)液，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的情況，分組處理：①正常對(duì)照組：用培養(yǎng)液正常培養(yǎng)；②H2O2損傷組：加入H2O2使其終濃度為100 μmol·L-1，作用細(xì)胞2 h；③陽性Vc組：注入Vc液使其最后濃度是500 μg·mL-1；④空白。血清組：培養(yǎng)液中加入空白血清；⑤含藥血清組：培養(yǎng)液中加入含藥血清；⑥高劑量茅蒼術(shù)水提液作用組：加入2.1項(xiàng)下茅蒼術(shù)水煎液使其最后濃度為 500μg·mL-1；⑦中劑量茅蒼術(shù)水提液作用組：加入茅蒼術(shù)水提液使其終濃度為250 μg·mL-1；⑧低劑量茅蒼術(shù)水提液作用組：加入茅蒼術(shù)水提液使其終濃度為100 μg·mL-1。各處理組均為先加入 H2O2損傷2 h，再加入藥物作用24 h。觀察細(xì)胞的形態(tài)，并收集各組培養(yǎng)液，檢測(cè)LDH釋放量，SOD活力，MDA含量及細(xì)胞活力。

2.2.3觀測(cè)指標(biāo)

2.2.3.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀測(cè)

2.2.3.2乳酸脫氫酶(LDH)活力測(cè)定分別收集每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的上層培養(yǎng)液，采用試劑盒說明書的方法測(cè) 定，血 清中LDH的活性以U·L-1表示。

乳酸脫氫酶(LDH)丙酮酸

(公式1)

將測(cè)得的值帶入以下公式，求出LDH的活性值。

LDH 的活性(U·L-1)=(A測(cè)定值-A對(duì)照值)/(A標(biāo)準(zhǔn)值-A空白值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(2 mmol·L-1)× 測(cè)試前樣本稀釋倍數(shù)× 1000

(公式2)

2.2.3.3MDA含量檢測(cè)分別收集各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞培養(yǎng)液，采用試劑盒說明書的方法測(cè)定。

MDA含量(nmol·mL-1)=(A測(cè)定值-A對(duì)照值)/(A標(biāo)準(zhǔn)值-A空白值)× 標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10 nmol·mL-1) × 樣本稀釋倍數(shù)

(公式3)

2.2.3.4SOD 活力檢測(cè)分別收集各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞培養(yǎng)液，采用試劑盒說明書的方法測(cè)定。

SOD活力(U·mL-1)=(A對(duì)照值-A測(cè)定值)/A對(duì)照值÷50%×反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)×樣本測(cè)試前的稀釋倍數(shù)

(公式4)

2.2.3.5細(xì)胞相對(duì)凋亡情況的檢測(cè)采用MTT比色法，用PBS配制MTT，濃度為5 mg·mL-1，在對(duì)細(xì)胞完成各種干預(yù)實(shí)驗(yàn)后，每孔加入MTT 20 μL，連續(xù)培育4 h，最后停止；輕輕的吸走孔里的上清，分別加DMSO液150 μL，振搖10 min，徹底溶解甲瓚；在酶標(biāo)儀的490 nm波長(zhǎng)下，檢測(cè)每孔的A值，將各組所測(cè)得的吸光度值帶入細(xì)胞活力計(jì)算公式，求出各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活力[149]。

細(xì)胞活力(%)=A實(shí)驗(yàn)/A參照×100%

(公式5)

2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響用不同的藥物處理完細(xì)胞之后，將其放在倒置顯微鏡下觀測(cè)：未處理組的細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，成梭形或者無規(guī)則形狀，核是扁圓形或者緊貼細(xì)胞壁；H2O2損傷組和空白血清組細(xì)胞均體積變小，為圓形或者橢圓，細(xì)胞核濃縮，細(xì)胞邊緣模糊，部分發(fā)生溶解；陽性Vc作用組細(xì)胞與H2O2損傷組的相比，貼壁細(xì)胞數(shù)量較多，生長(zhǎng)狀態(tài)較好；相對(duì)于損傷組而言，不同濃度的茅蒼術(shù)水煎液作用組貼壁細(xì)胞數(shù)量較多，且外部形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，說明其生長(zhǎng)狀態(tài)得到了改善；不同劑量茅蒼術(shù)水提液作用組細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)不同，高劑量組細(xì)胞的生長(zhǎng)較好，中劑量組的次之，低劑量組的較差。

2.3.2茅蒼術(shù)及其含藥血清對(duì)心肌細(xì)胞MDA含量、SOD活力及LDH釋放量的影響LDH釋放量、SOD的活力測(cè)定結(jié)果及MDA含量的變化情況見表1，H2O2損傷組細(xì)胞的LDH釋放量和MDA含量明顯增高，分別是正常對(duì)照組的1.38倍、4.31倍，SOD活性顯明下降，為未處理組的34%；而高、中、低劑量茅蒼術(shù)水提液作用組的LDH釋放量和MDA含量都有所降低，LDH釋放量與H2O2損傷組相比分別降低了16.01%、14.80%、8.14%，MDA與H2O2損傷組相比分別降低了28.52%、60.70%、56.36%；高、中、低劑量茅蒼術(shù)水提液作用組的SOD活力都有所升高，SOD與H2O2損傷組相比分別升高了60.27%、48.55%、6.96%；而陽性Vc對(duì)照組LDH釋放量和MDA含量明顯低于損傷組，高于茅蒼術(shù)水提液作用組，SOD活力也是明顯比損傷組高。

2.3.3細(xì)胞相對(duì)凋亡情況每個(gè)處理組細(xì)胞的相對(duì)凋亡率如圖1，以未處理組的相對(duì)存活率為標(biāo)準(zhǔn)，H2O2模型組的損傷率很明顯的升高，為44.34%；茅蒼術(shù)水提液保護(hù)組細(xì)胞的存活率與茅蒼術(shù)水提液成濃度劑量關(guān)系，即細(xì)胞的相對(duì)存活率隨著茅蒼術(shù)水提液的濃度升高而明顯增大，分別為72.37%、66.19%、55.44%，低劑量組的茅蒼術(shù)水提液對(duì)H2O2損傷的H9c2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用不明顯；跟空白參照組比對(duì)，含藥血清組細(xì)胞的生活率也較高，為67.08%；與H2O2模型組比較，正常對(duì)照組、陽性Vc組和茅蒼術(shù)水提液高濃度組成極顯著性差異，含藥血清組和茅蒼術(shù)水提液中劑量組成顯著性差異，其余組差異性不明顯。

組別LDH/U·L-1MDA/nmol·mL-1SOD/U·mL-1正常對(duì)照組280.63±9.069.14±0.1046.54±0.18H2O2模型組388.09±8.111)3)39.44±0.082)4)15.64±0.182)4)陽性Vc對(duì)照組307.29±5.856)13.73±0.116)41.45±0.196)空白血清組350.37±5.931)36.54±0.151)3)29.75±0.491)3)含藥血清組327.11±4.535)23.26±0.145)36.69±0.255)水提液高劑量組325.97±8.225)28.19±0.161)3)39.36±0.136)水提液中劑量組330.65±7.305)15.50±0.151)6)30.40±0.211)3)水提液低劑量組356.51±10.471)17.21±0.161)6)16.81±0.852)4)

注：與正常對(duì)照組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與陽性Vc組比較，3)P<0.05，4)P<0.01；與模型組比較，5)P<0.05，6)P<0.01

圖1　不同處理組細(xì)胞的存活率(與H2O2損傷組比對(duì)，*P<0.05，**P<0.01)

3　討論

本研究利用H9c2細(xì)胞株建立H2O2損傷模型，從細(xì)胞形態(tài)、乳酸脫氫酶、抗氧化以及細(xì)胞凋亡等方面探討茅蒼術(shù)水提液的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，H2O2的損傷作用能使H9c2細(xì)胞皺縮變圓、數(shù)目減少；細(xì)胞膜的透過性變大，導(dǎo)致心肌酶向胞外漏出，培養(yǎng)液中LDH的量明顯變大；同時(shí)發(fā)生的脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)生了大量自由基，培養(yǎng)液中SOD活力降低，MDA含量增大。本實(shí)驗(yàn)以Vc作為保護(hù)心肌細(xì)胞的陽性對(duì)照藥物，旨在對(duì)比觀察不同劑量茅蒼術(shù)水提液的保護(hù)作用。這部分的研究顯示，Vc對(duì)被損壞的心肌細(xì)胞顯現(xiàn)出很好的保護(hù)效果，但本試驗(yàn)中的Vc濃度尚不能完全阻斷H2O2對(duì)心肌細(xì)胞的損傷作用。而3種劑量茅蒼術(shù)水提液預(yù)處理，均能不同程度的改善細(xì)胞形態(tài)，提高細(xì)胞存活率，降低H2O2誘導(dǎo)的LDH的釋放量、提高SOD活力、減少M(fèi)DA含量以及細(xì)胞的凋亡率；并且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，低劑量茅蒼術(shù)水提液可使脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生與積累減少，中劑量茅蒼術(shù)水提液進(jìn)而提高自由基清除能力，尤其對(duì)MDA的含量有明顯的降低作用，高劑量茅蒼術(shù)水提液同時(shí)具有增強(qiáng)抗氧化酶活性的作用。提示茅蒼術(shù)水提液的保護(hù)作用機(jī)制與增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力、減少自由基和脂質(zhì)過氧化物導(dǎo)致的細(xì)胞膜損傷有關(guān)。

本研究建立的細(xì)胞模型比較可靠、簡(jiǎn)單，可用于心肌細(xì)胞的損傷機(jī)制和抗氧化的藥效機(jī)理方面的研究；同時(shí)也初步證實(shí)了茅蒼術(shù)水提液及其含藥血清對(duì)H2O2所致心肌細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用，推測(cè)茅蒼術(shù)含藥血清中的入血成分可能是其發(fā)揮抗氧化作用的重要物質(zhì)之一，提示茅蒼術(shù)含藥血清中的入血成分可能是其藥效物質(zhì)。

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doi:10.3969/j.issn.1003-8914.2016.09.021

文章編號(hào)：1003-8914(2016)-09-1248-03

收稿日期：(本文校對(duì)：劉言言2015-09-17)

Protective Effect of Atractylodes lancea on Oxidative Injury of H9c2 Myocardial Cells

YANG JiayongLIU Bili

(Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Xiamen University, Fujian, Xiamen 361003, China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the protective activity of Atractylodes lancea decoction and its medicated serum on H9c2 cell. MethodsThe H2O2-based oxidative injury model was established by cultivating rat cardiomyocytes of H9c2 in vitro, and the antioxidant activity was evaluated by cell morphology, apoptosis and the effect on SOD. ResultsThe growth state of the cells could be improved by the decoction of the different concentrations of Atractylodes lancea, and the external form was significantly improved. The high dose group cells grew well, and the low dose group was poor. The release amount of LDH and MDA of Atractylodes lancea group were significantly lower than those of the Vc control group, SOD activity was significantly higher than that in the injury group, the relative survival rate of cells with the concentration of aqueous extract of Atractylodes lancea obviously increased, it was 72.37%, 66.19% and 55.44%, respectively. The protective effect of the aqueous extract of the low dose group on the H2O2 damage of H9c2 myocardial cells was not significant. ConclusionThe mechanism of protective effect of water extract of Atractylodes lancea liquid is related to enhancing cellular antioxidant capacity and cell membrane damage caused by reducing free radicals and lipid peroxide.

Key words：Atractylodes lancea; H9c2 myocardial cells; Protective effect