三疣梭子蟹細胞周期蛋白H基因克隆及其在卵巢發(fā)育中的表達分析?

賈復龍， 孟憲亮， 劉　萍??， 李　健， 高保全， 高天翔， 宋　娜

(1. 中國海洋大學水產學院，山東 青島 266003；2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所農業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室，山東 青島 266071；3. 青島海洋科學與技術國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產出過程功能實驗室，山東 青島 266071)

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三疣梭子蟹細胞周期蛋白H基因克隆及其在卵巢發(fā)育中的表達分析?

賈復龍1,2,3， 孟憲亮2,3， 劉萍2,3??， 李健2,3， 高保全2,3， 高天翔1， 宋娜1

(1. 中國海洋大學水產學院，山東 青島 266003；2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所農業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室，山東 青島 266071；3. 青島海洋科學與技術國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產出過程功能實驗室，山東 青島 266071)

摘要：Cyclin H作為細胞周期調控活動中的關鍵因子，通過與相應的細胞周期蛋白依賴性激酶(Cdks)結合來調控細胞周期中的各個環(huán)節(jié)，而三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)卵巢發(fā)育過程中存在旺盛細胞分裂活動的階段，關于其卵巢發(fā)育的分子機制研究依舊較少。本實驗通過SMART RACE方法，獲得三疣梭子蟹cyclin H基因cDNA序列全長。并通過實時熒光定量PCR對其進行三疣梭子蟹卵巢發(fā)育相關的表達分析。結果發(fā)現，基因全長1 077 bp，開放閱讀框(ORF)、5’及3’非編碼區(qū)(UTR)長度分別為999、31和46 bp。預測編碼一個包含332個氨基酸，分子量、等電點分別為38.89和 6.20kDa的蛋白質，蛋白序列包含一個周期蛋白盒保守結構域。同源分析表明，三疣梭子蟹Cyclin H蛋白序列其他甲殼動物有著較高的同源性，與擬穴青蟹(Scylla paramamosain)和斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)的同源性分別為95%和80%。表達分析后結果顯示，cyclin H基因在卵巢中的表達量最高且在Ⅰ期和Ⅱ期卵巢中的表達量顯著高于其他卵巢發(fā)育時期，去眼柄后該基因在卵巢中的表達量于第4天達到最大值且顯著高于對照組，呈現先升高后降低的趨勢(P<0.05)。研究結果為深入開展三疣梭子蟹和其他甲殼動物性腺發(fā)育調控研究提供了重要信息。

關鍵詞：三疣梭子蟹； cyclin H； 基因克??； 去眼柄； 基因表達； 卵巢

引用格式：賈復龍， 孟憲亮， 劉萍， 等. 三疣梭子蟹細胞周期蛋白H基因克隆及其在卵巢發(fā)育中的表達分析[J]. 中國海洋大學學報(自然科學版), 2016, 46(7): 62-69.

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三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)甲殼綱(Crustacea)十足目(Decapoda)梭子蟹科(Portunidae)梭子蟹屬(Portunus)，廣泛分布于中國、日本、韓國等近海水域，是中國沿海的重要經濟蟹類[1]。近年來，三疣梭子蟹的繁殖生物學研究已經取得了很大的進步。吳旭干等通過對東海三疣梭子蟹第一次卵巢發(fā)育期間卵巢外部特征及組織學變化等研究后將三疣梭子蟹第一次卵巢發(fā)育分為6期[2]。賈磊等在對越冬和抱卵期間三疣梭子蟹的卵巢發(fā)育進行研究后發(fā)現，親蟹在越冬期間卵巢發(fā)育不顯著，而抱卵期間發(fā)育顯著[3]。謝熙在對三疣梭子蟹FAMeT和MIH基因研究后發(fā)現，FAMeT基因與三疣梭子蟹卵巢發(fā)育密切相關，MIH基因表達量與卵巢發(fā)育呈顯著負相關[4]。而有關甲殼動物卵巢發(fā)育的分子機制研究依然很少[2,5-6]

1980年代初，Tim Hunt等在對海膽進行早期胚胎發(fā)育的研究中發(fā)現，細胞中存在一種隨細胞周期變化而改變的蛋白，這就是細胞周期蛋白(Cyclins)。而Cyclin H作為CAK的調節(jié)亞基，可以通過和Cdk7結合后磷酸化Cdks[7]，從而激活真核細胞周期調控的關鍵因子——成熟促進因子(Maturation or M-phase promoting factor, MPF)[8]。細胞周期蛋白都含有一段長約為100個氨基酸的高度保守同源序列，稱為周期蛋白盒，憑此結構域與Cdks的PSTAIRE區(qū)結合，用于激活MPF。此外，有研究表明Cyclin H也是TFⅡH的亞基之一而TFⅡH也在細胞周期調控、DNA修復和轉錄中發(fā)揮著重要的作用[9]。韓坤煌在對擬穴青蟹cyclinH基因在卵巢各個不用發(fā)育階段的熒光定量PCR研究發(fā)現，其表達呈現一定上升趨勢，且在Ⅵ期卵巢中表達量最高[10]。斑節(jié)對蝦cyclinH基因在卵巢發(fā)育Ⅱ期表達量呈現峰值且顯著高于其他時期[11]。Cyclin B、cdc2作為MPF的組成部分在甲殼動物中已有一些研究，在有著旺盛細胞分裂活動的卵巢組織中，中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)、鋸緣青蟹(Scyllaserrata)、斑節(jié)對蝦cyclin B和cdc2基因都有著很高的表達量[12-14]，并在不同卵巢發(fā)育時期表達量也有顯著差異[14-16]。而cyclin H作為MPF激活過程必不可少的部分，隨卵巢發(fā)育是否也會有相似的表達量的改變，值得研究。

本實驗使用SMARTTMRACE的方法，獲得了三疣梭子蟹cyclinH基因的cDNA序列全長，并通過qRT-PCR技術分析了該基因在三疣梭子蟹各組織以及卵巢發(fā)育不同時期的差異表達狀況；同時還通過去除眼柄探究該基因在去除眼柄后卵巢組織中表達量改變。研究結果將為三疣梭子蟹以及其他甲殼動物性腺發(fā)育調控機制研究提供幫助。

1　材料與方法

1.1 材料

實驗所用三疣梭子蟹取自本實驗室昌邑市養(yǎng)殖基地戶外養(yǎng)殖池，于周轉箱(560 mm×360 mm×280 mm)中暫養(yǎng)7 d(周轉箱通過使用3塊中間相通的PVC板分隔，每個周轉箱6個小格每隔一只)。水溫(20±2)℃、鹽度33，pH 8.2，使用充氣泵充氧，每天上午及傍晚投喂蛤蜊肉，每天下午清除箱底排泄物及食物殘渣并換去周轉箱原水量的1/3。

Trizol Reagen試劑、SMARTTMRACE Amplification Kit試劑盒、DNA膠回收試劑盒、SYBR PremixExTaqTMⅡ熒光定量試劑盒、PrimeScript RT reagent Kit、PMD18-T載體和Dh1α感受態(tài)細胞分別購自Invitrogen公司、Clontech公司、生工生物工程(上海)股份有限公司、TaKaRa公司。

不同卵巢發(fā)育時期樣品采集通過于2014年7月至2015年3月每月一次在海豐水產養(yǎng)殖責任有限公司進行連續(xù)取樣，參照吳旭干等對三疣梭子蟹卵巢的分期方法[2]，首先通過對卵巢外部特征進行初步分期，初步分期后進行切片HE染色后顯微鏡下觀察各樣品組織學特征，從而進行最終卵巢時期的確定從中隨機選取各發(fā)育時期5個樣品。

1.2 三疣梭子蟹總RNA提取及cDNA 的合成

通過Trizol試劑參照說明書分別提取卵巢，精巢，肝胰腺，鰓，肌肉，心臟，腦神經節(jié)，胸神經節(jié)，眼柄，血淋巴，胃和腸組織的總RNA，用紫外分光光度計與瓊脂糖凝膠電泳等方式對提取總RNA的質量進行檢測。選取質量及完整性較好的精巢、卵巢組織總RNA等量均勻混合，按照SMARTTMRACE Amplification Kit說明書的方法合成3’和5’RACE的cDNA第一鏈。

1.3 三疣梭子蟹cyclinH基因全長cDNA的克隆及測序

依據三疣梭子蟹cyclinH基因的EST序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計3’和5’RACE引物(表1)后由公司合成。3’和5’末端擴增使用Advantange 2 PCR Kit進行，參照RACE說明書，引物CyclinH-3’-1 和CyclinH-5’-1分別和引物UPM配對，進行cyclinH基因cDNA 3’及5’末端擴增。PCR反應程序：94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)(見表1)。

表1　本實驗過程中所用到的引物序列

擴增產物參照核酸凝膠回收試劑盒經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后切膠回收目的片段，將得到的目的片段參照PMD18-T說明書與PMD18-T連接，之后將連接產物轉入Dh1α，經涂板過夜培養(yǎng)后，將通過藍白斑篩選的菌落挑出于AMP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h后經菌液PCR及瓊脂糖凝膠電泳檢測后送去測序。

1.4cyclinH基因的生物信息學分析

利用VecScreen(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/)在線去掉載體留下目的片段序列，然后使用ContigExpress Project軟件與三疣梭子蟹cyclinH基因EST序列拼接后得到三疣梭子蟹cyclinH基因cDNA序列全長。通過使用EditSeq預測開放閱讀框(ORF)，并對其進行氨基酸序列翻譯。將得到的三疣梭子蟹cyclinH基因EditSeq翻譯得到的氨基酸序列通過BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行同源性比對。利用ExPASy(http://web.expasy.org/compute_pi/)進行分子量及等電點的預測，利用InterproScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html)進行蛋白質功能結構域分析，利用NetPhos 2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進行蛋白質磷酸化位點分析，采用PSIPRED Protein StructurePredictionServer(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)進行二級結構預測，將Genbank中下載其他物種Cyclin H氨基酸序列和三疣梭子蟹Cyclin H氨基酸序列一起使用DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對，利用MEGA 5.0軟件對cyclinH基因構建NJ的系統(tǒng)進化樹。

1.5 去眼柄實驗

將暫養(yǎng)7 d交配后雌蟹隨機分為3組：對照組、去單側眼柄組、去雙側眼柄組，每組40只。去眼柄方法采用燒紅的鑷子緊捏三疣梭子蟹眼柄龐大處基部3s，之后放入單獨的小格中，防止打斗。于去眼柄后1、4、7和10 d每組分別取5只三疣梭子蟹卵巢，立即放入液氮中保存，用于RNA提取。

1.6 三疣梭子蟹cyclinH基因的表達分析

每個卵巢發(fā)育時期取5只健康三疣梭子蟹的卵巢組織作為平行，另取5只健康三疣梭子蟹分別取卵巢，精巢，鰓，胃，腸，肝胰腺，胸神經節(jié)，腦神經節(jié)，血淋巴，眼柄，心臟，肌肉等組織，于液氮中冷凍保存，用于RNA的提取。Trizol試劑提取各組織總RNA，并使用PrimeScript RT reagent Kit 反轉錄合成cDNA。

根據三疣梭子蟹cyclinH和β-actin基因開放閱讀框cDNA序列，由公司分別設計合成1對熒光定量引物(β-actin-F和β-actin-R、Cyclin H-F和Cyclin H-R)(見表1)，參照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說明書對三疣梭子蟹不同卵巢發(fā)育時期的卵巢組織，及三疣梭子蟹鰓，胃，腸，肝胰腺，胸神經節(jié)，腦神經節(jié)，血淋巴，眼柄，心臟，肌肉等組織中cyclinH基因的相對表達量進行分析。參照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說明書的方法于ABI7500儀器上樣分析，反應完成后結果采用2-ΔΔCt法計算，并對結果利用SPSS19.0軟件進行差異顯著性等統(tǒng)計學分析(P<0.05表示差異顯著，用小寫字母a、b、c、d、e、f、g標記，存在相同字母表示差異不顯著，字母完全相同表示差異顯著)。

2　結果

2.1 三疣梭子蟹cyclinH基因的獲得及其序列分析

將抽提得到的總RNA，經紫外分光光度計分析后發(fā)現其OD260nm/OD280nm均在1.9～2.0之間；在進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后發(fā)現， 28S和18S rRNA條帶清晰完整，這兩部分結果能夠說明實驗所用總RNA質量較好，可用于RACE模板合成。參照SMARTTMRACE Amplification Kit說明書方法合成的3’和5’RACE的cDNA第一鏈為模板，使用特異性引物CDK7-5’-1和CDK7-3’-1分別于通用引物UPM配對進行5’和3’末端RACE擴增，實驗重復5次，所得產物經測序以及拼接后得到三疣梭子蟹cyclinH基因cDNA全長序列，GenBank登錄號KT025877。該基因cDNA全長1 077 bp，包含開放閱讀框99bp、5’端非編碼區(qū)(UTR)31bp和3’非編碼區(qū)46bp。3’末端有多聚腺苷酸(PolyA)尾，未發(fā)現多聚腺苷酸加尾信號(見圖1)。

圖1　三疣梭子蟹cyclin H基因核苷酸序列及其推導的氨基酸序列

經氨基酸序列分析得知，三疣梭子蟹cyclinH基因編碼一個由332個氨基酸組成的蛋白質；預測分子量為38.89 kDa，理論等電點為6.20；理論磷酸化位點14個，其中絲氨酸(Ser)12個，蘇氨酸(Thr12)1個，酪氨酸(Tyr125)1個；BLAST比對發(fā)現其氨基酸序列中包含保守周期蛋白盒(aa56-143)；理論糖基化位點2個(N-202，N-299)(見圖2)。

圖2　三疣梭子蟹Cyclin H 蛋白二級結構的預測

2.2 三疣梭子蟹cyclinH基因同源性分析

通過BLAST比對三疣梭子蟹cyclinH基因編碼的氨基酸序列，發(fā)現該序列與擬穴青蟹cyclinH基因的同源性最高，為95%；與其他物種如、熊蜂(Bombusterrestris)、隆頭蛛(Stegodyphusmimosarum)、長牡蠣(Crassostreagigas)和小家鼠(Musmusculus)的同源性分別為80%、55%、48%、43%和42%。將三疣梭子蟹CyclinH基因與擬穴青蟹、斑節(jié)對蝦、小家鼠、海蠕蟲(Capitellateleta)、熊蜂、斑馬魚(Daniorerio)、隆頭蛛、智人(Homosapiens)、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)和非洲爪蟾(Xenopustropicalis)的Cyclin H氨基酸序列比對發(fā)現Cyclin H的氨基酸序列物種間相對保守，特別是周期蛋白盒具有很高的保守性(見圖3)。利用MEGA5.0軟件，采用鄰位相接法(Neighbor Joining)將三疣梭子蟹cyclinH基因與其他物種cyclinH基因構建系統(tǒng)進化樹，進化樹分為2大類群，分別為脊椎動物和無脊椎動物，三疣梭子蟹和擬穴青蟹緊密聚合為一枝，之后和斑節(jié)對蝦聚為一枝，然后和昆蟲綱的熊蜂聚為一枝，最后和蛛形綱的隆頭蛛聚為無脊椎動物的一枝(見圖4)。

2.3 三疣梭子蟹cyclinH基因表達分析

利用Real-time PCR分析了三疣梭子蟹cyclinH基因在不同組織的表達分布特征，結果顯示，cyclinH基因在鰓，胃，腸，肝胰腺，胸神經節(jié)，腦神經節(jié)，血淋巴，眼柄，心臟和肌肉等多組織中均有表達，其中性腺(卵巢、精巢)中的表達量顯著高于其他組織，血淋巴中表達量最少(見圖5)。在對三疣梭子蟹6個卵巢發(fā)育時期的卵巢組織中cyclinH基因表達特征分析后發(fā)現，cyclinH基因在Ⅱ期卵巢中表達量顯著高于其他時期，其次是Ⅰ期卵巢，且Ⅲ～Ⅴ期表達水平呈下降趨勢(見圖6)。在對去眼柄后三疣梭子蟹卵巢組織中cyclinH基因表達分析后發(fā)現，去眼柄后第1、4天去眼柄組都顯著高于對照組；第10天cyclinH表達量去雙側眼柄組顯著低于去單側眼柄組，顯著高于對照組(見圖7)(P<0.05)。

(周期蛋白盒用粗線框標出。各物種Cyclin H序列登錄號：擬穴青蟹(ACL81559.1)、斑節(jié)對蝦(AGP03382.1)、熊蜂(XP_003400032.1)、黑腹果蠅(NP_524207.1)。The Cyclin box was marked with thick box. GenBank accession numbers of each species Cyclin H gene were as follows:S.paramamosain(ACL81559.1),P.monodon(AGP03382.1),Bombusterrestris(XP_003400032.1),Drosophilamelanogaster(NP_524207.1).)

圖3三疣梭子蟹Cyclin H基因推導氨基酸序列與其他物種Cyclin H氨基酸序列比對

Fig.3Multiple alignments ofP.trituberculatusCyclin H gene with Cyclin H in other species

(各物種Cyclin H氨基酸序列GenBank登錄號：擬穴青蟹(ACL81559.1)、斑節(jié)對蝦(AGP03382.1)、熊蜂(XP_003400032.1)、黑腹果蠅(NP_524207.1)、隆頭蛛(KFM58496.1)、斑馬魚(ABB97083.1)、非洲爪蟾(NP_001016256.1)、小鼠(NP_075732.1)、人(AAA57006.1)。GenBank accession numbers of each speciescyclinHgene were as follows:S.paramamosain(ACL81559.1),P.monodon(AGP03382.1),Bombusterrestris(XP_003400032.1),Drosophilamelanogaster(NP_524207.1),Stegodyphusmimosarum(KFM58496.1),Daniorerio(ABB97083.1),Xenopus(Silurana)tropicalis(NP_001016256.1),Musmusculus(NP_075732.1),Homosapiens(AAA57006.1).)

圖4基于Cyclin H氨基酸序列的NJ進化樹

Fig.4NJ tree based on Cyclin H amino acids

圖5　三疣梭子蟹cyclin H基因在不同組織中的表達分布狀況

圖6　 Cyclin H基因在三疣梭子蟹不同發(fā)育時期卵巢組織中的表達

圖7　去眼柄后三疣梭子蟹卵巢中cyclin H基因的表達情況

3　討論

Cyclin H作為CAK的調節(jié)亞基，通過結合Cdk7，磷酸化Cdks，從而調節(jié)細胞周期[8]。cyclinH基因在其他物種中已有較多研究，而在甲殼動物中的研究依然很少。本研究通過克隆得到的三疣梭子蟹cyclinH基因與其他物種細胞周期蛋白相同都含有一段約100個氨基酸的保守序列，稱之為周期蛋白盒，參與和Cdks的PSTAIRE區(qū)結合，同時也是周期蛋白的標志[14]。有研究表明CAK的活性不僅能通過Cdk7的自身磷酸化和去磷酸化來調節(jié)活性，同時Cyclins是磷蛋白，可以通過磷酸化和去磷酸化作用來調節(jié)CAK的活性[15]。蛋白激酶Ck2可以通過磷酸化Cyclin H的相應蘇氨酸磷酸化位點，從而激活CAK[16]。本研究通過在線預測發(fā)現三疣梭子蟹Cyclin H包含一個蘇氨酸磷酸化位點(Thr12)，而Thr12是否是蛋白激酶Ck2的識別位點還有待進一步研究。對三疣梭子蟹Cyclin H二級結構及空間結構進行預測結果顯示其主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成，這與擬穴青蟹[10]和人類的Cyclin H[17]結構相似。

Cyclin H作為細胞周期調控的關鍵因子在細胞分裂較活躍的組織中應有較高的表達量。本研究通過對三疣梭子蟹cyclinH基因進行RT-PCR后發(fā)現，cyclinH基因在三疣梭子蟹卵巢，精巢中表達顯著高于其他組織，而性腺正是三疣梭子蟹成熟過程中細胞分裂最旺盛的組織，這也印證了cyclinH基因在細胞周期中具有十分重要的作用。

在對三疣梭子蟹卵巢不同發(fā)育階段卵巢組織進行RT-PCR分析后發(fā)現，Ⅰ、Ⅱ期卵巢的表達量顯著高于其他時期，與斑節(jié)對蝦表達模式類似[18]。參照吳旭干等對三疣梭子蟹卵巢發(fā)育分期方法，Ⅰ、Ⅱ期卵巢發(fā)育以有絲分裂為主來增加卵母細胞數量。Ⅲ期，Ⅳ期以卵黃積累為主，細胞分裂活動減弱。從我們的結果中可以看出，Ⅲ期，Ⅳ期卵巢組織中cyclinH基因表達量逐步降低。而Ⅵ期卵巢組織正為第二次卵巢發(fā)育作準備，與Ⅰ、Ⅱ期卵巢組織相似，存在旺盛的細胞分裂活動，cyclinH基因的高表達也進一步印證了cyclinH在卵巢發(fā)育過程中扮演重要角色。由卵巢不同時期cyclinH基因表達模式可以看出，三疣梭子蟹cyclinH參與了卵巢發(fā)育過程中細胞分裂活動，并在卵巢發(fā)育過程中占有十分重要的地位。

去眼柄作為一種誘導甲殼動物卵巢發(fā)育的常用方式，已經有較多研究[19-24]。但是去眼柄誘導卵巢發(fā)育的分子機制依然研究較少。Okumura等報道稱，在去除單側眼柄導致日本囊對蝦(Penaeusjaponocus)的卵黃蛋白原mRNA水平上升[25]，Visudtiphole等檢測到去除單側眼柄后斑節(jié)對蝦卵黃發(fā)生期cyclinA基因表達水平下調而cyclinB基因表達水平沒有顯著變化[26]。Preechaphol等報道稱，去除單側眼柄促使斑節(jié)對蝦卵母細胞膜上孕酮胞膜受體組件1和孕酮胞內受體相關蛋白p23的表達水平上調[27]。本研究通過對比對照組，去單側眼柄組和去雙側眼柄組三疣梭子蟹cyclinH基因的表達量差異，發(fā)現在去眼柄后第四天去單側眼柄組和去雙側眼柄組cyclinH基因表達量顯著高于對照組，而去雙側眼柄組表達量顯著高于去單側眼柄組，此外，Cyclin H可以通過激活MPF來促進卵母細胞成熟分裂，這可以說明去眼柄誘導卵巢發(fā)育的分子機制中可能包含MPF對卵母細胞成熟分裂的促進作用。

4　結語

本研究成功克隆獲得了三疣梭子蟹cyclinH基因cDNA序列全長，分析了其在三疣梭子蟹不同組織及不同卵巢發(fā)育時期的表達差異，并通過分析去眼柄后三疣梭子蟹cyclinH基因的表達差異，證明了其參與了三疣梭子蟹卵巢發(fā)育調控，研究結果為進一步開展三疣梭子蟹卵母細胞成熟分裂的分子機制提供了理論依據。

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責任編輯高蓓

基金項目：? 國家自然科學基金項目(41576147;41306178)資助

收稿日期：2015-10-28；

修訂日期：2015-12-30

作者簡介：賈復龍(1989-)，男，碩士生，研究方向為海水養(yǎng)殖生物種質資源與工程育種。E-mail: 1360639373@qq.com ??通訊作者：E-mail: liuping@yshri.ac.cn

中圖法分類號：Q953.1；S917.4

文獻標志碼：A

文章編號：1672-5174(2016)07-062-08

DOI:10.16441/j.cnki.hdxb.20150365

Clong and Expression in the Ovarian Development ofCyclinHGene ofPortunustrituberculatus

JIA Fu-Long1,2,3, MENG Xian-Liang2,3, LIU Ping2,3,LI Jian2,3, GAO Bao-Quan2,3, GAO Tian-Xiang1, SONG Na1

(1.College of Fisheries. Ocean Unversity of China, Qingdao 266003, China; 2.The Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, P.R.China, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; 3.Function Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China)

Abstract:The swimming crab (Portunus trituberculatus) is the most important economic crbs in China and widely distributed in the coastal of China, Japan and Korea. At present, the problem of ovarian hypoplasis and brooding poor quality in process of the swimming crab aquaculture is widespread. And cell devision of gonads is very strong. Besides, Cyclin H is a key factor in cell cycle regulation activities. It controls multiple link of cell cycle through corresponding Cyclin dependent kinase (Cdks), then active Cdks through phosphorylate corresponding phosphorylation site. And the maturation or M-phase promoting factor was activated. In addition to these key roles in cell cycle progression, Cyclin H is a component of the general transcription factot TFIIH. So, the researching about cyclin H gene of the swimming crab is important to solve these problem. The cyclin H gene of the swimming crab was cloned using rapid amplification of its cDNA ends (RACE) based on the EST sequence. Then analysed the complete sequence using VecScreen、ContigExpress Project、EditSeq、BLAST、ExPASy、InterproScan、NetPhos and DNAman et, al. The sample ovary different stages and different tissue of the swimming crab were collected from Chang Yi, Shan Dong. And we analysed the expression of ovarian development of the swimming crab cyclin H gene using SYBR Premix Ex TaqTM. Then put it to the ABI7500 machine. After the completion of the reaction, we analysised the relative expression by the method of 2-ΔΔCt. The complete cDNA sequence of this gene is 1077bp in length, which contains an open reading frame (ORF) of 999bp, a 5’untranslated region(5’UTR) of 31bp and a 3’unteranslated region(3’UTR) of 46bp. The ORF encodes 332 amnio caid polypepteds. Molecular mass and the estimated isoelectric point (pI) of this protein are 38.89kDa and 6.20. Protein sequence contains a conservative domain structure named cyclin box. GenBank accession number is KT025877. Homology analysis revealed that the swimming crab cyclin H gene have high homology with other crustaceans. And the identities were 95% and 80% compared with Scylla paramamosain and Penaeus monodon. We found a threonine phosphorylation site (Thr12) from this gene by online prediction. Protein kinase Ck2 active Cyclin H through phosphorylate corresponding threonine phosphorylation site of Cyclin H. It needs further research for Ck2 recognition site in Cyclin H. The relative expression level of cyclin H gene analysised by quantitative Real-time PCR showed that the highest expression level of cyclin H gene was in ovary, especially in the first and second stage of ovary. The characteristics of high expression level of this gene in gonads consistent with its important role in cell division regulation. The activity of oogonium proliferation is vigorousness in the early ovarian development phase. These may suggest that cyclin H gene participate in the process of cell division in the activities of the ovarian development. After eyestalk ablation, the expression level of cyclin H in ovary was up-regulated significantly firstly, reached the peak on the fourth day, and then decreased. And we suggest that eyestalk ablation may promote the development of ovary. Also, this may be associated with MPF activated which cyclin H gene participated in (P<0.05). Our results suggested that Cyclin H might play important roles in ovarian development especially oogenesis of the swimming crab. And it would provide more usdful information for the research of gonadal development regulation in crustaceans.

Key words:Portunus trituberculatus; cyclin H; gene cloning; eyestalk ablation; gene expression； ovary

Supported by the National Natural Science Foundation of China (41576147;41306178)