大鼠皮膚成纖維細(xì)胞在低密度培養(yǎng)條件下基質(zhì)金屬蛋白酶9和13基因表達(dá)的抑制

劉譽 楊澤民

摘 要：為探索體外促進原代皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)條件及原代皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化前后兩種狀態(tài)下經(jīng)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）刺激，其MMP基因的表達(dá)情況。利用Wistar大鼠真皮分離出的原代成纖維細(xì)胞為模型，分別以高密度與低密度將細(xì)胞培養(yǎng)于塑料界面，通過Western Blot和qRT-PCR檢測肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達(dá)量；同時經(jīng)TNF-α刺激后，利用qRT-PCR和明膠酶譜檢測高密度與低密度兩種狀態(tài)下MMP-9和MMP-13的表達(dá)及兩種狀態(tài)下MMP-9的活性。發(fā)現(xiàn)大鼠真皮中分離出的原代成纖維細(xì)胞在低密度培養(yǎng)條件下，可以有效地轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，其標(biāo)志物α-SMA顯著上調(diào)；經(jīng)腫瘤壞死因子刺激a，成纖維細(xì)胞在低密度培養(yǎng)條件下MMP-9和MMP-13對TNF-α刺激的響應(yīng)程度較高密度培養(yǎng)時顯著降低。初步表明在大鼠真皮（dermis）中，原代成纖維細(xì)胞體外轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞且MMP-9和MMP-13在肌成纖維細(xì)胞中下調(diào)的現(xiàn)象是細(xì)胞密度依賴型。

關(guān)鍵詞：基質(zhì)金屬蛋白酶；原代成纖維細(xì)胞；密度培養(yǎng)；轉(zhuǎn)分化；腫瘤壞死因子

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-5124（2016）09-0055-06

0 引 言

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一類鋅離子依賴的肽鏈內(nèi)切酶，屬于金屬蛋白酶家族。目前已發(fā)現(xiàn)至少20種MMPs，按照作用底物可分為明膠酶、膠原酶、基質(zhì)溶解酶和膜型基質(zhì)金屬蛋白酶[1]。MMPs在結(jié)構(gòu)上具有較高的同源性，大多數(shù)MMPs都包括前肽結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域和信號結(jié)構(gòu)域等；其中，在MMPs的催化活性中心均發(fā)現(xiàn)Zn2+的存在[2]。

MMPs的表達(dá)具有細(xì)胞、組織特異性，其調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平、表觀遺傳學(xué)水平以及轉(zhuǎn)錄后水平[3]。在MMP基因的啟動子區(qū)，包含多種順式調(diào)節(jié)元件（cis-elements），根據(jù)細(xì)胞所處生理狀態(tài)的不同，多種反式作用因子（trans-activators）如AP-1、PEA3、Sp-1、β-catenin/TCF4及NF-κB被招募到MMP啟動子區(qū)，參與MMP的調(diào)控[4-6]。研究表明，MMP-9啟動子區(qū)高度甲基化能夠介導(dǎo)MMP-9發(fā)生表觀水平沉默，造成MMP-9在轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平下調(diào)[7-8]。除了轉(zhuǎn)錄水平與表觀水平的調(diào)控，MMP的調(diào)控還發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。研究表明，在成纖維細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞中，TGF-β及Hu家族蛋白能夠延長MMPs的mRNA半衰期，進而上調(diào)MMPs的表達(dá)。此外，MMPs蛋白的天然抑制劑TIMPs通過對MMPs的調(diào)節(jié)，與MMPs共同維持胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)[9]。

在之前的研究中表明，伴隨肝臟纖維化的發(fā)生，肝臟星狀細(xì)胞由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)分化為激活狀態(tài)的肌成纖維樣肝星狀細(xì)胞，在肌成纖維樣肝星狀細(xì)胞中，IIa型組蛋白去乙?；福╟alss IIa HDACs）顯著上調(diào)并介導(dǎo)MMPs發(fā)生表觀遺傳學(xué)水平的沉默[10-12]，從而導(dǎo)致胞外基質(zhì)沉積，肝臟纖維化持續(xù)。與肝臟纖維化類似的皮膚增生性瘢痕又稱皮膚纖維化，主要是由胞外基質(zhì)（ECM）過度沉積造成，主要效應(yīng)細(xì)胞為成纖維細(xì)胞（fibroblasts），皮膚成纖維細(xì)胞在纖維化的形成過程中，具有與肝臟星狀細(xì)胞相似的生理特點，如分泌膠原、參與胞外基質(zhì)重構(gòu)，并且兩者均由間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來[13-14]。

為了探索MMPs在皮膚纖維化過程中的表達(dá)變化，本文利用原代大鼠皮膚成纖維細(xì)胞為研究對象，體外建立高密度和低密度培養(yǎng)模型，分別模擬靜息狀態(tài)（正常生理狀態(tài)）和激活狀態(tài)（纖維化狀態(tài)）的成纖維細(xì)胞，并在炎癥因子TNF-α的刺激下，模擬皮膚受到急性損傷，檢測MMP-9和MMP-13的表達(dá)變化，為更好地模擬皮膚損傷和增生瘢痕形成提供新的體外實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物

4周齡大SPF級雄性Wistar大鼠，體重120～150 g，由成都達(dá)碩實驗動物公司提供。

1.1.2 儀器與試劑

倒置顯微鏡（Nikon公司）；垂直電泳裝置、凝膠成像系統(tǒng)及梯度PCR儀（Bio-Rad公司）。DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基購自HyClone公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）購自美國Gemini公司；0.25%胰酶（含EDTA）、結(jié)晶紫染液購于Beyotime公司；1×PBS緩沖液、Trizol購自Invitrogen公司；TNF-α購于R&D公司；細(xì)胞培養(yǎng)級雙抗購自Thermo公司；明膠、Triton X-100購自Sigma公司；PVDF膜購自Bio-Rad公司；兔抗人克隆抗體alpha-SMA購自Abcam公司；兔抗人單克隆抗體Histone H3購自Cell Signal公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自Santa Cruz公司；qRT-PCR試劑盒購自Bio-Rad公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Roche公司。定量PCR引物由北京華大基因研究公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠皮膚原代成纖維細(xì)胞分離與培養(yǎng)

將雄性Wistar大鼠斷頸處死，在75%乙醇（ν∶ν）中浸泡5～10 min。在無菌條件下，剪取大鼠背部皮膚，用眼科剪刀去除皮下脂肪組織，1×PBS緩沖液反復(fù)漂洗后，將皮膚組織塊剪切成2 cm×2 cm的小塊，置于50 mL含有2×雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，4 ℃過夜孵育。隨后在培養(yǎng)皿內(nèi)將組織塊剪切成0.5 mm3的小塊，加入適量0.5%中性蛋白酶（dispase）在37 ℃，5% CO2條件下孵育2 h，去除表皮，將剩余的組織200 g 4 ℃離心5 min，棄上清。加入適量0.3%胰蛋白酶，37 ℃，5% CO2孵育1 h，用含有10%FBS DMEM完全培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)，最后用85 μm細(xì)胞篩去除多余的組織碎片，收集細(xì)胞懸液，500 g 4 ℃離心5 min，用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。通過計數(shù)后，按照2×104個細(xì)胞/mL的密度接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入10.0 mL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一般成纖維細(xì)胞會在24 h內(nèi)貼壁，2～3 d后可以觀察到明顯的紡錘形。當(dāng)原代皮膚成纖維細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時，此時的細(xì)胞計為P0，后續(xù)進行常規(guī)傳代培養(yǎng)和凍存保種。

1.2.2 建立成纖維細(xì)胞密度培養(yǎng)模型

離體培養(yǎng)的原代大鼠皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)至第2代時，分別建立高密度與低密度培養(yǎng)模型。首先利用胰蛋白酶將原代大鼠皮膚成纖維細(xì)胞完全消化，加入適量完全培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)，800 g離心5 min，收集細(xì)胞。為研究MMP基因在不同密度成纖維細(xì)胞中的變化情況，將細(xì)胞密度調(diào)整為103個細(xì)胞/mL（低密度培養(yǎng)）和105個細(xì)胞/mL（高密度培養(yǎng)），分別接種于6孔板，加入10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 d，進行后續(xù)實驗。

1.2.3 結(jié)晶紫染色與炎癥因子刺激

成纖維細(xì)胞在高密度和低密度條件下培養(yǎng)4 d后，棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷的1×PBS緩沖液漂洗2次，加入預(yù)冷的甲醇，室溫固定10 min。再用預(yù)冷1×PBS緩沖液漂洗2次，隨后加入結(jié)晶紫染液，室溫孵育30 min后，用1×PBS漂洗細(xì)胞，去除多余的染液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。與此同時，向高密度和低密度培養(yǎng)條件下的成纖維細(xì)胞分別加入10 ng/mL TNF-α刺激24 h，收集細(xì)胞，檢測MMP-9和MMP-13的表達(dá)。

1.2.4 qRT-PCR與半定量PCR

按照Trizol說明書方法提取細(xì)胞總RNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳初步檢測RNA的完整性，利用分光光度計檢測RNA濃度。取1.0μg總RNA，按照Roche反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，稀釋5倍后，進行實時熒光定量PCR檢測目的基因的表達(dá)水平。待檢測基因的引物如下：MMP-9上游引物5′-CAGACCA

AGGGTACAGCCTGTT-3′，下游引物5′-AGCGCATGG

CCGAACTC-3′；MMP-13上游引物5′-GCCCTATCC

CTTGATGCCATT-3′，下游引物5′-ACAGTTCAGGCT

CAACCTG-3′；α-SMA上游引物5′-CATCCGACCT

TGCTAACGGA-3′，下游引物5′-CATCTCCAGAGTC

CAGCACAATAC-3′；GAPDH上游引物：5′-CCTGG

AGAAACCTGCCAAGTAT-3′，下游引物5′-CTCGGC

CGCCTGCTT-3′。qRT-PCR反應(yīng)體系為20.0 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，總共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計算相對表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 Western Blot檢測

將高密度培養(yǎng)條件和低密度培養(yǎng)條件的細(xì)胞培養(yǎng)基棄盡，用預(yù)冷的PBS漂洗2～3次，用細(xì)胞刮輕柔將細(xì)胞盡數(shù)刮下，4 ℃ 800 g離心5 min收集細(xì)胞，用微量移液器將殘留的PBS吸盡，按6孔板每孔100 μL的量加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液，冰上孵育30 min，裂解細(xì)胞以抽提細(xì)胞總蛋白，期間每10 min渦旋震蕩30 s。裂解產(chǎn)物4 ℃15 000 g離心30 min，收集上清，即為細(xì)胞總蛋白。利用BCA 法進行蛋白濃度測定，取100 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至0.45 μm PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后分別加入一抗：anti-α-SMA（1∶1 000）、anti-Histon H3（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。PBST洗膜，10 min×3次，分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔的二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，PBST漂洗15 min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，Bio-Rad全自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以Histon H3作為內(nèi)參。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 明膠酶譜

收集高密度與低密度培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基，于4 ℃、10 000 g離心5 min，去除多余的細(xì)胞碎片，收集上清-80 ℃保存待用。將非還原性5×SDS-PAGE緩沖液與培養(yǎng)基按照一定比例混合進行樣品制備。配制含0.1%明膠的10%SDS聚丙烯酰胺凝膠，待膠凝固后，每孔上樣18.0 μL，100V，2 h進行凝膠電泳。電泳結(jié)束后，取出凝膠，置于2.5% Triton X-100溶液中室溫孵育1 h，隨后去離子水漂洗3次，再將凝膠置于明膠酶緩沖液（5 mmol/L CaCl2，

150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris，pH 7.5）37 ℃孵育16 h，最后進行高馬斯亮藍(lán)R-250染色觀察分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD）表示，數(shù)據(jù)分析通過Prism software V6（GraphPad軟件）完成。數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用不成對雙尾Students t檢驗，數(shù)據(jù)顯著性差異表示為“*”，“**”，分別代表P<0.05，P<0.01。所有實驗均重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 高密度與低密度條件下成纖維細(xì)胞的形態(tài)

皮膚增生性瘢痕的形成過程中，靜息狀態(tài)的成纖維細(xì)胞在長期慢性炎癥作用下轉(zhuǎn)分化為具有收縮能力的肌成纖維細(xì)胞。為了模擬這兩種不同生理狀態(tài)的細(xì)胞類型，將原代大鼠皮膚成纖維細(xì)胞按照不同密度培養(yǎng)后，通過結(jié)晶紫染色發(fā)現(xiàn)，與高密度培養(yǎng)相比，低密度培養(yǎng)的原代大鼠皮膚成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出肌成纖維細(xì)胞的形態(tài)特征（見圖1），胞質(zhì)濃厚，細(xì)胞體積顯著變大。

2.2 低密度培養(yǎng)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞

皮膚增生性瘢痕形成實質(zhì)是纖維化的形成過程。根據(jù)之前對肝臟纖維化的研究，觀察到了具有成纖維細(xì)胞特性的肝臟星狀細(xì)胞在體外發(fā)生轉(zhuǎn)分化的過程[15]。在此基礎(chǔ)上，為了進一步驗證低密度培養(yǎng)條件下的大鼠原代皮膚成纖維細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，利用實時熒光定量PCR和Western Blot檢測轉(zhuǎn)分化后肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物alpha-平滑肌激動蛋白（α-SMA）的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與高密度培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞相比，低密度培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中α-SMA在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均顯著上調(diào)（見圖2），具有顯著性差異（P<0.05），表明低密度培養(yǎng)條件下的原代大鼠皮膚成纖維細(xì)胞具有肌成纖維細(xì)胞的特性，其標(biāo)志物α-SMA顯著上調(diào)，與之前兔子角膜成纖維細(xì)胞中的研究報道相吻合[16]。

2.3 MMP-9和MMP-13在肌成纖維細(xì)胞中下調(diào)

皮膚增生性瘢痕是損傷修復(fù)后過度生長的瘢痕組織，其主要細(xì)胞成分是肌成纖維細(xì)胞。在皮膚損傷初期，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）表達(dá)量急劇上調(diào)，但是隨著瘢痕的形成，MMP基因逐漸發(fā)生沉默。在此基礎(chǔ)上，再次構(gòu)建兩種密度培養(yǎng)模型，模擬正常條件下的成纖維細(xì)胞（高密度培養(yǎng)）和慢性損傷后形成的肌成纖維細(xì)胞（低密度培養(yǎng)），通過半定量PCR證明肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA顯著上調(diào)（見圖3（a））。其次，在兩種密度培養(yǎng)條件下，分別設(shè)置10 ng/mL TNF-α處理組和空白對照組，24 h后通過實時熒光定量PCR檢測MMP-9和MMP-13的表達(dá)。結(jié)果表明，經(jīng)TNF-α處理后，MMP-9的轉(zhuǎn)錄水平在高密度培養(yǎng)條件下，較對照組顯著上調(diào)（見圖3（b））；而在低密度培養(yǎng)條件下，加入TNF-α后，MMP-9的轉(zhuǎn)錄水平較對照組沒有顯著變化（見圖3（b））。與此同時，原代大鼠皮膚成纖維細(xì)胞在高密度培養(yǎng)條件下，經(jīng)TNF-α處理后MMP-13的mRNA表達(dá)量較對照組顯著上調(diào)（見圖3（b））；而在低密度培養(yǎng)條件下，雖然TNF-α也能夠誘導(dǎo)MMP-13的mRNA表達(dá)上調(diào)，但上調(diào)程度低于高密度培養(yǎng)時（見圖3（b））。

隨后，利用明膠酶譜實驗對MMP-9的活性進行了檢測，結(jié)果表明，高密度培養(yǎng)條件下成纖維細(xì)胞經(jīng)TNF-α刺激后，MMP-9的活性較空白對照組顯著上調(diào)（見圖3（c））；而在低密度培養(yǎng)條件下，經(jīng) TNF-α刺激后，MMP-9的活性并沒有顯著變化。此外，與高密度相比，低密度培養(yǎng)條件下TNF-α并不能誘導(dǎo)MMP-9的活性上升。隨后利用IPP軟件進行灰度掃描，統(tǒng)計MMP-9的相對光密度，結(jié)果與明膠酶譜完全一致（見圖3（c））。因此初步表明原代大鼠皮膚成纖維細(xì)胞在高密度培養(yǎng)條件下，TNF-α能夠誘導(dǎo)MMP-9和MMP-13發(fā)生顯著的上調(diào)且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）；在低密度培養(yǎng)條件下TNF-α不能誘導(dǎo)MMP-9和MMP-13發(fā)生顯著變化。

3 討 論

成纖維細(xì)胞（Fibroblast）是瘢痕形成的主要效應(yīng)細(xì)胞，創(chuàng)傷發(fā)生后間充質(zhì)細(xì)胞或靜止的纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞，參與傷口修復(fù)[17]。本實驗利用大鼠原代皮膚成纖維細(xì)胞作為研究對象，通過構(gòu)建高密度培養(yǎng)和低密度培養(yǎng)模型，分別模擬成纖維細(xì)胞的靜息狀態(tài)和激活狀態(tài)，初步解釋了成纖維細(xì)胞間的相互作用是誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的一個重要因素，但是否存在其他因素也可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，如培養(yǎng)基中的成分、血清中的生長因子以及成纖維細(xì)胞自分泌的其他細(xì)胞因子等還有待深入研究。有報道證明[18]，成纖維細(xì)胞在受到刺激后能夠大量分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β），TGF-β又可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化，促進纖維化的進程。

研究表明，具有持續(xù)增長活性的細(xì)胞，如骨髓細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞，其基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)量通常非常高，具有促進細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和細(xì)胞分化的功能[19-20]。在急性肝臟損傷和急性皮膚損傷初期，MMPs基因的表達(dá)量非常高，隨著傷口愈合、增生瘢痕的形成，MMPs基因逐漸發(fā)生沉默。Qin等[15]利用大鼠肝臟星狀細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9和MMP-13的沉默發(fā)生在表觀遺傳學(xué)水平，是由組蛋白去乙?；?（HDAC4）招募到MMP-9和MMP-13啟動子區(qū)域，抑制了MMP-9和MMP-13的轉(zhuǎn)錄活性。

在模型中，低密度培養(yǎng)下的皮膚成纖維細(xì)胞能夠自發(fā)的轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，并且在炎癥因子TNF-α的刺激下，與高密度培養(yǎng)相比MMP-9和MMP-13不再產(chǎn)生應(yīng)答。在皮膚成纖維細(xì)胞中，MMP-9和MMP-13的沉默很可能是由HDAC4或該家族其他成員引起，HDACs通過去乙?；饔?，造成染色質(zhì)濃縮，MMP基因的轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)，無法降解胞外基質(zhì)，最終促進皮膚纖維化的發(fā)展。此外，MMPs啟動子區(qū)的甲基化也可能是引起MMPs基因沉默的重要原因，甲基化造成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，轉(zhuǎn)錄因子AP-1無法招募到MMPs啟動子區(qū)，造成MMPs轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平下調(diào)，促進胞外基質(zhì)堆積?；贛MPs的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平和表觀遺傳學(xué)水平，因此可以通過染色質(zhì)免疫共沉淀與高通量測序相結(jié)合的方法（ChIP-Seq），在全基因組水平檢測與MMPs基因啟動子相互作用的轉(zhuǎn)錄因子，篩選出可能調(diào)控MMPs基因沉默蛋白因子。

4 結(jié)束語

本文在體外初步探索了皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的條件，并且測定了MMP-9和MMP-13的表達(dá)變化，為皮膚損傷和增生性瘢痕的發(fā)生和發(fā)展的研究提供了新的思路。

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（編輯：莫婕）