一株紫菜腐霉的鑒定及其對條斑紫菜的致病性?

李淑芬， 莫照蘭， 孔凡娜， 朱　明， 茅云翔

(1.中國海洋大學海洋生命學院遺傳與育種實驗室，山東 青島 266003； 2.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室，山東 青島 266071； 3.江蘇連云港龍源生物科技有限公司，江蘇 連云港 222000)

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一株紫菜腐霉的鑒定及其對條斑紫菜的致病性?

李淑芬1， 莫照蘭2??， 孔凡娜1， 朱明3， 茅云翔1

(1.中國海洋大學海洋生命學院遺傳與育種實驗室，山東 青島 266003； 2.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室，山東 青島 266071； 3.江蘇連云港龍源生物科技有限公司，江蘇 連云港 222000)

摘要：NBRC33253為日本NITE生物資源中心的保藏菌株，分離自患赤腐病的紫菜。為鑒定其特征及致病性，對NBRC33253進行形態(tài)學觀察和分子鑒定，檢測溫度和鹽度對其生長的影響，并在不同溫度、鹽度、感染濃度下檢測NBRC33253對條斑紫菜的致病性。研究顯示：NBRC33253具有腐霉屬的典型特征：在半海水玉米粉固體培養(yǎng)基表面和培養(yǎng)基內(nèi)生長良好，菌絲發(fā)達、有橫隔，可形成絲狀孢子囊、球形藏卵器、凹形雄器。ITS序列分析證實其為紫菜腐霉(Pythrium porphyrae)。生長實驗發(fā)現(xiàn)，該菌在溫度16～36℃、鹽度10～40范圍內(nèi)生長良好，其最適生長溫度為28℃、最適生長鹽度為20。人工感染實驗顯示，該菌可引起條斑紫菜的赤腐病病征，在較高溫度(18～23℃)、較低鹽度(24～29)、較高病原濃度(0.1～1.0mg/mL)下最容易發(fā)生赤腐病。研究結果表明，NBRC33253可引起條斑紫菜腐霉病。本研究為進一步了解紫菜腐霉的致病機理和抗病紫菜品系的篩選提供了材料。

關鍵詞：紫菜腐霉；鑒定；條斑紫菜；致病性；赤腐病

引用格式：李淑芬， 莫照蘭， 孔凡娜, 等.一株紫菜腐霉的鑒定及其對條斑紫菜的致病性[J].中國海洋大學學報(自然科學版), 2016, 46(7): 27-34.

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中國紫菜養(yǎng)殖產(chǎn)量居世界第一位，2014年中國漁業(yè)年鑒資料顯示，2013年條斑紫菜(Pyropiayezoensis)和壇紫菜(Porphyrahaitanensis)產(chǎn)量11.23萬t(干品)，產(chǎn)值超過20億元人民幣。多年來紫菜病害時常發(fā)生，導致紫菜質(zhì)量下降甚至絕產(chǎn)，造成嚴重的經(jīng)濟損失。紫菜的絲狀體和葉狀體階段均有多種疾病發(fā)生，常見的紫菜絲狀體病害有泥紅病、綠變病、鯊皮病等[1]；葉狀體常見的病害有赤腐病、擬油壺病、綠斑病、縮曲癥、癌腫病等[2]。赤腐病是危害條斑紫菜養(yǎng)殖最嚴重一種疾病，該病最早于1947年在日本發(fā)現(xiàn)[3]，在1970年證實病原為紫菜腐霉(Pythiumporphyrae)[4]，之后在韓國、美國和中國相繼發(fā)現(xiàn)該病[5]。1996年在中國江蘇條斑紫菜養(yǎng)殖海區(qū)首次報道赤腐病[6]，最近在福建壇紫菜也發(fā)現(xiàn)了該病[7]。國內(nèi)學者對相關病原的侵染過程和發(fā)病條件進行了研究[6-8]，但目前尚無有效的方法預防赤腐病的發(fā)生。篩選抗病紫菜品系被認為是抵抗赤腐病的一種有效的方法。本實驗室正開展紫菜赤腐病流行病學調(diào)查，擬對不同地方來源的病原株開展生理、致病性、遺傳等方面的研究。NBRC33253為日本NITE生物資源中心的保藏菌株，分離自患赤腐病的紫菜，但其鑒定特征和致病性尚不明確。本研究對NBRC33253進行了形態(tài)和分子鑒定、生長特性及致病性研究，旨在為深入了解紫菜腐霉致病機理、制定疾病防治措施、培育抗病紫菜品系提供病原真菌研究材料。

1　材料和方法

1.1 藻株和菌株

條斑紫菜PY4-7株(來源于中國海洋大學海洋生命學院遺傳與育種實驗室)培養(yǎng)于PES[9]，培養(yǎng)條件為：溫度15℃，鹽度28～29，光照強度62.5μmol/(m2·s)，光暗周期12L∶12D，充氣培養(yǎng)，每3天換一次培養(yǎng)基，生長和形態(tài)無異常的紫菜用于后續(xù)實驗。NBRC33253(購自于日本生物資源庫)的固體培養(yǎng)用半海水玉米粉瓊脂培養(yǎng)基(CMM)[3]，22℃；液體培養(yǎng)用谷氨酸鈉液體培養(yǎng)基[8]，20℃ 100r/min搖床。

1.2 NBRC33253的形態(tài)觀察

NBRC33253在CMM培養(yǎng)10d后，用打孔器(口徑8mm)在菌落邊緣扣取1塊含有菌絲的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接至新的CMM進行培養(yǎng)，每天肉眼觀察NBRC33253的生長情況，并在光學顯微鏡(Olympus CX31,日本)下觀察菌絲的形態(tài)。

1.3 ITS序列擴增和系統(tǒng)發(fā)育學分析

收集NBRC33253菌絲用于基因組DNA提取[9]，作為模板用于PCR擴增ITS序列，按照文獻[11]提供的引物和方法進行PCR擴增。所得PCR產(chǎn)物送上海華大進行測序，測序結果在GenBank中進行BLAST同源性比對，從GenBank獲取其他相關菌的ITS序列。采用ClustalW軟件進行多序列比對，應用Mega5.3軟件采用鄰接法(Neighbor-joining)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，模型為Kimura 2-paramete，并以自展法(Bootstrap)進行各分支的置信度檢驗，共循環(huán)1000次[7]。

1.4 溫度和鹽度對NBRC33253生長的影響

NBRC33253在CMM固體培養(yǎng)基上生長5d后，收集菌絲體用滅菌海水沖洗3次，用滅菌吸水紙吸干后稱濕重，將1mg的菌絲轉(zhuǎn)接到200mL谷氨酸鈉液體培養(yǎng)基(pH=7.5)。進行溫度實驗時，設置溫度范圍為4～36℃，鹽度為18；進行鹽度實驗時，設置鹽度范圍為5～50，培養(yǎng)溫度為20℃。每個實驗組設置3個平行。培養(yǎng)7d后收集菌絲，測量每個實驗組的菌絲體重量。用SPSS16.0對各溫度水平間和各鹽度水平間進行顯著性差異分析，兩水平間的P<0.05為顯著性差異。

1.5 人工感染實驗及組織病理觀察

NBRC33253在谷氨酸鈉液體培養(yǎng)基(pH=7.5)培養(yǎng)7d，收集菌絲稱重置于裝有200mL滅菌海水的錐形瓶中，制成終濃度為1.0mg/mL的菌絲體懸液。在每個含有菌絲體懸液的錐形瓶中放入5張健康條斑紫菜成體，每張長度10～12cm、寬度3～4cm；設置無添加菌絲的實驗組為對照組。每組實驗設置3個重復。所有實驗組置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度15℃，每天肉眼觀察紫菜發(fā)病情況，切取患病部位葉片進行常規(guī)制片，在光學顯微鏡下進行組織病理觀察，同時取患病葉片進行病原的分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、ITS序列分析，以驗證分離菌株是否為NBRC33253。

1.6 環(huán)境因子對感染效果的影響

在實驗室條件下研究不同溫度、鹽度、感染濃度(NBRC33253菌絲重量)對感染程度的影響，實驗體系同1.5，溫度設8、13、18和23℃，鹽度設24、29、34和39，感染濃度為1.0、0.5、0.1和0.01mg/L。進行不同溫度實驗時，設置鹽度為28，腐霉?jié)舛葹?.5mg/mL；進行不同鹽度實驗時，設置溫度為15℃，腐霉?jié)舛葹?.5mg/mL；進行不同濃度實驗時，設置溫度為15℃，鹽度為28。每個處理組均設置不加腐霉菌絲的實驗組為對照，各個處理組和對照組設置3個平行。實驗期間，每天觀察紫菜發(fā)病情況，以肉眼可觀察到紅色斑點為疾病發(fā)生時間，一周后用葉面積儀(Yaxin-124，北京雅欣儀科有限公司)計算紫菜頁片病斑面積占總紫菜葉片面積的百分比。

2　結果

2.1 NBRC33253的生長及形態(tài)特征

NBRC33253在CMM固體培養(yǎng)基上表現(xiàn)為菌絲衍生到培養(yǎng)基內(nèi)生長，在整個培養(yǎng)期內(nèi)呈乳白色。培養(yǎng)前期的菌落形狀平滑，培養(yǎng)至5d左右，有的菌落出現(xiàn)放射型或兼平滑型和放射型(見圖1A，平滑型)；培養(yǎng)至10d左右，菌落在培養(yǎng)基內(nèi)布滿整個培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基表面有數(shù)量極少的隆起的菌絲。

在顯微鏡下觀察，菌絲在培養(yǎng)基表面無特定形態(tài)，分枝發(fā)達。培養(yǎng)前期的菌絲無色、無隔，培養(yǎng)7d左右菌絲出現(xiàn)橫隔有隔并呈淡黃色(見圖1B)。無性生殖期間，可觀察到在菌絲體的頂端或中間產(chǎn)生長筒狀的游動孢子囊(見圖1C)，孢子囊伸長形成排孢管，頂端膨大成近球形的泡囊，孢子囊原生質(zhì)進入包囊內(nèi)形成多個游動孢子，泡囊破裂后釋放出游動孢子。有性生殖期間，有些菌絲中間或頂端出現(xiàn)球形的藏卵器，內(nèi)有球形的卵孢子(見圖1D)，有些菌絲一端產(chǎn)生凹形的雄器呈，扣在藏卵器一側(cè)(見圖1E)。

2.2 NBRC33253的ITS系統(tǒng)發(fā)育學分析

NBRC33253的ITS序列全長為870bp，BLAST結果顯示該序列與紫菜腐霉P.porphyrae的相似度為99%～100%，在系統(tǒng)發(fā)育樹與紫菜腐霉聚為一支，自舉值為99%(見圖2)。這個結果表明NBRC33253為紫菜腐霉。

2.3人工感染實驗及組織病理的觀察

以濃度為1.0mg/mL的紫菜腐霉菌絲體感染紫菜，2天后可肉眼觀察到藻體不定位置出現(xiàn)銹紅色斑點；隨時間延長，病斑逐漸增大，由針尖大小增加至直徑2cm以上，顏色逐漸變?yōu)辄S褐色或淡黃色(見圖3B)，邊緣稍帶紅色；隨著病程發(fā)展，大小不同的病斑連接成片形成腐爛的孔洞，葉片呈現(xiàn)綠色(見圖3C)，最后導致腐爛組織流失，出現(xiàn)病癥到紫菜葉片腐爛流失的時間為5～7d。實驗期間，對照組藻體沒有出現(xiàn)上述病變(見圖3A)。

(A 菌落形態(tài)Colony morphology；B 菌絲Hyphae；C 游動孢子囊，示泡囊(箭頭1)和排孢管(箭頭2)Zoosporangium, presenting hyphae swelling (arrow 1) and spore excretion tube ( arrow 2)；D 卵孢子(箭頭)Oospores (arrow)；E 藏卵器(箭頭1)和雄器(箭頭2)Archegonium (arrow 1) and antheridium (arrow 2).)

圖1光學顯微鏡觀察NBRC33253形態(tài)

Fig.1Morphology of NBRC33253 observed under light microscopy

圖2　基于ITS基因序列構建的N-J系統(tǒng)進化樹

(A對照組紫菜The controlP.yezoensisthalli without infection ofP.porphyrae;B感染腐霉后的紫菜，葉片呈黃褐色TheP.yezoensisthalli infected withP.porphyrae, presenting yellow color；C感染腐霉后的紫菜，葉片呈黃綠色TheP.yezoensisthalli infected withP.porphyrae, presenting green color.)

圖3感染紫菜腐霉后發(fā)生赤腐病的條斑紫菜

Fig.3Red rot symptom ofP.yoenzosisinfected withP.porphyrae

在低倍鏡下，發(fā)現(xiàn)紫菜病斑區(qū)細胞收縮、顏色變淡，與周圍正常細胞有明顯的區(qū)別(見圖4C)。高倍鏡下，病斑處的紫菜細胞被菌絲體貫穿，萎縮均質(zhì)化(見圖4D)，在一些被菌絲體穿透的細胞發(fā)現(xiàn)有桃紅色藻紅素流出(見圖4E)；在病灶處還發(fā)現(xiàn)了孢子囊和藏卵器(見圖4F)。對照組紫菜細胞沒有發(fā)現(xiàn)病理變化(見圖4A、4B)。從患病葉片分離到形態(tài)一致的純菌落，隨機挑取部分菌落進行顯微觀察和ITS序列分析，顯示它們的顯微特征和ITS序列與NBRC33253一致。上述結果表明NBRC33253可以感染條斑紫菜引起赤腐病。

2.4 溫度和鹽度對紫菜腐霉生長的影響

表1數(shù)據(jù)顯示，紫菜腐霉菌絲體在16～36℃的溫度范圍內(nèi)生長良好，較高溫度適合菌絲體生長,溫度為28℃時，菌絲體的生長量最重。各溫度組間的菌絲體重量均呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，表明溫度對NBRC33253菌絲體的生長有著重要的作用。

紫菜腐霉在10～40的鹽度內(nèi)生長良好，較低鹽度適合菌絲的生長，鹽度為20時，菌絲體重量最大。各鹽度間的菌絲體重量均呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，表明鹽度對紫菜腐霉菌絲體的生長有著重要的作用(見表2)。

(A對照紫菜(放大10倍)The controlP.yezoensisthalli without infection ofP.porphyrae(10 times magnification)；B 對照紫菜(放大100倍) The controlP.yezoensisthalli without infection ofP.porphyrae(100 times magnification)；C 紫菜病斑區(qū)顏色變淡(放大10倍)The diseased spot ofP.yezoensisbecame lighter in color(10 times magnification)；D紫菜細胞收縮，被菌絲體貫穿(箭頭處)(放大100倍) The infected algae cells became shrank and penetrated by fugal hyphae(100 times magnification); E 藻紅色素流出(箭頭處)(放大100倍) The phycoerythrobilin(arrow) discharged from the infected algae cells(100 times magnification); F 紫菜病斑區(qū)發(fā)現(xiàn)紫菜腐霉的藏卵器(箭頭1)和雄器(箭頭2)(放大100倍) The archegonium (arrow 1) and the antheridium (arrow 2) ofP.porphyraewere observed at the infected region ofP.yezoensis(100 times magnification).)

圖4　紫菜腐霉感染條斑紫菜葉狀體的組織病理變化

Note: ①Temperature; ②Hyphae weight; ③Daily growth weight

表2　鹽度對紫菜腐霉菌生長的影響

Note: ①Salinity; ②Hyphae weight; ③Daily growth weight

2.5 環(huán)境因子對紫菜腐霉感染效果的影響

在不同的養(yǎng)殖溫度下，18℃組最早(1天)出現(xiàn)針尖大小的紅色斑點，其次分別為23℃組(2天)和13℃組(4天)，而8℃組在實驗期間(7天)沒有觀察到病癥出現(xiàn)(見表3)。隨著病程發(fā)展，溫度愈高，病斑出現(xiàn)面積愈大，在第7天時，病斑面積分別為98.7%(23℃)、87.7%(18℃)、12.0%(13℃)，各實驗組之間均有顯著性的差異(P<0.01)(見圖5A)。因此，較高溫度(18～23℃)容易發(fā)生赤腐病。

如表3所示，鹽度愈低，出現(xiàn)病癥的時間愈早，各鹽度條件下出現(xiàn)病癥的時間分別:24鹽度組1天、29鹽度組2天、34鹽度組4天、39鹽度組5天。隨著病程發(fā)展，鹽度愈低，病斑出現(xiàn)面積愈大，在第7天時，病斑面積分別為100%(24鹽度組)、80.3%(29鹽度組)、25.2%(34鹽度組)、11.6%(39鹽度組),各實驗組之間均有顯著性差異(P<0.01)(見圖5B)。因此，低鹽度(24～29)條件容易發(fā)生赤腐病。

如表3所示，腐霉感染濃度愈高，出現(xiàn)病癥時間愈早，各感染濃度條件下出現(xiàn)病癥的時間分別為1.0mg/mL組(2天)、0.5mg/mL組(3天)、0.1mg/mL組(3天)、0.01mg/mL組(4天)。隨著病程發(fā)展，感染濃度愈高，病斑出現(xiàn)面積愈大，在第7天時，病斑面積分別為100%(1.0mg/mL組)、94.3%(0.5mg/mL組)、87.3%(0.1mg/mL組)、12.9%(0.01mg/mL組),各實驗組之間均有顯著性差異(P<0.01)(見圖5C)。因此，水體中存在較高濃度的腐霉(0.1～1.0mg/mL)容易發(fā)生赤腐病。

表3　腐霉感染條斑紫菜后出現(xiàn)病癥時間

Note:①Temperature; ②Time of occurrence of disease; ③Salinity;④Infection dose

圖5　不同養(yǎng)殖條件下條斑紫菜發(fā)生赤腐病病斑的面積

3　討論

腐霉菌在全世界分布，多數(shù)在土壤和水生環(huán)境中營腐生生活，有超過80種為陸地植物病原，引起各種植物根腐和幼苗猝倒，一些還可引起人和動物疾病[11-13]。日本、韓國、美國和中國的學者相繼報道紫菜腐霉可引起養(yǎng)殖和野生紫菜赤腐病[3-4,6-8,14-17]。Park等發(fā)現(xiàn)從日本和韓國不同地區(qū)患病紫菜分離的紫菜腐霉存在形態(tài)和生理特征的差別[18]，這些差別說明不同地理腐霉菌株可能存在遺傳和致病性的差異。中國學者分別從壇紫菜和條斑紫菜中分離到紫菜腐霉株[6,7]，它們與其他地區(qū)分離得到的菌株是否存在遺傳和致病性的差異，目前尚未有這方面的研究報道。本實驗室在開展紫菜赤腐病病原分離、鑒定等流行病學調(diào)查的同時，對日本患赤腐病紫菜的一株分離菌株進行鑒定和致病性的檢測，旨在進一步比較研究不同來源紫菜腐霉菌株的遺傳、表型特征和鑒別特征，為研究腐霉致病機理、建立外來病風險評估以及疾病防控措施提供依據(jù)。本實驗室研究人員嚴格遵守國家進境動物源性生物材料及制品檢驗檢疫管理規(guī)定、《病原微生物實驗室生物安全管理條例》和《獸醫(yī)實驗室生物安全管理規(guī)范》，保證實驗過程安全使用和存放該菌株，嚴禁進行海上實驗。

多數(shù)腐霉菌的形態(tài)特征不穩(wěn)定，難于用來區(qū)分形態(tài)特征和生物學特征相近但親緣關系較遠的種?；诤颂求wDNA轉(zhuǎn)錄內(nèi)間隔區(qū)ITS序列的分子特征成為腐霉菌分類和鑒別的重要手段。本研究首先觀察了NBRC33253的形態(tài)特征。結果顯示該菌具有腐霉屬的基本特征，產(chǎn)生絲狀孢子囊、球形藏卵器、凹形雄器，這些結果與文茜等從條斑紫菜分離得到紫菜腐霉的特征一致[14]。該菌的ITS序列分析結果顯示它與其他紫菜腐霉菌的親緣關系最近。感染實驗結果表明紫菜腐霉可以引起條斑紫菜赤腐病，病斑處細胞被菌絲穿透，導致細胞色素等內(nèi)容物流出而導致紫菜細胞的死亡，最終引起紫菜組織潰爛，這些癥狀與丁懷宇等的描述一致[8]。

根據(jù)文獻報道，每年的11月中旬到12月下旬，以及2—3月期間，當海水溫度連續(xù)幾天超過18℃，是赤腐病易發(fā)期。紫菜養(yǎng)殖海區(qū)的鹽度一般在25～33，如果連續(xù)降雨引起海水鹽度下降，也會增加赤腐病發(fā)生的機會[6]。本研究觀測了溫度、鹽度、腐霉?jié)舛葘Τ喔“l(fā)生效果的影響，結果顯示較低鹽度(24～29)、較高水溫(18～23℃)、較高腐霉?jié)舛?0.5～1.0mg/mL)有利于赤腐病發(fā)生。條斑紫菜可在0.5～20℃生長，最適合生長溫度為16～18℃[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，在23℃培養(yǎng)的條斑紫菜葉狀體生長緩慢，培養(yǎng)8天時葉片皺縮、加厚、表面不平整，培養(yǎng)30天時葉片死亡變白腐爛[21]。本研究觀測到在23℃進行感染，感染濃度較高的紫菜藻體在7天內(nèi)發(fā)生90%以上的病爛，其原因可能是高溫和病原感染兩者綜合作用的結果。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，腐霉在較高溫度(16～36℃)、較低鹽度(10～40)條件下生長良好。因此，當紫菜養(yǎng)殖海區(qū)溫度在16～20℃、鹽度低于25時，適合紫菜腐霉生長，養(yǎng)殖區(qū)腐霉數(shù)量增加，是發(fā)生赤腐病的根本原因。在此期間，減少紫菜栽培筏架設置密度以增加水體交換，可以稀釋病原數(shù)量和提高水體鹽度，對降低病原感染有幫助。

目前主要通過加強養(yǎng)殖過程中管理和調(diào)控環(huán)境因子來減輕紫菜病害的發(fā)生，篩選和培育抗病紫菜品系也是一種應對病害的有效途徑，是本實驗室著力發(fā)展的方向。本研究結果為進一步研究紫菜腐霉與宿主的相互作用提供了基礎,有利于抗病紫菜品系的篩選和培育。

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責任編輯朱寶象

基金項目：? 國家高技術研究發(fā)展計劃項目(2012AA10A406, 2012AA10A401, 2012AA100815)；國家自然科學基金項目(31372517)；山東省自主創(chuàng)新項目(2013CXC80202)資助

收稿日期：2015-04-09；

修訂日期：2015-12-25

作者簡介：李淑芬(1987-)，女，碩士生。E-mail: lishufen888@126.com ??通訊作者：E-mail：mozl@ysfri.ac.cn

中圖法分類號：Q939.95

文獻標志碼：A

文章編號：1672-5174(2016)07-027-08

DOI:10.16441/j.cnki.hdxb.20150121

Identification of aPythriumporphyraeStrain Causing the Red Rot Disease ofPorphyrayezoensis

LI Shu-Fen1, MO Zhao-Lan2, KONG Fan-Na1, ZHU Ming3, MAO Yun-Xiang1

(1.Laboratory of Marine Genetics and Breeding, College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2.Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 3.Longyuan Biotchnology Copmany Ltd., Lianyungang 222000, China)

Abstract：Pyropia is an economically important cultured species in East Asia. Farmed Pyropia is easy to be infected by various pathogens. It is necessary to get a comprehensive understanding of the pathogenecity mechanism of pathogens for diseases prevention. Pythrium porphyrae is a fungus that is able to cause the red rot disease of Porphyra. A strain NBRC33253 was isolated from farmed Porphyra and deposited in NITE Biological Resource Center in Japan, but its taxonomic status and the pathogenecity are not avai-lable. To get a better understanding of the physiology and pathogenecity of NBRC33253, we performed this study to identify the fungal strain with combined methods of morphology and molecular biology, to exam its growth under different culture conditions (temperature and salinity), and finally to determine its pathogenecity on P. yezoensis by artificial infection experiments. The result of morphological examination showed that the NBRC33253 grew well on CMS medium, producing transverse mycelia, zoosporangium, archegonium and antheridium, which are the typical characteristics of genus Pythium. Phylogenetic analysis based on the internal transcribed spacer (ITS) region revealed that the NBRC33253 was clustered with Pythrium porphyrae, being 99% ITS sequence similar with those of Pythrium porphyrae strains deposited in GenBank. Consequently, NBRC33253 was identified as Pythrium porphyrae. The result of growth experiment showed that the NBRC33253 grew well at temperatures ranging from 16 to 36℃ and salinities ranging from 10 to 40 with the optimum growth temperature of 28℃ and the optimum growth salinity of 20. In artificial infection experiments on P. yezoensis blade, NBRC33253 was able to cause small (<0.5mm in diameter), round, red lesion on the thalli at 48 h post infection, which gradually developed into irregular light yellow lesions (>20 mm) surrounded by a pink margin and finally caused necrosis of entire thallus in 5～7 days post infection. Histopathological examination of the infected laver showed that the NBRC33253 mycelia were able to invaded the thalli tissue, causing the laver cells collapsed and died. Further studies found that P. yezoensis was prone to ret rot disease after infection with NBRC33253 at higher temperature (18～23℃), lower salinities (24～29) and higher concentration of fungi (0.1～1.0mg/mL). These findings will provide a fungal material for further comparative study on the genetic and pathogenesis of P. pythrim from various origins, which will help to prevent the red rot disease of P. yezoensis.

Key words:Pythrium porphyrae; identification; Pyropia yezoensis; pathogenecity; red rot disease

Supported by National High Technology Research and Development Program (2012AA10A406, 2012AA10A401, 2012AA100815); National Natural Sciences Foundation of China (31372517); Special Independent Innovation of Shandong Province (2013CXC80202)